Sommario
La proteina EYQ1 `e una proteina fluorescente fotocromica della famiglia delle YFP (proteine gialle fluorescenti) derivata per mutazioni a partire dalla GFP (green fluorescent protein) di Aequorea victoria. Le propriet`a fotocromiche si esplicano nello spegnimento (bleaching) della fluorescenza per irradiazione a 515 nm e nella sua riattivazione per rapida irradiazione a 405 nm. Entrambi i processi sono reversibili e ripetibili un numero elevato di volte. Le proteine fluo- rescenti fotoattivabili (PAFP) o fotocromiche (RSFP) come la EYQ1 possono essere utilizzate in tecniche avanzate di microscopia di fluorescenza su campioni biologici, essendo in grado di evidenziare con la loro attivazione aree ristrette e controllabili del campione. In questo modo sono rese pi`u semplici, ad esempio, l’osservazione dell’evoluzione temporale di strutture cellulari o della diffusione di proteine a cui sono fuse le PAFP.
Le propriet`a fotocromiche in condizioni di eccitazione a singolo fotone sono gi`a state studiate. Nel presente lavoro di tesi sono presentati i risultati dell’analisi delle stesse propriet`a in condizioni di eccitazione a due fotoni. Le tecniche di eccitazione a due fotoni presentano infatti il vantaggio di produrre un maggiore confinamento tridimensionale dell’attivazione.
Sono innanzitutto stati determinati gli spettri di eccitazione a due fotoni di EYQ1 in soluzioni acquose (nelle due forme in cui il cromoforo `e anionico o neutro, rispettivamente). Successivamente, in esperimenti con la proteina immobilizzata in gel di poliacrilammide, `e stata determinata la forma della banda di eccitazione a due fotoni da cui ha origine la riattivazione. La stabilit`a della proteina in sequenze di cicli ripetuti di spegnimento a singolo fotone e riattivazione a due fotoni, `e stata valutata in esperimenti in gel e confrontata con i risultati di precedenti misure a singolo fotone. `E stato inoltre valutato lo spessore verticale del volume riattivato a due fotoni in funzione del tempo totale di irradiazione.
Gli ordini di grandezza delle rese quantiche di bleaching reversibile e irre- versibile a due fotoni sono stati stimati a partire da misure del decadimento di fluorescenza durante l’irradiazione della proteina immobilizzata su strati sottili di polivinil alcool (PVA). Infine, sono stati effettuati esperimenti di riattivazione a due fotoni su cellule vive e fissate.
Dai risultati `e emerso che il fotocromismo di EYQ1 `e conservato anche in con- dizioni di eccitazione a due fotoni. Effettuando i cicli di spegnimento (a singolo fotone) e riattivazione (a due fotoni) a basse potenze, il comportamento di EYQ1
`e risultato paragonabile rispetto al comportamento a singolo fotone. Effettuando bleaching e riattivazione pi`u rapidamente e con potenze di irradiazione maggio- ri, la stabilit`a della proteina diminuisce, ma `e sempre possibile effettuare un discreto numero di cicli. `E stato notato che la potenza di irradiazione in fase di bleaching (a singolo fotone) influisce maggiormente sulla stabilit`a della proteina di quanto non faccia la potenza di irradiazione in fase di riattivazione (a due fotoni). Le osservazioni in vitro non sono state smentite dalle prove in vivo. `E stato infine osservato che la localizzazione verticale della riattivazione `e molto buona.
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