5.PARTE SPERIMENTALE

(1)

Parte sperimentale

5.PARTE SPERIMENTALE

Procedure generali. Tutte le soluzioni organiche sono state essiccate su

MgSO4 prima di venire evaporate tramite rotavapor ad una temperatura del

bagnomaria non superiore ai 40°C e a una pressione intorno a 25 Torr.

L’andamento delle reazioni è stato seguito tramite TLC analitica su fogli di gel di silice Alugram SIL G/UV254 (Macherey-Nagel) ed evidenziato con una soluzione di p-anisaldeide. Le miscele eluenti utilizzate per i controlli di reazione mediante TLC sono di tre tipi: 1) CH2Cl2/acetone/AcOH 9.5/0.5/0.3, 2)

CH2Cl2/MeOH/NEt3 10/0.5/0.1 e 3) CH2Cl2/AcOEt/AcOH 8/2/0.2

La cinetica delle reazioni e la purezza dei composti (area%) sono state seguite mediante HPLC con strumento Merck Lachrom e colonna Lichrospher 100 RP 18 e 5 µm, 250*4.0 mm. La fase mobile è costituita dalla miscela della FASE A: TFA 0.1% e FASE B: TFA 0.1% in CH3CN, con eluizione in gradiente lineare. Di

seguito vengono riportate le condizioni HPLC.

Condizioni HPLC (metodo 1):

Colonna Lichrospher 100 RP 18 e 5 µm (250*4.0 mm)

Velocità di flusso 1 ml/min

Rivelatore UV λ=220 nm

Volume iniettato 20 µl

Temperatura colonna 27° C

Tempo di analisi 30 min

Gradiente:

Tempo A% B% 0 60 40 20 10 90 23 10 90 26 60 40 30 60 40 Concentrazione campione 0.5 mg/ml in H2O/CH3CN 6/4

(2)

Parte sperimentale Per determinare l’eccesso enantiomerico (ee) dell’amminoacido protetto TFA-Asp(OBn)-OH (3.25) è stato utilizzato un metodo HPLC chirale con strumento Agilent 1100 e colonna Chirobiotic T 5 µm, 250*4.6 mm. La fase mobile è costituita dalla miscela della FASE A: trietil ammonio acetato 0.1% (TEAA) pH = 4 con CH3CN.

Condizioni HPLC (metodo 2):

La purezza diastereoisomerica del dipeptide 3.17 è stata determinata mediante HPLC con strumento Agilent 1100 e colonna Discovery Zr-Carbon 3.5 µm, 150*4.6 mm. La fase mobile è costituita da una miscela di H3PO4 0.1% con

CH3CN.

Condizioni HPLC (matodo 3):

Colonna Chirobiotic T 5 µm (250*4.6 mm)

Velocità di flusso 1 ml/min

Volume iniettato 20 µl

Fase mobile TEEA 0.1%, pH=4/CH3CN 8/2

Concentrazione campione 0.8 mg/ml in fase mobile

Colonna Discovery Zr-Carbon 3.5 µm (150*4.6 mm)

Velocità di flusso 1.5 ml/min

Volume iniettato 20 µl

Fase mobile H3PO4 0.1%/CH3CN 15/85

(3)

Strumenti. Gli spettri 1H NMR e 13C NMR sono stati registrati in soluzione di CDCl3 o DMSO facendo uso di uno strumento Brucker Advance 250 (62.5

MHz) con completo disaccoppiamento del protone. Per l’analisi 1H NMR è stato inoltre utilizzato uno strumento Brucker AVANCE III 400 (400 MHz). I chemical shift sono espressi in ppm (δ) usando Me4Si come standard interno. I dati sono

stati presentati come segue: chemical shift, molteplicità (s=singoletto, bs=broad singolet, d=doppietto, t=tripletto, q=quartetto, m=multipletto e/o risonanze multiple), integrazione, costante di accoppiamento in Hertz (Hz).

