1 DPYD*2A rs3918290 2 DPYD*13 rs55886062 3 DPYD D949V rs67376798 4 DPYD IVS10 rs75017182 5

LightMix

in-vitro diagnostics kit Multi-SNiP DPYD

Cat.-No.: 40-2002-64

Identificazione delle variazioni del gene DPYD:

1 DPYD*2A rs3918290 2 DPYD*13 rs55886062 3 DPYD D949V rs67376798 4 DPYD IVS10 rs75017182 5

6 7 8

Formato Strip

Da utilizzare con gli strumenti della famiglia Roche Diagnostics LightCycler^® 480

Reagenti per 64 reazioni All’arrivo:

Conservare i Reagenti Parametro Specifici e gli Standard al riparo dalla luce ed a temperatura ambiente (NON congelare)

Conservare congelati i reagenti FastStart DNA Master HybProbe (-20°C) inclusi nella confezione

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Indice

1. Informazioni sul Prodotto ... 3

1.1 Contenuto: ... 3

1.2 Scopo dell’analisi ... 4

1.3 Specifiche ... 4

1.3.1 Campioni clinici ... 5

1.3.2 Detection range ... 5

1.3.3 Strumenti, software e determinazioni ... 5

1.4 Conservazione e stabilità ... 5

2. Dispositivi e Reagenti aggiuntivi ... 6

2.1 Necessari ... 6

2.2 Preparazione del campione ... 6

3. Informazioni sul gene ... 7

3.1 Metodologia e Principio dell’analisi ... 7

3. 2 Specifiche e prestazioni ... 7

3.3 Informazioni cliniche ... 8

4. Avvertenze e precauzioni ... 9

5. Impostazioni ... 10

5.1 Strumenti LightCycler^® 480 ... 10

5.2 Strumento LightCycler^® 96 ... 11

6. Protocollo analitico ... 12

6.1 Preparazione del campioni ... 12

6.2 Preparazione dei reagenti... 12

6.2.1 Preparazione della LightCycler^® FastStart DNA Master ... 12

6.2.2 Preparazione del Controllo Positivo ... 12

6.3 Preparazione della miscela di reazione ... 13

6.3.1 Preparazione della miscela di reazione per il Controllo Positivo, HT ... 13

6.3.2 Preparazione della miscela di reazione per il Controllo Negativo, NTC ... 13

6.3.3 Preparazione della miscela di reazione per i campioni biologici ... 13

6.4 Gestione della confezione delle strip ... 14

6.5 Procedura di caricamento dei pozzetti ... 14

6.6 Conservazione e stabilità dei componenti risospesi ... 14

7. Analisi dei dati e interpretazione ... 15

7.1 Limiti ed interferenze ... 15

7.2 Calibrazione ... 15

7.3 Controllo di Qualità – Criteri di accettabilità... 15

7.3.1 Controllo positivo HT ... 15

7.3.2 Controllo negativo ... 15

7.3.3 Campioni ... 16

7.3.4 Anomalie nelle curve di melting ... 16

7.5 Analisi dei risultati ... 17

7.5.1 Canali di rilevamento ... 17

7.5.2 Dati tipici di amplificazione ... 17

7.5.3 Analisi della curva di melting: LightCycler^® 480 ... 17

7.6. Interpretazione dei risultati ... 19

7.7. Picchi di melting di varianti rare ... 20

8. Troubleshooting ... 21

9. Riferimenti ... 22

Classificazione / Riferimenti... 23

Avviso all’acquirente – Brevetti e Marchi Registrati ... 23

Scheda di Sicurezza ... 24

Note di rilascio ... 24

1. Informazioni sul Prodotto 1.1 Contenuto:

Strip: reagenti per PCR premiscelati liofilizzati:

Conservare in frigo (2°C / 8°C) e al buio.

Descrizione Reazioni

Totali

8 x Strip Contenenti

ciascuna 4 SNP in duplicato

Ciascun pozzetto contiene primer e sonde premiscelate e liofilizzate per una reazione.

<0,01pg oligonucleotidi non marcati (primer target specifici);

<0,01pg oligonucleotidi marcati con SimpleProbe^® 519 (sonda target specifica).

4 target indipendenti per campione 2 campioni per strip.

Le strip sono confezionate in atmosfera modificata con Argon.

64

8 x Fogli per sigillare la strip Standard (DNA di controllo):

Conservare in frigo (2°C / 8°C) e al buio.

Colore del

tappo Etichetta Descrizione Reazioni

totali 1 x Giallo HT Controllo positivo eterozigote

<0,01pg miscela dei DNA plasmidici bersaglio (sintetici) [circa 10E4 genomi equivalenti].

40 Reagenti per la polimerasi: LightCycler^® FastStart DNA Master HybProbe

All’arrivo conservare a -20°C.

L’enzima FastStart DNA Master HybProbe è incluso nel presente kit fornito diret- tamente da TIB MOLBIOL.

Colore del

tappo Etichetta Descrizione Reazioni

totali 1 x Rosso 1a Enzima LightCycler^® FastStart 64 1 x Bianco 1b LightCycler^® FastStart Mix di reazione

HybProbe 64

1 x Trasparente Acqua H2O di grado PCR

1 x Blu MgCl₂ MgCl2, 25 mM

1) L’enzima viene spedito da TIB MOLBIOL a temperatura ambiente.

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1.2 Scopo dell’analisi

Partendo da un campione di DNA umano genomico estratto da sangue periferi- co, questo kit permette l’identificazione simultanea di quattro polimorfismi (SNP) nel gene Dihydropyrimidine Dehydrogenase (DPYD), che codifica per la proteina Dihydropyrimidine Dehydrogenase (DPD).

SNP allele HGVS Effetto / modificazione della proteina

rs3918290 rs55886062 rs67376798 rs75017182

DPYD*2A DPYD*13

c.1905+1G>A c.1679T>G c.2846A>T

c.1129-5923C>G

IVS14 + 1G>A p.I560S

p.D949V IVS10 C>G

La mancanza o la ridotta attività della proteina DPD può provocare una grave tossicità in pazienti trattati con il 5-fluorouracile.

