INDICE
Riassunto……….. I Abstract………..…….. III
1 INTRODUZIONE……….………….. 1
1.1 Transgenesi……….. 1
1.1.1 Aspetti generali……… 1
1.1.2 Transgenesi convenzionale nel topo……… 2
1.1.3 Transgenesi condizionale………. 4
1.2 I sistemi Cre/loxP e Flp/FRT……… 7
1.2.1 Aspetti generali……….... 7
1.2.2 Applicazioni………. 9
1.3 “Knock-out” convenzionale e “knock-out” condizionale……… 11
1.3.1 Generazione di un “knock-out” convenzionale……… 11
1.3.2 Applicazioni………. 12
1.3.3 “Knock-out” condizionale……… 13
1.4 I cromosomi artificiali: BACs, PACs e YACs……… 14
1.5 Ricombinazione omologa in ceppi di E.coli……… 15
1.6 Il sistema serotoninergico………. 17
1.7 Scopo della tesi………... 18
2 MATERIALI E METODI……….. 20
2.1 Trasformazione di cellule di E.coli ed amplificazione del DNA plasmidico………. 20
2.1.1 Trasformazione……….. 20
2.1.2 Estrazione di DNA plasmidico su piccola scala mediante lisi alcalina e cromatografia a scambio ionico……… 22
2.1.3 Estrazione di DNA plasmidico su scala media mediante lisi alcalina e cromatografia a scambio ionico……… 24
2.1.4 Estrazione di DNA plasmidico con il metodo “ONE STEP” “miniprep”………. 26
2.1.5 Estrazione di DNA da cloni BAC metodo “miniprep” 26
2.1.6 Estrazione di DNA BAC su scala media mediante lisi
alcalina e cromatografia a scambio ionico……… 28
2.2 Elettroforesi su gel di agarosio……….. 31
2.3 Clonaggio in vettori plasmidici……….. 32
2.3.1 Clonaggio in un vettore plasmidico mediante l’uso di enzimi di restrizione………. 32
2.3.2 Clonaggio di prodotti di PCR in T-vettori……… 34
2.4 Purificazione del DNA……….. 35
2.4.1 Estrazione fenolica………. 35
2.4.2 Estrazione di DNA da gel di agarosio mediante MINELUTE GEL EXTRACTION KIT QIAGEN………. 35
2.5 “Annealing” di due oligo complementari………... 36
2.6 “Overlapping PCR”……… 36
2.7 Analisi mediante ibridazione con sonda radioattiva……… 37
2.7.1 “Southern blot”……… 37
2.7.2 “Colony lifting”……….. 40
2.8 Modificazione di un BAC per ricombinazione omologa nel ceppo DY380 di E.coli……… 40
3 RISULTATI………. 42
3.1 Ricerca in banca dati del clone genomico Pet1 in BAC………… 42
3.2 Preparazione di un costrutto a DNA per la ricombinazione omologa nel BAC_rp23_165D11……… 43
3.2.1 Ripristino del sito FRT………. 43
3.2.2 Amplificazione e generazione del frammento Pet1LA/Cre………. 44
3.2.3 Clonaggio nel vettore intermedio pGEM-T e subclonaggio in pSVKeoFRT……… 47
3.2.4 Amplificazione del frammento Pet1RA, clonaggio in pGEM-T e subclonaggio in Pet1LA/CrepSVKeoFRT……… 53
3.3 Inserzione di cre nel clone genomico Pet1 mediante ricombinazione omologa in E.coli……… 58
4 DISCUSSIONE……… 63
4.1 Uso della tecnica dell’”overlapping PCR”………... 63
4.2 Preparazione del costrutto a DNA………. 63 4.3 Selezione dei cloni ricombinanti mediante crescita su terreno
contenente kanamicina……… 64 4.4 Implicazione dell’uso della ricombinazione omologa in E.coli……. 65
5 CONCLUSIONI……… 66
6 PROSPETTIVE FUTURE………. 67
Riferimenti bibliografici
Ringraziamenti