Materiali. L’acido acetico glaciale, l’acetone (grado HPLC), il MeOH anidro,

la NEt3, il fenolo, l’anidride trifluoroacetica, l’acido trifluoroacetico, la DMF sono

prodotti Aldrich e sono stati utilizzati senza ulteriore purificazione. L’etil trifluoroacetato è un prodotto Acros, la dicicloesilcarbodiimmide (DCC), N-idrossisuccinimmide (HOSu), gli amminocidi Boc-Dap(Z)-OH (3.18), H-Leu-OMe · HCl (3.5), Boc-Phe-OSu (3.22), H-Asp-(OBn)-OH (3.24), H-DAsp(OBn)-OH (ent.3.24) e H-Trp-H-DAsp(OBn)-OH (3.27) sono prodotti Bachem e sono stati impiegati senza ulteriore purificazione.

5.1 Sintesi del tripeptide H-Phe-Dap(Z)-Leu-OMe (3.16)

5.1.a Sintesi dell’estere attivo Boc-Dap(Z)-OSu (3.19)

OH O N H Boc NH Z OSu O N H Boc NH Z Boc-Dap(Z)-OH (3.18) Boc-Dap(Z)-OSu (3.19)

Ad una soluzione dell’amminoacido 3.18 [Boc-Dap(Z)-OH] (5.0 g, 14.78 mmoli) in CH2Cl2 (50 mL), si aggiunge l’HO-Su (1.78 g, 15.52 mmoli) e la

sospensione è raffreddata a 0°C. A questa temperatura, nell’arco di dieci minuti, viene aggiunta, in tre porzioni la DCC (3.20 g, 15.52 mmoli). La temperatura è mantenuta a 0° Cper 40 minuti e poi è lasciata salire spontaneamente a 20-25°C.

(4)

Parte sperimentale Dopo aver lasciato la miscela di reazione in agitazione per 1 h e 20 minuti il controllo HPLC (metodo 1) mostra che il precursore Boc-Dap(Z)-OH 3.18 ha reagito per l’80%. Quindi, la miscela viene raffreddata a 0°C e a questa temperatura vengono aggiunti altri 0.2 eq di DCC (0.640 g, 3.1 mmoli), nell’arco di 10 minuti, in tre porzioni, mantenendo la temperatura del bagno a 0°C. La temperatura è mantenuta a 0°C per 40 minuti e poi è lasciata salire spontaneamente a 20-25°C.

Dopo 40 minuti viene effettuato un controllo HPLC che mostra che la reazione è terminata. Quindi si filtra la DCU sottovuoto e la soluzione di CH2Cl2

viene evaporata ottenendo un grezzo di reazione costituito dall’estere attivo 3.19 (6.24 g, resa 97%).

Rf = 0.47 (CH2Cl2/acetone/AcOH 9.5/0.5/0.3); tR = 10.217 min.; Purezza HPLC = 90% (metodo 1).

1

H NMR (400 MHz, DMSO) δ 1.55 (s, 9H), 2.78-2.93 (m, 4H), 3.63-3.69 (m, 1H), 3.85-3.91(m, 1H), 4.47-4.75 (m, 1H), 5.07 (d, 1H J = 12.2 Hz), 5.17 (d, 1H, J = 12.2 Hz), 5.73-5.83 (m, 2H), 7.34-7.35 (m, 5H).