Il dosaggio del 5-fluorouracile dovrebbe essere modulato sulla base delle muta- zioni presenti nel DNA del paziente; in alcuni casi è necessario utilizzare un altro farmaco.

Il trattamento con 5-fluorouracile di pazienti non portatori delle mutazioni rilevate da questo kit devono essere comunque attentamente monitorati poiché altre mu- tazioni possono influire sull’attività della proteina DPD.

Nota: La performance del presente kit può essere garantita solamente quando usato con gli strumenti LightCycler^® (vedere paragrafo 1.3.2 per i dettagli).

Il presente prodotto è un sussidio diagnostico in-vitro che deve essere utilizzato esclusivamente da personale qualificato.

1.3 Specifiche

Il “LightMix^® in vitro diagnostic kit Multi-SNiP Kit DPYD” è un test diagnostico in- vitro che permette il rilevamento simultaneo di quattro specifiche mutazioni come dimostrato in campioni di riferimento.

Altre possibili variazioni vicine, che possono essere rilevate, ma non identificate da questo kit, sono elencate nel paragrafo “7.7 Picchi di melting di varianti ra- re”.

1.3.1 Campioni clinici

Per ogni SNP identificato dal kit sono richiesti 2 µl di DNA genomico purificato in soluzione acquosa estratto da campioni clinici.

1.3.2 Detection range

2 µl di DNA genomico purificato contengono da 5 a 100 ng/µl di DNA genomico (10 ng – 200 ng totali), come determinato da spettrometria UV (1 OD = 50 µg DNA/ml).

1.3.3 Strumenti, software e determinazioni

Il kit contiene reagenti per 16 reazioni per SNP, per un totale di 64 reazioni, in un volume finale di reazione di 10 µl.

Ciascun campione biologico è analizzato per gli SNP specifici con reazioni indi- pendenti.

La tabella sottostante riassume alcune caratteristiche del presente kit:

Strumenti ⁽¹⁾ LightCycler^®

Versione Software (o superiore)

Rendimento massimo ⁽²⁾

Massimo numero di campioni / sedu-

ta ⁽³⁾

Rendimento minimo ⁽⁴⁾

LC480

(96 wells) 1.5 14+ 2 ctrl. 22 + 2 ctrl. 8

z480

(open channel) 1.5 14+ 2 ctrl. 22+ 2 ctrl. 8

LC96 1.6 14+ 2 ctrl. 22+ 2 ctrl. 8

1 Ogni seduta dura circa 100 minuti.

2 Per ogni SNP identificato dal presente kit sono necessari uno standard e un controllo negativo.

3 E’ richiesto l’uso di più kit.

4 Calcolato considerando due campioni biologici analizzati in ciascuna seduta.

1.4 Conservazione e stabilità

Fare attenzione alle diverse condizioni di conservazione per i reagenti e l’enzima!

Reagenti e Controlli

Conservare i reagenti liofilizzati (Strip e Standard) al riparo dalla luce ed in frigo (2°C / 8°C). Non congelare i reagenti liofilizzati. Per la stabilità vedere data di scadenza riportata sull’etichetta.

Enzima

Conservare il prodotto LightCycler^ FastStart DNA Master HybProbe tra -15°C e -25°C. Per la stabilità vedere data di scadenza riportata sull’etichetta.

Spedizione

I prodotti sono spediti a temperatura ambiente.

La loro stabilità durante il trasporto è stata testata in queste condizioni.

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2. Dispositivi e Reagenti aggiuntivi 2.1 Necessari

LightCycler^® 480 Roche Diagnostics

LightCycler^® 480 (modello I) Fuori Produzione

LightCycler^® 480 II Cat.-No. 05 015 278 001

cobas z 480 Analyzer Cat.-No. 05 200 881 001

LightCycler^® Software Versione 1.5 o superiore Cat.-No. 04 994 884 001 LightCycler^® 8-Tube-Strip Adapter Plate Cat.-No. 06 612 598 001

Oppure

LightCycler^® 96 Roche Diagnostics

LightCycler^® 96 05 815 916 001

LightCycler^® Software Versione 1.0 o superiore Incluso con lo strumento

2.2 Preparazione del campione

Preparazione manuale: Roche Diagnostics

High Pure PCR Template Preparation Kit Cat.-No. 11 796 828 001

H₂O priva di nucleasi Qualunque fornitore

Etanolo p.a. Qualunque fornitore

Isopropanolo p.a. Qualunque fornitore

Preparazione automatica: Roche Diagnostics

MagNA Pure Instrument Fuori Produzione

MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I Cat.-No. 03 003 990 001

Oppure

MagNA Pure 2.0 Instrument Cat.-No. 05 197 686 001

MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I Cat.-No. 03 003 990 001

Oppure

MagNA Pure Compact Instrument Cat.-No. 03 731 146 001 MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I Cat.-No. 03 730 964 001

Oppure

MagNA Pure 96 Instrument Cat.-No. 05 195 322 001

MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume Kit Cat.-No. 05 467 497 001

Oppure

MagNA Pure 96 IVD Instrument Cat.-No. 06 541 089 001 MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume Kit Cat.-No. 06 543 588 001

Per l’uso di questo kit

non è richiesto il Color Compensation

3. Informazioni sul gene

3.1 Metodologia e Principio dell’analisi

Usando la tecnica della PCR, un frammento del gene di interesse è amplificato con primers specifici. Il frammento è identificato con una sonda specifica per la mutazione di interesse marcata internamente con SimpleProbe^® 519.

Le sonde SimpleProbe^® sono fluorescenti solamente quando legate al DNA complementare.

La sonda si lega ad una parte della sequenza bersaglio che si estende sul sito della mutazione. Durante la curva di melting la temperatura viene lentamente aumentata, la sonda si dissocia ad un valore specifico di temperatura, provocan- do una diminuzione della fluorescenza. Ogni mismatch tra la sonda e la sua se- quenza bersaglio destabilizza l’ibrido, provocando uno spostamento a sinistra (diminuzione) della temperatura di melting.

