55 PAZIENTI E METODI
Sono stati studiati 12 pazienti ( 9 femmine e 3 maschi tra i 17 e i 48 anni, età media 26) con positività sierologica oltre 10 volte il cut-off per anticorpi anti tTG e positività anti endomisio (EMA); 12 pazienti (9 femmine e 3 maschi tra i 18 e i 45 anni, età media 24) celiaci a dieta aglutinata da almeno 1 anno in cui la compliance alla dieta era stata accertata mediante un’attenta anamnesi alimentare ed il riscontro della negativizzazione sierologica; la popolazione di controllo era costituita da 9 pazienti sottoposti ad endoscopia superiore per sintomi compatibili con RGE con anamnesi negativa per patologie gastrointestinali e EMA e tTG negatività.
Ogni paziente, previo consenso informato, è stato sottoposto ad EGDS con prelievo di 12-14 biopsie del duodeno discendente, di cui 4 sono state conservate in formalina per l’esame istologico, e le rimanenti in Hank’s privo di Ca++ e Mg++ addizionato con penicillina, streptomicina e gentamicina ( Pen / Strep, SIGMA-ALDRICH ) per l’isolamento dei linfociti della mucosa (LPMC- Lamina Propria Mononuclear Cells).
Da ogni paziente sono stati inoltre prelevati 10 cc di sangue per l’isolamento dei linfociti periferici (PBMC-Periferical Blood Mononuclear Cells).
Esame istologico
I prelievi bioptici sono stati sottoposti ad esame istologico con i seguenti risultati:
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- per i pazienti con positività sierologica specifica per malattia celiaca è stato documentato un quadro di atrofia villosa ( grado da 3A a 3C secondo Marsh-Oberhuber, grado 3B secondo Corazza-Villanacci) - per i 12 pazienti celiaci a dieta aglutinata il referto istologico ha evidenziato normale trofismo villoso con aumento dei linfociti intraepiteliali (IEL) (grado 1 secondo classificazione di Marsh-Oberhuber)
- per i pazienti costituenti il gruppo di controllo è stato evidenziato un aspetto istologico della mucosa duodenale nella norma per 6 soggetti ed un aumento dei linfociti intraepiteliali in 3. Ricordiamo che la linfocitosi intraepiteliale è un dato alquanto aspecifico presente in un elevato numero di condizioni, compreso il reflusso gastro-esofageo.
Isolamento PBMC
Dopo diluizione 1:2 in soluzione Hank’s, il sangue è stato distribuito in provette da 15 cc e centrifugato in gradiente di Ficoll per 40 minuti a 400 g/min a 22-24 °C. Dopo la raccolta, le PBMC sono state lavate in soluzione Hank’s e risospese in terreno (soluzione RPMI- Bio Whittaker Europe, Fetal Calf Serum- Sigma Aldrich, L-glutamina- Bio Whittaker Europe, Hepes Buffer- Bio Whittaker Europe, Pen-Strep- Bio Whittaker Europe) fino al momento dello staining in immunofluorescenza.
Isolamento LPMC
Dopo incubazione di 5 minuti a temperatura ambiente in DTT (Ditiotreitolo) allo scopo di rimuovere il muco, le biopsie sono state lavate in soluzione tampone (PBS- Cambrex Bio Science) e incubate
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per 15 minuti a temperatura ambiente in EDTA per rimuovere lo strato di cellule epiteliali. Successivamente, dopo frammentazione meccanica manuale, sono state sottoposte ad un’incubazione di 90 minuti in collagenasi (Sigma-Aldrich) alla concentrazione di 25 U/ml di terreno a 37°C e in atmosfera umida contenente il 5% di CO2 ed in DNAasi (Roche Diagnostic SpA) alla dose di 100 microlitri/10 ml. Il tessuto è stato quindi passato attraverso filtri Millipore (Bioclass) allo scopo di separare i detriti dalle cellule; le LPMC sono state successivamente isolate mediante centrifugazione in gradiente di Percoll (Sigma-Aldrich) per 25 minuti a temperatura ambiente. Dopo la raccolta sono state risospese in terreno fino al momento dello staining in immunofluorescenza.
Immunofluorescenza
I linfociti isolati sia dal sangue periferico sia dalla lamina propria sono stati sottoposti ad immunofluorescenza per la valutazione dell’espressione dei seguenti markers di superficie: CD4, CD25, LAP (latency-associated peptide). E’ stata inoltre valutata l’espressione intracellulare del marker di regolazione Forkhead box P3 (Foxp3). Per lo staining sono stati impiegati i seguenti anticorpi: Anti-human CD4 PerCP (BD Pharmingen), anti-human CD25 PE (BD Pharmingen), anti human LAP APC (R&D), anti human Foxp3 FITC (eBioscience). Per i rispettivi isotipi, allo scopo di impedire uno staining aspecifico da parte degli anticorpi fluorescenti, sono stati impiegati IgG1 PerCP (BD Pharmingen), IgG1 PE (BD Pharmingen) di topo, IgG1 APC (R&D) di capra, IgG1 FITC (eBioscience) di ratto.
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L’anti-human LAP, essendo un anticorpo indiretto, è stato successivamente coniugato con streptavidina (BD Pharmingen).
Le PBMC e le LPMC sono state contate e ridistribuite in provette da 5cc (1x1000000/provetta). Dopo un lavaggio in PBS+FCS al 2%, è stato effettuato lo staining anti LAP e rispettivo isotipo mediante incubazione per per 30 minuti a 4°C; successivamente, dopo lavaggio con PBS le cellule son state incubate per 30 minuti a 4 °C con anti CD4 e anti CD25 e rispettivi isotipi. Infine, è stata aggiunta streptavidina APC per lo staining indiretto del LAP.
Dopo lavaggio in PBS, le cellule sono state risospese ed incubate per 45 minuti a 4°C con soluzione fissante e permeabilizzante (Cytofix-Cytoperm- eBioscience). Le cellule sono state pertanto centrifugate e nuovamente lavate con apposito tampone permeabilizzante (Permeabilization Buffer- eBioscience). E’ stato quindi effettuata incubazione con Anti-human Foxp3 e rispettivo isotipo per 30 minuti a 4°C. Le PBMC e le LPMC sono state a questo punto lavate in buffer permeabilizzante e risospese fino all’analisi al citofluorimetro (FACSCalibur BD Bioscience, San Jose, CA).
Analisi statistica
I risultati sono stati espressi come valore medio la deviazione standard. Le differenze tra gruppi sono state analizzate utilizzando l’analisi multivariata della varianza (MANOVA)