5.1.b Sintesi del dipeptide Boc-Dap(Z)-Leu-OMe (3.20)

NH Z O OSu HN Boc ₊ HCl HN Boc HN O OMe NH Z O H-Leu-OMe HCl (3.5) Boc-Dap(Z)-OSu (3.19) Boc-Dap(Z)-Leu-OMe (3.20) H2N O OMe

Ad una soluzione dell’estere attivo 3.19 (5.74 g, 13.18 mmoli) in CH2Cl2 (50

mL) si aggiunge l’amminoacido 3.5 [H-Leu-OMe · HCl] (2.63 g, 14.45 mmoli) e di seguito l’ N-metilmorfolina (1.7 mL 15.81 mmoli). Dopo 1 h e 45 minuti il controllo HPLC (metodo 1) mostra la presenza del dipeptide 3.20 e la scomparsa dei precursori. Quindi la miscela di reazione viene lavata con una soluzione di NaHSO4 al 5% (60 mL x 2 volte) ed infine con una soluzione satura di NaCl (60

mL x 2 volte). La fase organica viene evaporata, ottenendo un solido bianco che al controllo HPLC mostra la presenza del dipeptide 3.20 e la presenza di HOSu.

(5)

Parte sperimentale Quindi, il solido viene sciolto in 60 mL di CH2Cl2 e la soluzione organica viene

lavata con NaOH 0.5 M (60 mL x 2 volte) e con una soluzione satura di NaCl (60 mL x 2 volte). La fase organica viene evaporata per dare il dipeptide 3.20 come prodotto solido (4.83 g, resa 75%).

Rf = 0.56 (CH2Cl2/acetone/AcOH 9.5/0.5/0.3); tR = 13.150 min.; Purezza HPLC = 79% (metodo 1). 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.92 (d, 3H, J = 6.0 Hz), 0.93 (d, 3H, J = 6.0 Hz), 1.45 (s, 9H), 1.56-1.66 (m, 3H), 3.54-3.60 (m, 2H), 3.72 (s, 3H), 4.22-4.33 (m, 1H), 4.50-4.62 (m, 1H), 5.09 (d, 1H, J = 12.4 Hz), 5.15 (d, 1H, J = 12.4), 7.29-7.39 (m, 5H).

5.1.c Sintesi del dipeptide deprotetto H-Dap(Z)-Leu-OMe (3.21)

OMe N H O O NH Z H2N H-Dap(Z)-Leu-(OMe) (3.21) OMe N H O O NH Z HN Boc Boc-Dap(Z)-Leu-OMe (3.20)

Il dipeptide 3.20 (4.63 g 9.95 mmoli) viene disciolto in una miscela di CH2Cl2

(46 mL) e TFA (7.7 mL) preparata a parte e si mantiene la miscela in agitazione. Dopo 40 minuti il conrollo HPLC (metodo 1) mostra che il precursore ha reagito per il 50% e che si è formato il dipeptide deprotetto 3.21. La miscela viene mantenuta in agitazione e dopo 2 h dall’inizio della reazione si effettua un secondo controllo HPLC che indica che il precursore ha reagito per il 90%. Quindi, la miscela viene lasciata in agitazione e dopo 3 ore dall’ inizio reazione si effettua un terzo controllo HPLC che mostra che la percentuale di precursore è del 4.5 %. La miscela di reazione viene trattata con 120 mL di una soluzione di NaHCO3, gocciolata a 0° C. La fase organica viene separata da quella acquosa

alcalina ed evaporata per dare un residuo grezzo del dipeptide deprotetto 3.21 [H-Dap(Z)-Leu-OMe] (3.3 g, resa 88.7%).

(6)

Parte sperimentale Rf = 0.43 (CH2Cl2/MeOH/NEt3 10/0.5/0.1); tR = 4.885 min.; Purezza HPLC = 75% (metodo 1).

1

H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.93 (d, 1H, J = 6.1 Hz), 0.94 (d, 3H, J = 6.1 Hz),

1.55-1.71 (m, 3H), 3.47-3.59 (m, 3H), 3.74 (s, 3H), 4.53-4.62 (m, 1H), 5.11 (s, 2H), 5.26-5.37 (m, 2H), 7.34-7.37 (m, 5H), 7.75 (d, 1H, J = 8.4 Hz).