In questo prodotto le sonde sono state scelte per ottenere la miglior discrimina- zione possibile tra gli SNP analizzati. Se la sonda sia complementare alla se- quenza wild type o mutata viene descritto nei capitoli seguenti del presente ma- nuale.

L’analisi dei risultati di genotipizzazione si basa sulle temperature di melting dei campioni biologici paragonate agli standard forniti.

I risultati dell’analisi “Tm calling” devono essere controllati da parte dell’operatore mediante confronto visivo per evidenziare curve di melting differenti dall’atteso e valori di temperatura di melting intermedi a quelli descritti. Il genotipo dei cam- pioni deve essere dedotto dalle temperature di melting secondo i criteri descritti nel capitolo 7.

I controlli standard forniti permettono la comparazione con i campioni clinici.

3. 2 Specifiche e prestazioni

Specificità analitica

La specificità per il gene bersaglio e l’adeguatezza della reazione di amplifica- zione impiegata nel presente test è stata dimostrata comparando il risultato del test con il sequenziamento diretto dell’amplicone.

Sensibilità analitica

L’analisi di diluizioni seriali di vari campioni eterozigoti di DNA genomico umano hanno rivelato che il limite di rilevamento del presente test è pari a 250 copie (1,5 ng).

L’analisi va eseguita all’interno dei limiti di detezione del sistema (vedere 1.3.2).

Specificità e sensibilità diagnostiche

Più di 20 campioni biologici di DNA genomico estratto da pazienti Caucasici è stato analizzato in parallelo mediante sequenziamento e con il presente kit. I ri- sultati del sequenziamento sono stati ottenuti con lo strumento “ABI 3730xl” ed eseguiti da LGC Genomics GmbH, Berlino.

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Risultati:

La concordanza dei risultati ottenuti con le due tecnologie analitiche ha raggiunto un valore pari al 100%.

Il dettaglio dei risultati per ciascun SNP è disponibile inviando la richiesta a:

[email protected].

Altre varianti:

E’ possibile che altre varianti siano presenti nella regione di legame delle sonde.

Oligoncleotidi sintetici, che simulano tutte le varianti presenti in GeneBank (a Gennaio 2015), sono stati usati per dimostrare che il presente kit è in grado di identificare il genotipo corretto (vedere 7.7 Picchi di Melting per variant rare).

3.3 Informazioni cliniche

Il gene DPYD, che codifica per la proteina Dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD), ha una coding sequence di 4.339 nucleotidi con 23 esoni su un totale di 950Kb sul cromosoma 1p22.6 ⁽¹⁾.

La proteina DPD è l’enzima limitante nel catabolismo delle fluoropirimidine ed elimina più dell’80% del 5-fluorouracile somministrato ad un paziente ⁽²⁾.

In pazienti con carenza di DPD, i farmaci fluoropirimidinici sono altamente tossici con effetti molto gravi o addirittura fatali; provocano mielosoppressione, mucositi, neurotossicità, eritrodisestesia palmo-plantare e diarrea.

La carenza di DPD è causata da varianti geniche; la più nota è la IVS14+1G>A DPYD *2A che comporta la delezione dell’esone 14. Varianti meno frequenti as- sociate alla tossicità del 5-fluorouracile sono la c.2846A>T localizzata nell’esone 22 e la c.T1679G (DPYD*13) nell’esone 13.

Ad Agosto 2013 il Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium ha pubblicato le linee guida per analizzare sui pazienti la presenza di queste tre va- rianti (DPYD*2A, DPYD *13, and rs67376798) per il corretto dosaggio dei farma- ci fluoropirimidinici ⁽³⁾.

http://www.pharmgkb.org/guideline/PA166109594

Sistonen, nella pubblicazione su Clinica Chimica Acta (2012), ha identificato un nuovo polimorfismo intronico, localizzato nell’introne 10 (rs75017182), che gene- ra uno splicing alternativo. L’inclusione nel kit di questo polimoprfismo triplica la quota di pazienti portatori di varianti a rischio che possono essere identificati.

Pazienti omozigoti mutati (0.2% dei pazienti) e probabilmente anche tutti i pa- zienti eterozigoti composti mostrano una carenza totale di DPD e devono essere trattati con altri farmaci.

Pazienti eterozigoti per singole varianti (fino al 5% dei pazienti) possono avere una parziale carenza di DPD e dovrebbero essere trattati con il 50% della dose e monitorati con test farmacocinetici.

Note: La carenza di DPD può essere provocata da altre mutazioni non identificate da questo prodotto.

4. Avvertenze e precauzioni

Requisiti per la manipolazione

Questo prodotto è un dispositivo diagnostico in-vitro, pertanto può essere utiliz- zato solo da personale qualificato.

Adottare le normali precauzioni previste per la manipolazione di tutti i reagenti di laboratorio.

Il flusso di lavoro del laboratorio deve essere conforme alle pratiche di laboratorio standard. A causa dei rischi di contaminazione, la preparazione della reazione e la reazione di amplificazione devono essere eseguite in aree fisicamente separa- te.

Non mescolare reagenti di diversi lotti.

Non usare i reagenti dopo la data di scadenza.

Usare la versione del manuale rilasciata con il kit (vedere l’etichetta del kit).

Procedure di laboratorio

Tutti i materiali di origine umana ed il relativo materiale di scarto devono essere considerati come potenzialmente infetti. Pulire e disinfettare accuratamente tutte le superfici di lavoro con disinfettanti consigliati dalle autorità locali.

Evitare di mangiare, bere o fumare nell’area di lavoro del laboratorio.

Non utilizzare la bocca per il pipettamento.

Indossare guanti di protezione monouso, camici di laboratorio e un’adeguata pro- tezione per gli occhi durante la manipolazione dei campioni e dei reagenti del kit.

Evitare la contaminazione microbica o da nucleasi dei reagenti.

