NUOVI INIBITORI DELLA TIROSINCHINASI EGFR:

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Introduzione alla parte sperimentale

NUOVI INIBITORI DELLA TIROSINCHINASI EGFR:

PROGETTAZIONE E SINTESI CHIMICA

L’attività di EGFR ha inizio con il legame del fattore di crescita sulla regione extracellulare del recettore; questa interazione stimola la fosforilazione della tirosina nel dominio intracellulare del recettore attraverso il legame con l’ATP, attivando la cascata di trasduzione del segnale.

Gli inibitori della tirosin-chinasi che agiscono a livello del dominio intracellulare sono composti di piccole dimensioni, permeabili alle membrane, che bloccano o competono con il legame dell’ATP agendo sul sito catalitico, impedendo così la fosforilazione dei residui di tirosina.

Il sito catalitico delle chinasi consiste di due domini separati da una profonda fessura, dove trova alloggio la molecola di ATP. Il dominio N-terminale più piccolo contiene il sito di legame dell’ATP ed è principalmente costituito da un β-filamento antiparallelo e da un’α-elica. Il più grande dominio C-terminale ha una struttura prevalentemente elicoidale e funzionalmente presiede alla catalisi.

²⁴

Concettualmente il sito di legame dell’ATP può essere suddiviso in cinque regioni (Figura 13):

• Regione dell’adenina: regione idrofobica che accoglie l’anello purinico dell’ATP, il quale unisce i due lobi mediante la formazione di due legami ad idrogeno con la catena polipeptidica. Questi vedono coinvolti l’atomo di azoto N

1

e il gruppo amminico in posizione 6, che si comportano rispettivamente da accettore e donatore di idrogeno. Questa regione è anche chiamata regione

“cerniera”. In aggiunta a queste interazioni polari, l’anello purinico forma anche delle interazioni non polari con residui idrofobici localizzati a livello dell’N e del C terminale. La regione di binding dell’adenina non è caratterizzata da grande variabilità amminoacidica e perciò l’interazione con questo sito non fornisce molti elementi utili per ottenere selettività verso specifiche proteinchinasi.

• Regione dello zucchero: in questa regione trova alloggio la porzione

ribosidica della molecola di ATP, il cui gruppo 2′-OH forma un legame a

idrogeno con un residuo polare posizionato all’inizio del lobo C-terminale.

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• Regione del fosfato: questa regione accoglie il gruppo trifosfato ed è principalmente costituita da un loop flessibile ricco di glicina, e da una struttura ad α-elica che orienta correttamente il gruppo fosfato dell’ATP per la catalisi.

Nella maggior parte delle strutture cristalline ATP-chinasiche ritroviamo un legame a idrogeno tra il gruppo fosfato α e β dell’ATP e un residuo di lisina. Il gruppo fosfato γ interagisce, invece, con un residuo di arginina.

• Regione nascosta e regione accessibile al solvente: L’ATP non occupa queste due regioni, a livello delle quali vengono identificate le più significative differenze strutturali e sequenziali tra i componenti della superfamiglia delle chinasi. La regione nascosta consiste in una tasca lipofila di forma e dimensioni variabili, opposta alla regione dello zucchero.

Le dimensioni della regione accessibile al solvente dipendono, invece, dall’assenza o dalla presenza di un residuo di glicina, che può causare una variazione conformazionale della proteina tra la regione cerniera e la porzione iniziale del loop C-terminale.

^24,25

Figura 13. Struttura tridimensionale del sito attivo suddiviso in regioni: regione adeninica (azzurro), regione dello zucchero (verde), regione del fosfato (magenta), regione nascosta (viola), regione accessibile al solvente (gialla).

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Tra gli elementi strutturali importanti all’interno del sito di interazione dell’ATP di EGFR emergono residui amminoacidici, alcuni dei quali comuni a tutte le tirosin chinasi.

²⁶

I legami a idrogeno per 6-NH

2

e N

1

dell’adenina interesserebbero rispettivamente un residuo carbonilico di Gln767 e Met769. Un terzo legame a idrogeno coinvolgerebbe N

7

dell’adenina e il gruppo ossidrilico di Thr830. Interazioni non polari avvengono tra la purina e gli amminoacidi Val702, Ala719 e Leu768, che fanno parte di una regione ricca di glicina. Il ribosio e il gruppo trifosfato si estendono verso l’apertura della fessura in cui avviene la fosforilazione. Il ribosio può formare con 2

^'

-OH un legame a idrogeno con Cys773, sia direttamente, sia indirettamente, attraverso una molecola d’acqua. Nonostante l’alto grado di omologia, ci sono alcune differenze significative riguardo ad alcuni amminoacidi nel sito di legame dell’ATP di EGFR, se paragonato ad altre tirosin chinasi.