5.1.d Sintesi del tripeptide Boc-Phe-Dap(Z)-Leu-OMe (3.23)

OMe N H O O NH Z H2N _N OMe H O NH Z O HN O N H Boc O N H Boc OSu + Boc-Phe-OSu (3.22) _{Boc-Phe-Dap(Z)-Leu-OMe (3.23)} H-Dap(Z)-Leu-(OMe) (3.21)

Ad una soluzione del dipeptide deprotetto 3.21 (3 g, 8.31 mmoli) in DMF (30 mL) si aggiunge l’estere attivo Boc-Phe-OSu (3.22) (3.16 g, 8.72 mmoli). Dopo 3 h di agitazione a t.a. si effettua un controllo HPLC (metodo 1) che mostra la scomparsa del precursore 3.21 e la presenza di una piccola percentuale di Boc-Phe-OSu (3.22).

La miscela di reazione viene quindi gocciolata in 200 mL di una soluzione di NaHCO3 0.5N e lasciata sotto agitazione magnetica per 18 ore. Il solido

precipitato dalla miscela di reazione viene filtrato e lavato su filtro con NaHCO3

0.5N (5 mL x 3 volte) e H2O demineralizzata (5 mL x 3 volte) ed essiccato in

stufa per 18 ore in presenza di P2O5 per eliminare l’acqua residua. Si ottiene così

il tripeptide 3.23 come solido bianco (4.68 g, resa 92%).

Rf = 0.41 (CH2Cl2/AcOEt/AcOH 8/2/0.2); tR = 15.257 min.; Purezza HPLC = 84% (metodo 1). 1 H NMR (400 MHz, DMSO) δ 0.82 (d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.87 (d, 3H J = 6.4 Hz), 1.27 (s, 9H), 1.42-1.51 (m, 1H), 1.54-1.67 (m, 2H), 2.72 (dd, 1H, J = 13.6, 10.4 Hz), 2.99 (dd, 1H, J = 13.6, 3.6 Hz), 3.21-3.42 (m, 2H), 3.60 (s, 3H), 4.07-4.19 (m, 1H), 4.24-4.35 (m, 1H), 4.38-4.50 (m, 1H), 5.02 (s, 2H), 6.98-7.35 (m, 10H), 8.14 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 8.65 (d, 1H, J = 8.0 Hz).

(7)

5.1.e Sintesi del tripeptide deprotetto H-Phe-Dap(Z)-Leu-OMe (3.16)

OMe N H O NH Z O HN O N H Boc Boc-Phe-Dap(Z)-Leu-OMe (3.23) OMe N H O NH Z O HN O H₂N H-Phe-Dap(Z)-Leu-OMe (3.16)

Ad una soluzione del tripeptide Boc-Dap(Z)-Leu-OMe (3.23) (4.0, g 6.53 mmoli) in CH2Cl2 (30 mL) si aggiunge TFA (5.6 mL) e si mantiene la miscela in

agitazione. Dopo 30 minuti il controllo HPLC (metodo 1) indica che si è formato il 50% del tripeptide 3.16. La miscela di reazione viene quindi lasciata in agitazione e il controllo HPLC dopo 6 h indica che la percentuale del tripeptide

3.23 è del 3%. La soluzione organica viene lavata con NaHCO3 (20 mL x 2) fino

a pH alcalino e le fasi acquose vengono estratte con 40 ml di CH2Cl2. Le fasi

organiche vengono riunite e lavate con NaCl soluzione satura (20 mL x 2). La fase organica viene evaporata per dare un residuo solido costituito dal tripeptide

3.16 (2.67 g, resa 79%).