E’ essenziale l’uso di pipette sterili monouso.

Lavarsi accuratamente le mani dopo la manipolazione di campioni e reagenti del test.

Preparazione dei campioni

Per informazioni sulla manipolazione e lo smaltimento fare riferimento alle istru- zioni di sicurezza incluse nel foglietto illustrativo del prodotto utilizzato (vedere capitolo 2.3).

Amplificazione e rilevamento

Prima di usare questo prodotto, consultare il manuale dell’operatore del Li- ghtCycler^.

Per consentire una corretta identificazione dei campioni, registrare in un docu- mento ciascuna posizione.

Controllare tutte le impostazioni del LightCycler^ ed assicurarsi che corrisponda- no a quelle riportate nella seguente sezione “5. Impostazioni”.

Non toccare senza guanti la superficie dei capillari o la pellicola di copertura delle piastre.

Fare riferimento a tutte le istruzioni operative e di sicurezza del LightCycler^. Manipolazione dei materiali di scarto

Smaltire i reagenti non utilizzati ed il materiale di scarto in conformità con le nor- mative vigenti.

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5. Impostazioni

5.1 Strumenti LightCycler

480

Per i dettagli consultare il manuale d’uso del LightCycler^.

L’accessorio LightCycler^® 8-Tube-Strip Adapter Plate può esse- re molto caldo: utilizzare le apposite protezioni per rimuoverlo dallo strumento.

Detection Format: SimpleProbe Volume di reazione: 10 µl

Programmazione:

Il protocollo consiste di quattro fasi (Tab.2):

1. Denaturazione del campione e attivazione dell’enzima 2. Amplificazione del DNA target

3. Melting Identificazione della sequenza di DNA amplificato 4. Raffreddamento dello strumento

Fase: 1 2 3 4

Parameter

Analysis Mode None Quantification mode Melting Curves mode None

Cycles 1 45 1 1

Target [°C] 95 95 60 72 95 43 75 40

Acquisition

Mode None None Single None None None Cont. None

Hold

[hh:mm:ss] 00:10:00 00:00:05 00:00:10 00:00:15 00:00:30 00:02:00 00:00:00 00:00:30 Ramp Rate

[C°/ s] 96 4.4 4.4 2.2 4.4 4.4 1.5 0.29 1.5

Acquisitions

[per °C] ^{- - - - - - 2 -}

Sec Target

[°C] 0 0 0 0 - - - -

Step Size

[°C] 0 0 0 0 - - - -

Step Delay

[cycles] 0 0 0 0 - - - -

Tab. 1: Impostazione degli strumenti LightCycler^® 480 e cobas z 480 Analyzer.

Nota: L’impostazione del programma di PCR ed i valori predefiniti possono essere salvati co- me “Run Template” che può essere richiamato ad ogni seduta.

Assicurarsi di programmare 2 acquisizione al secondo, anziché 5 che è l’impostazione predefinita; più acquisizioni riducono la pendenza della curva di mel- ting, aumentano la durata dell’esperimento e possono provocare un malfunziona- mento del kit.

5.2 Strumento LightCycler

96

Per i dettagli consultare il manuale d’uso del LightCycler^. Misurazioni:

Detection Format: 470/514 FAM General

Quant Factor Melt Factor Integration Time (S) Volumes (µl)

10.00 1.20 Dynamic 10

Programmazione:

Il protocollo consiste di quattro fasi (Tab.3):

1. Preincubazione del campione e attivazione dell’enzima 2. Fase di Amplificazione del DNA target

3. Melting Identificazione della sequenza di DNA amplificato 4. Raffreddamentodello strumento

Fase: 1 2 3 4

Parameter

Cycles 1 45 1 1

Ramp [°C/ s] 4.4 4.4 2.2 4.4 4.4 1.5 0.20 1.5

Duration [s] 600 5 10 15 30 120 1 30

Target [°C] 95 95 60 72 95 43 75 40

Mode Standard Standard Standard

Acquisition

Mode None None Single None None None Cont. None

Readings /°C 5

Tab. 2: Impostazione dello strumento LightCycler^® 96.

Nota: L’impostazione del programma di PCR ed i valori predefiniti possono essere salvati co- me “'Experiment file” che può essere richiamato ad ogni seduta.

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6. Protocollo analitico

Impostare gli strumenti prima di preparare le soluzioni (vedere paragrafo 5. Im- postazioni e consultare il manuale d’uso del LightCycler^®).

Le prestazioni descritte per il presente test sono garantite solo impiegando i si- stemi LightCycler^® Roche Diagnostics.

6.1 Preparazione del campioni

Per la preparazione del DNA genomico partire da un campione di sangue perife- rico umano (EDTA, citrato). L’uso di eparina è fortemente sconsigliato poiché questo anticoagulante potrebbe interferire con la reazione di PCR.

Eseguire la purificazione manualmente usando High Pure PCR Template Prepa- ration Kit o tramite lo strumento MagNA Pure LC scegliendo il kit di estrazione appropriato al modello impiegato (vedere paragrafo 2. Dispositivi e Reagenti ag- giuntivi). Seguire le istruzioni dei rispettivi manuali d’uso.

6.2 Preparazione dei reagenti

6.2.1 Preparazione della LightCycler

FastStart DNA Master

fredda.

2 Scongelare la provetta 1b LightCycler® FastStart Reaction Mix scaldandola a 30°- 35°C per 3-5 minuti.

3 Miscelare attentamente la soluzione con una pipetta.

4 Centrifugare brevemente per raccogliere le gocce.

5

La soluzione deve essere priva di particolato.

Controllare con attenzione la provetta lateralmente, se se sono presenti tracce di particolato, ripetere dal punto 3.

6 Aggiungere 60 µl di 1b alla provetta 1a.

7 Miscelare accuratamente la soluzione con una pipetta.

Non usare il vortex! Evitare la formazione di bolle d’aria.

8 Centrifugare brevemente per raccogliere le gocce.

9 Utilizzare questo reagente per preparare la Miscela di Rea- zione (vedere 6.3 preparazione della miscela di reazione).

10 Conservare l’eventuale reagente avanzato a 4°C.

6.2.2 Preparazione del Controllo Positivo

► Il Controllo Positivo HT è sufficiente per 40 reazioni.

1 Centrifugare la provetta HT a 10.000 RPM per 1 minuto.

2 Controllare che il pellet blu si trovi in fondo alla provetta.

3 Sciogliere il pellet aggiungendo 80 µl di Acqua di grado PCR.

4 Incubare per 20 sec a temperature ambiente.

5 Mescolare la soluzione con il vortex per 10 sec.

6 Centrifugare brevemente per raccogliere le gocce.

► Usare 2 µl del Controllo Positivo HT per una reazione di PCR da 10 µl.

► Il Controllo Positivo HT deve essere inserito in ogni seduta.

Nota: L’apertura della provetta può causare contaminazione dell’ambiente di lavoro (aerosol).

6.3 Preparazione della miscela di reazione

Prima di incominciare la procedura, preparare un numero di provette pari al nu- mero di campioni da analizzare opportunamente etichettate, più due provette chiamate HT e NTC.

6.3.1 Preparazione della miscela di reazione per il Controllo Positivo, HT

Nella provetta chiamata HT miscelare:

Componenti:

H2O di grado PCR (tappo trasparente) 26.5 µl Soluzione di Mg²⁺ 25 mM (tappo blu) 3.5 µl LightCycler^ FastStart DNA Master HybProbe

(tappo rosso), vedere 6.2.1 4.0 µl

HT Controllo Positivo 8.0 µl

Volume totale 42.0 µl

Tab. 3 Volumi dei componenti per la preparazione della miscela di reazione del Controllo Positivo.

6.3.2 Preparazione della miscela di reazione per il Controllo Negativo, NTC

Nella provetta chiamata NTC miscelare:

Componenti:

H2O di grado PCR (tappo trasparente) 34.5 µl Soluzione di Mg²⁺ 25 mM (tappo blu) 3.5 µl LightCycler^ FastStart DNA Master HybProbe

(tappo rosso), vedere 6.2.1 4.0 µl

Volume totale 42.0 µl

Tab. 4: Volumi dei componenti per la preparazione della miscela di reazione del Controllo Negativo

6.3.3 Preparazione della miscela di reazione per i campioni biologici

Per ogni campione biologico in una provetta chiaramente etichettata miscelare:

Componenti:

H2O di grado PCR (tappo trasparente) 26.5 µl Soluzione di Mg²⁺ 25 mM (tappo blu) 3.5 µl LightCycler^ FastStart DNA Master HybProbe

(tappo rosso), vedere 6.2.1 4.0 µl

Campione biologico 8.0 µl

Volume totale 42.0 µl

Tab. 5: Volumi dei componenti per la preparazione di una singola miscela di reazione

Pipettare con cura la Miscela di Reazione

Una notevole percentuale di fallimenti nei test è dovuta ad una miscela di reazione non omogenea!

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6.4 Gestione della confezione delle strip

Per far sì che tutti i reagenti rimangano a contatto con l’Argon, all’interno della confezione le strip non sono chiuse singolarmente. Tagliare un angolo del sac- chetto di alluminio, usando i guanti estrarre le strip e sigillarle immediatamente con l’apposita striscia di alluminio fornita. Le strip sono stabili per 30 giorni se mantenute refrigerate (4°C - 8°C) al riparo dalla luce.

6.5 Procedura di caricamento dei pozzetti

Almeno due strip devono essere usate per ogni seduta.

Due piccoli fori indicano l’orientamento della strip: il foro asimmetrico in- dica la posizione 1; praticare un segno distintivo sulla strip prima di riem- pirla con i reagenti.

Caricare in ogni pozzetto 10 µl di ciascuna miscela di reazione preparate come indicato nel capitolo 6.3, seguendo lo schema sottostante:

Strip N°1 Strip N°2 Strip N°3

1 HT 1 Paziente 1 1 Paziente 3

2 HT 2 Paziente 1 2 Paziente 3

3 HT 3 Paziente 1 3 Paziente 3

4 HT 4 Paziente 1 4 Paziente 3

5 NTC 5 Paziente 2 5 Paziente ….

6 NTC 6 Paziente 2 6 Paziente ….

7 NTC 7 Paziente 2 7 Paziente ….

8 NTC 8 Paziente 2 8 Paziente ….

► Usare I guanti; non toccare la superficie ottica della copertura delle strip.

1 Sigillare la strip.

2 Centrifugare la strip per eliminare bolle d’aria.

3 Posizionare la strip nell’adattatore e inserirlo nello strumento.

4 Avviare la seduta.

6.6 Conservazione e stabilità dei componenti risospesi

LightCycler® FastStart DNA Master HybProbe: la miscela dei prodotti 1a + 1b va conservata refrigerata (4°C - 8°C) per 30 giorni.

Controllo Positivo: il Controllo positivo sciolto è stabile per 30 giorni se conser- vato refrigerato (4°C-8°C).

Miscela di reazione / strip pronte all’uso: Le strip caricate con la miscela di reazione possono essere conservate fino a 6 ore prima di essere amplificate, se opportunamente sigillate e mantenute refrigerate (4°C - 8°C) al riparo dalla luce.

Strip: Estratte dalla confezione, le strip sigillate con l’apposito foglio di alluminio sono stabili per 30 giorni se mantenute refrigerate (4°C - 8°C) al riparo dalla luce.

7. Analisi dei dati e interpretazione 7.1 Limiti ed interferenze

Il presente test è specifico per i target descritti.

Non sono note particolari interferenze.

7.2 Calibrazione

La calibrazione deve essere eseguita seguendo le procedure descritte nei para- grafi 6.3.1, 6.3.2, 6.5, 7.3.1, 7.3.2 and 7.6.