Rf = 0.61 (CH2Cl2/MeOH/NEt3 10/0.5/0.1); tR = 7.876 min.; Purezza HPLC = 92.2% (metodo 1). 1 H NMR (400 MHz, DMSO) δ 0.83 (d, 3H, J = 6.2 Hz), 0.87 (d, 3H, J = 6.2 Hz), 1.42-1.70 (m, 3H), 2.56 (dd, 1H, J = 13.6, 4.8 Hz), 2.97 (dd, 1H, J = 13.6, 4.4 Hz), 3.24 (dd, 1H, J = 11.4, 8.4 Hz), 3.40 (dd, 1H, J = 11.4, 7.2 Hz), 3.60 (s, 3H), 4.23-4.32 (m, 1H), 4.40-4.49 (m,1H), 5.00 (d, 1H, J = 12.4), 5.04 (d, 1H, J = 12.4), 7.15-7.41 (m, 10H), 8.08 (bs, 1H), 8.39 (d, 1H, J = 7.6 Hz).

5.2 Sintesi del dipeptide TFA-Asp(OBn)-Trp-OH (3.17)

5.2.a Preparazione del fenil trifluoroacetato (3.28)

OH CF₃ O F₃C O O CF₃ O O + fenil trifluoroacetato (3.28)

(8)

Parte sperimentale Alla temperatura di 0°C si addiziona, gocciolando, l’anidride trifluoroacetica (19.2 mL, 138 mmoli) al fenolo (10 g, 106.2 mmoli). Terminata l’aggiunta la temperatura della reazione è lasciata salire spontaneamente a temperatura ambiente. Dopo 1 h di agitazione a t.a., la miscela di reazione viene distillata, raccogliendo la frazione che bolle a 144-146°C, costituita dal fenil trifluoroacetato (3.28), come noto in letteratura 14 (14.26 g, resa 71%).

5.2.b Sintesi dell’amminoacido TFA-Asp(OBn)-OH (3.25) via fenil trifluoroacetato OH O H2N O OBn O CF3 O OH O N H TFA O OBn +

H-Asp(OBn)-OH (3.24) fenil trifluoroacetato (3.28) _{TFA-Asp(OBn)-OH (3.25)}

In un pallone contenente fenil trifluoroacetato (3.29) (17.0 g, 89.47 mmoli) si aggiunge l’acido aspartico monobenzilato 3.25 (10.0 g, 44.8 mmoli) e la sospensione viene scaldata a 125-130°C sotto agitazione magnetica fino a limpidezza. La miscela è tenuta in agitazione ancora 5 minuti, dopodichè la temperatura di reazione viene lasciata salire spontaneamente a temperatura ambiente. Il controllo HPLC (metodo 1) mostra che il precursore 3.24 è scomparso. In una beuta da 250 mL contenente 180 mL di etere di petrolio viene aggiunta, sotto agitazione magnetica, la soluzione ottenuta precedentemente. Si ha la formazione di un precipitato e la sospensione è mantenuta in agitazione per 1 h. La sospensione viene filtrata e il solido viene triturato con etere di petrolio (160 mL x 2 volte). Vengono effettuate altre 7 triturazioni utlizzando 200 mL di etere di petrolio e mantenendo la sospensione in agitazione per 30 minuti. La sospensione viene filtrata e l’amminoacido protetto 3.25 viene ottenuto come solido bianco che viene essiccato sottovuoto (12.5 g, resa 87%).

Rf = 0.44 (CH2Cl2/acetone/AcOH 9.5/0.5/0.3); tR = 7.54 min.; Purezza HPLC = 98.85 % (metodo 1); (ee) = 99.2 % (metodo 2); [α]D25 = + 65.1 (C = 1, CHCl3);

(9)

1

H NMR (400 MHz, DMSO) δ 2.82 (dd, 1H, J = 17.1, 8.8 Hz), 2.99 (dd, 1H, J = 17.1, 5.2 Hz) 4.51-4.52 (m, 1H), 5.09 (s, 2H), 7.24-7.41 (m, 5 H), 9.71 (1H, d, J = 8.4 Hz).