7.3 Controllo di Qualità – Criteri di accettabilità

Allo scopo di garantire affidabilità all’analisi di genotipizzazione, è essenziale che vengano inclusi in ogni seduta sia il controllo negativo NTC sia il Controllo Positi- vo HT.

NOTA: L’amplificazione viene eseguita ad una temperature di annealing pari a 60ºC; a tale temperatura, le sonde non sono legate saldamente all’amplicone, pertanto l’amplificazione sembra scarsa o assente. Per questo motivo, i criteri di accettabilità sono basati esclusivamente sulla defini- zione dei profili delle curve di melting come riportato di seguito.

7.3.1 Controllo positivo HT

Il Controllo positivo HT simula un campione biologico eterozigote per tutti i po- limorfismi analizzati. ( vedere 7.6).

L’analisi della curva di melting, “Tm-Calling”, deve sempre mostrare due picchi di melting per ciascun SNP.

Le temperature di melting attese sono descritte nella tabella 7 (capitolo 7.6).

I valori delle curve di melting possono variare di ±2.5°C fra le diverse sedute.

La differenza tra i picchi di melting di genotipi eterozigoti può variare di ±1.5°C fra le diverse sedute.

Se il controllo positivo HT non presenta due picchi di melting per ogni SNP ana- lizzato, la corsa non è valida e la procedura deve essere ripetuta.

7.3.2 Controllo negativo

L’analisi della curva di melting del controllo negativo, NTC, deve sempre fornire un risultato negativo: non deve essere rilevato nessun picco di melting alle tem- perature attese dal presente kit (vedere 7.6).

Nel caso in cui il NTC dovesse mostrare uno o entrambi i picchi specifici (atten- zione: la scala automatica potrebbe mostrare picchi derivanti dal rumore di fon- do, analizzare sempre il NTC insieme ai campioni), si è verificata una contami- nazione o un errore di aliquotazione; la seduta non è valida e l’intera procedura deve essere ripetuta. Se il problema persiste, cambiare l’acqua e/o i reagenti e ripetere. Non esitare a contattare per assistenza [email protected].

_____________________________________________________________________________________________________________________________ ______________________

7.3.3 Campioni

Il risultato del presente test deve sempre mostrare uno o due picchi di melting.

Non sono previsti più di due picchi per ogni campione.

I profili di melting devono essere conformi ai criteri di accettabilità descritti in questo capitolo e nel capitoli 7.6 Interpretazione dei Risultati. Diversamente, la seduta non è valida e l’intera procedura deve essere ripetuta (preparazione dei campioni, amplificazione e identificazione). Vedere anche 7.7 Picchi di melting per varianti rare.

Prima di ripetere una seduta valutare errori banali quali ad esempio errori nel profilo termico, nella miscela di reazione o nella concentra- zione di MgCl2 usata; anche la non corretta conservazione dei reagen- ti può provocare il fallimento del test.

7.3.4 Anomalie nelle curve di melting

Varianti rare che producono picchi di melting inattesi sono descritti nel paragrafo 7.7 Picchi di melting per varianti rare.

Anomalie nelle curve di “melting” possono essere causate da un difetto nel pro- dotto o da mutazioni ignote nella zona di legame della sonda. In quest’ultimo ca- so, eseguire l’analisi con un altro metodo per paragonare / verificare i risultati.

Sequenziare il prodotto di PCR per confermare la sequenza o identificare muta- zioni ignote. Si raccomanda di segnalare tali eventi al nostro supporto tecnico [email protected].

Non esitare a inviare ai nostri laboratori i campioni che presentano curve di mel- ting devianti per confermare i risultati ottenuti e/o identificare altre mutazioni tra- mite sequenziamento.

7.5 Analisi dei risultati

Eseguire l’analisi dei risultati come descritto nel manuale d’uso degli strumenti LightCycler^.

7.5.1 Canali di rilevamento

Strumento Selezionare il canale

LightCycler^® 480 483-533

LightCycler^® 480 II 465-510

cobas z480 465-510

LightCycler^® 96 470/514 FAM

Tab. 6: Canali di rilevamento

7.5.2 Dati tipici di amplificazione

Le curve di amplificazione non contengono alcuna informazione analitica

A seconda del genotipo specifico di ciascun campione e dalla struttura della sonda l’amplificazione potrebbe non essere visibile (vedere 7.3).

7.5.3 Analisi della curva di melting: LightCycler

480

I picchi della curva di melting (Fig. 1) permettono di discriminare tra i genotipi wild type, mutato ed eterozigote.

Visualizzare I dati della curva di melting in modalità “Tm-Calling”:

Colore Gene

1 Blu rs3918290 DPYD*2A 2 Rosso rs55886062 DPYD*13 3 Verde rs67376798

4 Arancio rs75017182 IVS10

5 Blu rs3918290 DPYD*2A 6 Rosso rs55886062 DPYD*13 7 Verde rs67376798

8 Arancio rs75017182 IVS10

Fig. 1: Risultati tipici dei Controlli positivi (posizioni 1-4, ) e del Controllo negativo (posizioni 5-8).

Note: I valori delle rispettive curve di melting (Tm) possono variare di ±2.5°C fra le diverse sedute.

Il T tra i picchi di melting di genotipi eterozigoti può variare di ±1.5°C.

In caso di variazioni vedere paragrafi:

7.7 Picchi di melting di varianti rare 7.3.5 Curve di melting anomale

_____________________________________________________________________________________________________________________________ ______________________

7.5.4 Analisi della curva di melting: LightCycler

96

I picchi della curva di melting (Fig. 2) permettono di discriminare tra i genotipi wild type, mutato ed eterozigote.

Aggiungere un’analisi: Tm Calling Visualizzare i risultati in: Melting peak

Selezionare i picchi tramite l’uso dello strumento: Area marker tool

Nota: Con lo strumento LightCycler^® 96 è necessario evidenziare manualmente la regione del picco di melting in cui il software deve eseguire l’analisi; se il picco non è contenuto nel box costruito con lo strumento “Area Marker tool” il software non calcola il valore di Tm.

Analizzare le curve di melting di ogni campione biologico paragonandole con quelle prodotte dai Controlli positivi, secondo le indicazioni fornite nel capitolo 7.6 Interpretazione dei risultati.

Color Gene

1 Blu rs3918290 DPYD*2A 2 Rosso rs55886062 DPYD*13 3 Verde rs67376798

4 Arancio rs75017182 IVS10 5 Blu rs3918290 DPYD*2A 6 Rosso rs55886062 DPYD*13 7 Verde rs67376798

8 Arancio rs75017182 IVS10

Fig. 2: Risultati tipici dei Controlli positivi (posizioni 1-4) e del Controllo negativo (posizioni 5-8).

Note: I valori delle rispettive curve di melting (Tm) possono variare di ±2.5°C fra le diverse sedute.

Il T tra i picchi di melting di genotipi eterozigoti può variare di ±1.5°C.

In caso di variazioni vedere paragrafi:

7.7 Picchi di melting di varianti rare 7.3.5 Curve di melting anomale

7.6. Interpretazione dei risultati

Dopo la validazione della seduta (vedere 7.3.1 e 7.3.2) selezionare una strip alla volta e comparare le temperature ottenute con I valori attesi descritti di seguito.

Una strip contiene 2 duplicati dei 4 SNP analizzati a partire dal foro asimmetrico.

Legenda colori WildType Eterozigote

Mutato

Picco di sini-

stra Due picchi Picco di destra 1 rs3918290

DPYD*2A

GG 50°C WildType

 7°C Eterozigote

AA 57°C Mutato 2 rs55886062

DPYD*13

CC 58°C Mutant

 7°C Eterozigote

AA 65°C WildType 3 rs67376798 TT 60°C

WildType

 4°C Eterozigote

AA 64°C Mutato 4 rs75017182

IVS10

CC 55°C WildType

 8°C Eterozigote

GG 64°C Mutant 5 rs3918290

DPYD*2A

GG 50°C WildType

 7°C Eterozigote

AA 57°C Mutato 6 rs55886062

DPYD*13

CC 58°C Mutant

 7°C Eterozigote

AA 65°C WildType 7 rs67376798 TT 60°C

WildType

 4°C Eterozigote

AA 64°C Mutato 8 rs75017182

IVS10

CC 55°C WildType

 8°C Eterozigote

GG 64°C Mutato

Tab. 7 Analisi dei risultati

Note: I valori delle rispettive curve di melting (Tm) possono variare di ±2.5°C fra le diverse se- dute. Il T tra i picchi di melting di genotipi eterozigoti può variare di ±1.5°C.

Il picco di destra è prodotto dall’accoppiamento perfetto tra la sonda e l’amplicone; le sonde sono state selezionate per ottenere la massima distanza tra i due picchi (eterozigoti) e non in conformità alla condizione genotipica.

In caso di variazioni vedere paragrafi:

7.7 Picchi di melting di varianti rare 7.3.5 Curve di melting anomale

Temperature dei picchi di melting (°C)

50 50/57 50 50 50 50/57 50/57 50/57 50 50 50 57 any any any 65 65 58/65 65 65 58/65 65 65 58/65 58/65 65 any 58 any any 60 60 60 60/64 60 60 60/64 60 60/64 60 60/64 any any 64 any 55 55 55 55 55/64 55 55 58/64 55 58/64 58/64 any any any 64

WT Singolo eterozigote : Dose ridotta

Eterozigote composto : Usare farmaco alternativo

Omozigote mutato : Usare farmaco alterna-

tivo Tab. 8 Possibili combinazioni delle temperature dei picchi di melting

_____________________________________________________________________________________________________________________________ ______________________

7.7. Picchi di melting di varianti rare

Utilizzando target sintetici sono state analizzate le temperature di melting di tutti gli SNP posizionati sotto le sonde (NCBI 01/01/2015).

1)

3)

rs3918289 (C) MAF: NA

rs3918289 (A) MAF: C=0.0002/1 rs373620536 MAF: NA

rs200296941 MAF: C=0.0002/1 rs72549303 MAF: NA

rs17376848 MAF: G=0.0521/261

rs3918290 MAF: T=0.0030/15

rs372307932 MAF: NA

rs559276319 MAF: G=0.0002/1

rs67376798 MAF: A=0.0022/11

2)

4)

rs55886062 [C] MAF: C=0.0002/1

rs201615754 MAF: NA

rs55886062 [A] MAF: NA

rs560870284 MAF: T=0.0002/1

rs75017182 MAF: C=0.0096/48 MAF: Minor Allele Frequency. NA= Not Available

Questo prodotto identifica solamente gli SNP descritti nel capitolo 1.2. Un utilizzatore esperto, riconoscendo eventuali deviazioni delle curve di mel- ting rispetto a quelle descritte, deve confermare i risultati con metodi al- ternativi.

8. Troubleshooting

Problema Possibile causa Soluzione

Tutti i campioni risultano negativi

Scorretta selezione del canale di let- tura

Selezionare il canale di lettura cor- retto

Errato profilo termico Controllare profilo termico

Linea di base non omogenea tra i vari campioni

Errore nella pipettata Verificare omogeneità delle quantità utilizzate per ogni campione

Miscela di reazione non omogenea

Mescolare la miscela di reazione pi- pettando 10 volte con un puntale puli- to da 200µl prima di distribuirla Piastra non ben sigillata Assicurarsi di aver sigillato la piastra Linea di base a

“dente di sega””” Contenuto della piastra non omoge- neo

Centrifugare la piastra prima di inse- rirla nello strumento

Assenza di segnale nel controllo positi-

vo

Errore nell’allestimento della seduta Controllare che la posizione del con- trollo positivo sia quella corretta Errata concentrazione dei PSR o

MgCl2 Ripetere la seduta

Degradazione del controllo positivo o degli standard

Usare una aliquota nuova del controllo positivo o degli standard

Presenza di Se- gnale nel Controllo

Negativo NTC

Errore nel settaggio dello strumento Controllare la posizione del controllo negativo nel settaggio dei campioni

Errore nel dispensare i campioni

Rispettare l’ordine dei campioni come descritto: Controllo Positivo, NTC

e campioni.