5.2.b1 Sintesi dell’amminoacido TFA-Asp(OBn)-OH (3.25) via etil

trifluoroacetato CF3 O C H2 _O H₃C + OH O N H TFA O OBn OH O H2N O OBn H-Asp(OBn)-OH (3.24) TFA-Asp(OBn)-OH (3.25)

Ad una soluzione dell’acido aspartico monobenzilato 3.24 (5.0 g 22.4 mmoli) in MeOH anidro (50 mL) si aggiunge NEt3 (18.7 ml, 44.8 mmoli) e di seguito

l’etil trifluoroacetato (10 mL, 28 mmoli). Dopo aver lasciato la miscela di reazione in agitazione per 17 ore, il controllo HPLC (metodo 1) mostra che il precursore 3.24 si è consumato e che si è formato l’amminoacido protetto 3.25. La miscela viene evaporata ed il residuo grezzo, che risulta essere come un olio, viene disciolto in AcOEt (27 mL) e la soluzione organica viene lavata con una soluzione di HCl 0.5 M satura di NaCl (10 mL x 4 volte) fino a pH acido, poi con una soluzione satura di NaHCO3 (10 mL x 1 volta) fino a pH alcalino,

successivamente con una soluzione HCl 0.5 M satura di NaCl (10 mL x 2 volte) fino a pH acido ed infine con una soluzione di NaCl satura (10 mL x 2 volte), fino a pH neutro. La soluzione viene evaporata e si ottiene un residuo grezzo come un olio (6.76 g resa 95%). L’amminoacido protetto 3.25 viene triturato con esano fino a che non si ottiene un composto solido polveroso bianco, viene filtrato ed essiccato in stufa in presenza di P2O5 (2.46 g, resa 34%).

Rf = 0.44 (CH2Cl2/acetone/AcOH 9.5/0.5/0.3); tR = 7.54 min.; Purezza HPLC = 90% (metodo 1). (ee) = 100% (metodo 2); [α]D25 = + 60.0 (C = 1, CHCl3);

[α]D22.5 lett. = + 59.1 (C = 1.02, CHCl3); 1

H NMR (400 MHz, DMSO) δ 2.82 (dd, 1H, J = 17.1, 8.8 Hz), 2.99 (dd, 1H, J = 17.1, 5.2 Hz), 4.51-4.52 (m, 1H), 5.09 (s, 2H), 7.24-7.41 (m, 5 H), 9.71 (1H, d, J = 8.4 Hz).

(10)

5.2.c Sintesi dell’estere attivo TFA-Asp(OBn)-OSu (3.26)

OH O N H TFA O OBn OSu O N H TFA O OBn TFA-Asp(OBn)-OH (3.25) TFA-Asp(OBn)-OSu (3.26)

Ad una soluzione di TFA-Asp-(OBn)-OH (3.25) (2.0 g, 6.26 mmoli) in CH2Cl2 (25 mL) viene aggiunta l’HOSu (0.721 g, 6.26 mmoli). La sospensione è

raffreddata a 0°C e a questa temperatura viene aggiunta la DCC (1.292 g, 6.2.6 mmoli) nell’arco di 10 minuti, mantenendo la temperatura di reazione a 0°C per 30 minuti. Successivamente la temperatura è lasciata salire spontaneamente a 20-25° C e dopo un’ora viene filtrata la DCU. La soluzione viene evaporata ottenendo l’estere attivo 3.26 come solido (2.05 g, resa 78%).

Rf = 0.54 (CH2Cl2/acetone/AcOH 9.5/0.5/0.3); tR = 9.857 min.; (metodo 1).

1

H NMR (400 MHz, DMSO) δ2.81 (s, 4H), 3.11 (dd, 1H, J = 17.2, 8.4 Hz), 3.19 (dd, J = 17.2, 5.8 Hz) 5.15 (s, 2H), 5.17-5.21 (m, 1 H), 7.30-7.40 (m, 5H), 10.33 (d, 1H J = 8.0 Hz).