Cambiare il puntale tra i campioni Evitare gocciolamenti dalle provette dei campioni

Contaminazione nell’acqua Usare una nuova aliquota Contaminazione nel MgCl2 Usare una nuova aliquota Contaminazione nell’enzima Usare una nuova aliquota

Contaminazione degli ambienti dove si svolgono l’estrazione del campione o la preparazione della PCR

Pulire superfici e strumenti con deter- genti a base d’acqua, lavare i camici, sostituire provette e puntali in uso Trattare la miscela di reazione con l’enzima LightCycler^® Uracil-DNA Glycosylase come da istruzioni in- cluse (Cat.-No.03.539.806.001)

Assenza di segnale nei campioni

Scarsa quantità di DNA Controllare la concentrazione di DNA nei campioni

Inibitori della reazione di PCR nel campione

Diluire il campione e ripetere la PCR, o ripetere l’estrazione e la PCR, o aggiungere un Controllo Positivo e ripetere la seduta

Inattese tempera- ture dei picchi di melting

Picchi concordi con il Controllo Posi- tivo: errata concentrazione dei rea- genti

Analizzare manualmente i campioni con l’ausilio del Controllo Positivo.

Picchi discordi rispetto al Controllo Positivo: possibile inibitore derivante dall’estrazione

Ripetere la PCR diluendo il campio- ne 1:3.

Picchi discordi rispetto al Controllo Positivo: possibile presenza di altre mutazioni

Ripetere la seduta e sequenziare il prodotto di PCR; riportare le varianti inattese a Service@tib molbiol.de

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9. Riferimenti

1) Wei X1, Elizondo G, Sapone A, McLeod HL, Raunio H, Fernandez-Salguero P, Gonzalez FJ.

Characterization of the human dihydropyrimidine dehydrogenase gene.

Genomics. 1998 Aug 1;51(3):391-400.

2) Caroline F. Thorn, Sharon Marsh, Michelle Whirl Carrillo, Howard L. McLeod, Teri E. Klein and Russ B. Altman

PharmGKB summary: fluoropyrimidine pathways Pharmacogenet Genomics 2011 April ; 21(4): 237–242.

3) KE Caudle, CF Thorn, TE Klein, JJ Swen, HL McLeod, RB Diasio, and M Schwab

Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium Guidelines for Dihydropyrimidine De- hydrogenase Genotype and Fluoropyrimidine Dosing

Clin Pharmacol Ther. 2013 Dec;94(6):640-5

http://www.pharmgkb.org/guideline/PA166109594

4) Johanna Sistonen, Chingying Smith, Yung-Kang Fu, Carlo R. Largiadèr

A new DPYD genotyping assay for improving the safety of 5-fluorouracil therapy Clinica Chimica Acta 414 (2012) 109–111

5) Steven M. Offer, Adam M. Lee, Lori K. Mattison, Croix Fossum, Natalie J. Wegner, and Robert B.

Diasio

A DPYD variant (Y186C) in individuals of African ancestry associated with reduced DPD enzyme activity

Clin Pharmacol Ther. 2013 July ; 94(1)

Classificazione / Riferimenti

N° Nome del gene COSMIC Mutazione AA Mutazione CDS EDMA EAN

1 DPYD non (Intron) c.1905+1G>A 16 01 01 90 00

2 DPYD p.I560S c.1679T>G 16 01 01 90 00

3 DPYD p.D949V c.2846A>T 16 01 01 90 00

4 DPYD non (Intron) c.1129-5923C>G 16 01 04 90 00

5

6

7

8

CPV 33694000-1

Roche Italy SAP No. 07421664001

Avviso all’acquirente – Brevetti e Marchi Registrati

Acquistando il presente prodotto si acquisisce il diritto all'uso dello stesso per le finalità di am- plificazione e rilevamento delle sequenze di acido nucleico a scopo diagnostico in vitro su campioni di origine umana. Non si acquisisce tuttavia nessun'altra licenza di nessun tipo, ad eccezione del suddetto diritto, specifico all'uso, derivante dall'acquisto

Ove non espressamente dichiarato, TIB MOLBIOL non rilascia alcuna garanzia che il kit o il relativo uso non violi i diritti di terze parti.

LightCycler®, MagNA® Pure e High Pure® sono marchi registrati di Roche Diagnostics.

ABI 3730xl Genetic Analyzer e Sequencing Analysis sono prodotti registrati di Applera.

Le SimpleProbe^® sono prodotti sotto licenza di Roche Diagnostics.

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Scheda di Sicurezza

Secondo le direttive di OSHA 29CFR1910.1200, Commonwealth of Australia [NOHSC:1005, 1008 (1999)] e le Direttive dell’Unione Europea 67/548/EC e 1999/45/EC per qualunque prodotto che contenga non più dell’1% di un compo- nente classificato come pericoloso o cancerogeno non è richiesta una scheda di sicurezza.

Il presente prodotto non è pericoloso, tossico e non è soggetto a restrizioni IATA.

Il prodotto non contiene derivati umani, animali o vegetali. Il prodotto contiene oligonucleotidi di origine sintetica, definiti Primer e Sonde.

Note di rilascio

Nota: in rosso variazioni che richiedono modifiche alle procedure di laboratorio.

Nota: in blu migliorie o cambiamenti nella composizione dei reagenti.

Versione Modifiche Data

V140309 Rilascio prima versione. 07-03-2014

V150220 Sostituzione dell’ rs115232898 con rs75017182.

Chiarificazione circa la stabilità dei componenti. 12-02-2015 V160121 Correzione genotipo WT del rs75017182 in Tab. 7 e

temperature in Tab. 8. 21-01-2016

Produced by:

TIB MOLBIOL Syntheselabor GmbH Eresburgstrasse 22-23

12103 Berlin, Germany www.tib-molbiol.com

4260159332704