5.2.d Sintesi del dipeptide TFA-Asp(OBn)-Trp-OH (3.17)

OSu O N H TFA O OBn + N H O OH H₂N N H O OH H N N H TFA O OBn TFA-Asp(OBn)-OSu (3.26) TFA-Asp(OBn)-Trp-OH (3.17) H-Trp-OH (3.27) O

Ad una sospensione di L-triptofano (3.27) (3.0 g, 14.69 mmoli) in DMF (11 mL) raffreddata a 0°C si aggiunge TFA-Asp(OBn)-OSu (3.26) (6.5 g, 15.61 mmoli). La sospensione è mantenuta in agitazione a 0°C per 3h e poi viene portata a 20-25°C. Non si osserva una soluzione limpida e quindi la miscela di reazione è mantenuta in agitazione per una notte. Dopo questo tempo si ottiene

(11)

Parte sperimentale una soluzione limpida di colore giallo. Si effettua un controllo HPLC (metodo 1) che mostra la scomparsa del precursore 3.26. La soluzione viene evaporata fino ad ottenere un residuo oleoso giallo/arancio che viene disciolto in AcOEt. La soluzione organica viene lavata con una soluzione di HCl 0.5% (50 mL x 2) fino a pH acido e successivamente con H2O demineralizzata (50 mL x 3) fino a portare a

neutralità. La soluzione viene evaporata ottenendo il dipeptide 3.17 come un solido amorfo (7.23 g, resa 97%).

tR = 9.575 min.; Purezza HPLC = 92% (metodo 1); (de) = 90% (metodo 3). δ_{(400 MHz, DMSO) 2.78-2.90 (m, 2H), 3.01-3.09 (m, 1H), 3.14-3.20 (m, 1H),} 4.42-4.48 (m, 1H), 4.71-4.81 (m, 1H), 5.07 (d, 1H, J = 12.4 Hz) 5.13 (d, 1H, J = 12.4 Hz), 6.95-7.15 (m, 3H), 7.30-7.4 (m, 6H), 7.51 (d, 1H, J = 7.6 Hz) 8.45 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 9.68 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 10.88 (s, 1H), 12.71 (s, 1H).

5.3 Sintesi del pentapeptide TFA-Asp(OBn)-Trp-Phe-Dap(Z)-LeuOMe (3.15)

5.3.a Sintesi dell’estere attivo TFA-Asp(OBn)-Trp-OSu (3.29)

N H O OSu H N O N H TFA O OBn TFA-Asp(OBn)-Trp-OH (3.17) N H O OH H N O N H TFA O OBn TFA-Asp(OBn)-Trp-OH (3.29)

Ad una soluzione del dipeptide TFA-Asp(OBn)-Trp-OH (3.17) (3.9 g, 7.71 mmoli) in CH3CN (120 mL) si aggiunge HOSu (0.975 g 8.48 mmoli) e la

sospensione è raffreddata a 0° C. A questa temperatura si addiziona la DCC (1.75 g 8.48 mmoli) e la miscela di reazione è agitata per 2h. Si effettua un controllo HPLC (metodo 1) che indica la scomparsa del precursore 3.17. Quindi si filtra la DCU precipitata e la soluzione viene evaporata per dare il dipeptide attivato 3.29 come solido schiumoso (5.26 g). Dal calcolo della resa è evidente la presenza di

(12)

Parte sperimentale DCU residua. Il composto ottenuto viene comunque utilizzato come tale nello stadio successivo.

tR = 12.025 min; Purezza HPLC = 92.65% (metodo 1);

1 H NMR (400 MHz, DMSO) δ 2.79-2.84 (m, 4H), 2.85-2.88 (m, 2H), 3.14-3.25 (m, 1H), 3.32-3.42 (m, 1H) 4.78-4.87 (m, 2H), 5.08 (d, 1H, J = 12.4 Hz), 5.12 (d, 1H, J = 12.4 Hz), 8.99-7.04 (m, 1H), 7.07-7.12 (m, 1H). 7.25 (d, 1H J = 2.4 Hz), 7.32-7.39 (m, 6H), 7.54 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 9.06 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 9.79 (d, 1H J = 8.0 Hz), 10.99 (s, 1H).

5.3.b Sintesi del pentapeptide TFA-Asp(OBn)-Trp-Phe-Dap(Z)-Leu-OMe (3.15) TFA-Asp(OBn)-Trp-OH (3.29) N H O OSu H N N H TFA O OBn O OMe N H O NH Z HN O N H O H N O N H TFA O OBn N H O TFA-Asp(OBn)-Trp-Phe-Dap(Z)-Leu-OMe (3.15) OMe N H O NH Z O HN O H2N H-Phe-Dap(Z)-Leu-OMe (3.16) +

Ad una soluzione del tripeptide 3.16 (2.5 g 4.9 mmoli) in DMF (40 ml), si addiziona, a 0° C, l’estere attivo 3.29 (2.85 g 4.9 mmoli). La temperatura della reazione è mantenuta a 0°C per 10 minuti e quindi è lasciata salire spontaneamente fino a temperatura ambiente. Dopo aver lasciato la miscela in agitazione per 1 ora si effettua un controllo HPLC (metodo 1) che mostra la scomparsa del tripeptide 3.16 e una piccola percentuale dell’estere attivo 3.29. La soluzione viene concentrata al rotavapor e successivamente gocciolata in 140 mL di H SO 0.05 N, mantenuta sotto agitazione magnetica per 1h e 30 minuti e la

(13)

Parte sperimentale sospensione ottenuta è filtrata. Il solido viene lavato con H2SO4 0.05 N (25 mL) e

poi con H2O demineralizzata (25 mL x 2 volte), essiccato sottovuoto a 40° C fino

a peso costante ottenendo il pentapeptide 3.15. (4.6 g, resa 94%). tR = 17.240 min.; Purezza HPLC = 87% (metodo 1).

1 H NMR (400 MHz, DMSO) δ 0.82 (d, 3H, J = 6.2 Hz), 0.86 (d, 3H, J = 6.2 Hz), 1.46-1.69 (m, 3H) 2.75-2.91 (m, 4H), 2.97-3.11 (m, 2H), 3.21-3.49 (m, 2H), 3.59 (s, 3H), 4.29-4.35 (m, 1H), 4.39-4.55 (m, 3H), 4.71-4.77 (m, 1H), 4.95- 5.19 (m, 4H), 6.92-7.09 (4H, m), 7.11-7.24 (5H, m), 7.25-7.41 (11H, m), 7.54 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 8.05 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.13 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 8.26-8.37 (m, 2H), 9.63 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 10.80 (s, 1H).

(14)

5.4 Spettri 1H NMR relativi alla parte sperimentale

OSu NH N H Boc Z Boc-Dap(Z)-OSu (3.19) O OMe N H O NH Z HN Boc Boc-Dap(Z)-Leu-OMe (3.20₎ O

(15)

Parte sperimentale OMe N H O O NH Z H2N H-Dap(Z)-Leu-OMe (3.21) OMe N H O NH Z O HN O N H Boc Boc-Phe-Dap(Z)-Leu-OMe (3.23)

(16)

Parte sperimentale OMe N H O NH Z O HN O H2N H-Phe-Dap(Z)-Leu-OMe(3.16) OH O N H TFA O OBn TFA-Asp(OBn)-OH (3.25)

(17)

Parte sperimentale N H O OH H N O N H TFA O OBn TFA-Asp(OBn)-Trp-OH (3.17) OSu OBn O N H O TFA TFA-Asp(OBn)-OSu (3.26)

(18)

Parte sperimentale N H O OSu H N O N H TFA O OBn TFA-Asp(OBn)-Trp-OSu (3.29) OMe N H O NH Z HN O N H O H N O N H TFA O OBn N H O TFA-Asp(OBn)-Trp-Phe-Dap(Z)-Leu-OMe (3.15)