²⁶

L’ingresso della tasca di binding, che comprende il residuo di Cys773, è più idrofobico rispetto a quello di altre chinasi. Il sito di legame per ATP di EGFR contiene anche altri tre amminoacidi solforati (Cys751, Met769, Met742) e, in particolare, il residuo Cys751 è presente solo su EGFR e fa parte della tasca idrofobica adiacente alla tasca dell’ATP. Questa tasca è presente in altre tirosin chinasi ma in queste è meno profonda, per la presenza di valina al posto di Cys751.

Nella tasca di binding di EGFR è presente inoltre il residuo di Thr766, che sembra essere un importante centro di interazione per gli inibitori dell’enzima.

²⁵

Il design di nuovi inibitori ATP-competitivi selettivi verso una sola o un gruppo di proteinchinasi si è presentato sin dai primi studi come un obiettivo difficile, a causa delle somiglianze del sito di binding all’interno della famiglia delle chinasi. Nonostante questo, sono stati riportati in letteratura numerosi potenti inibitori con un grado accettabile di selettività.

Tra questi, composti chimicamente eterogenei, rappresentati sia da molecole di origine naturale cha da eterocicli ottenuti per sintesi chimica, si sono dimostrati capaci di inibire l’attività tirosinchinasica di EGFR.

Nel corso delle prime ricerche svolte in questo ambito, tra i prodotti di origine

naturale si sono rivelati efficaci inibitori dell’EGFR tirosina chinasi Quercetina e

Genisteina.

^27,28

Essi mostrano proprietà inibitorie in concentrazione micromolare nei

(4)

confronti di una elevata gamma di proteine chinasi e possiedono pertanto una scarsa specificità.

O O OH

HO OH

O O

HO OH

OH OH OH

Quercetina Genisteina

La quercetina è un bioflavonoide presente sia in forma libera che in forma coniugata in molti frutti e vegetali, in vitro è in grado di inibire la crescita e la proliferazione delle cellule maligne, la glicolisi aerobica delle cellule di ascite di Erlich e la fosforilazione dell’oncogéne src del virus del sarcoma di Rous;

²⁷

src è un esempio di oncogéne virale in grado di indurre lo sviluppo del tumore nella cellula ospite attraverso la codificazione della fosfoproteina di PM 60000 denominata pp60

^v-src

.

La genisteina, isoflavone presente soprattutto nella soia, è un potente inibitore delle tirosinchinasi: blocca l’autofosforilazione di EGFR (IC

₅₀

2.6µM), la chinasi src (IC

₅₀

26µM) ed altre tirosinchinasi.

²⁸

La prima importante classe di derivati eterociclici di sintesi studiata è quella delle anilinochinazoline, di cui PD 153035 (Parke-Davis Pharmaceutical Research), scoperto nel 1994, rappresentò il composto con la massima attività sino ad allora mai registrata:

infatti inibisce selettivamente l’EGFR con una IC

₅₀

di 5pM e blocca altre tirosinchinasi

solo a concentrazioni più alte, intorno a 50µM. PD 153035 impedisce

l’autofosforilarione del recettore nei fibroblasti e nel carcinoma delle cellule

epidermiche umane e blocca alcuni processi cellulari come la mitogenesi, la sovra-

espressione genica e la trasformazione oncogenica.

²⁹

(5)

N N NH Br

O O

PD 153 035

Sulla base della struttura di questa molecola attiva è stata sviluppata un’altra serie di composti con gruppi funzionali simili in grado di effettuare le stesse interazioni con il recettore e mantenere quindi un’azione equivalente. I requisiti strutturali identificati all’interno di questa classe sono: la presenza di sostituenti elettrondonatori nelle posizioni 6 e 7 della chinazolina; un piccolo sostituente lipofilo (un alogeno) nella posizione meta dell’anilina; un gruppo NH libero nella posizione 4 e gruppi CH liberi nelle posizioni 2, 5, 8. Tra queste nuove molecole di sintesi ha ricoperto particolare rilievo ZD1839 (AstraZeneca),

³⁰

un derivato anilinochinazolinico, primo ad essere approvato nel 2003 dalla FDA, con il nome di Gefitinib, per il trattamento del cancro al polmone non a piccole cellule (NSCLC). L’attività di ZD1839 su EGFR in vitro è 23nM, inferiore quindi rispetto a quella manifestata da PD153035, tuttavia le buone caratteristiche di biodisponibilità e la capacità di indurre marcate regressioni in alcuni tumori hanno portato alla scelta di candidare questa molecola allo sviluppo come farmaco. Infatti, allo scopo di migliorare l’attività in vivo sono state operate modifiche dei gruppi metossilici: in particolare, è stato introdotto un gruppo amminico per conferire proprietà fisiche di basicità, lipofilicità e solubilità. Inoltre, l’introduzione di un atomo di fluoro in posizione para conferisce alla molecola maggior stabilità metabolica.

³⁰

N N NH F

Cl

O N

O

Gefitinib

(6)

Erlotinib (OSI774, OSI/Genentech, Tarceva

^®

)

¹⁷

, Lapatinib (GW572016, Glaxo- Smith-Kline)

¹⁸

, e Canertinib (CI 1033, Pfizer)

²⁰

sono altri derivati 4-anilinochinazolinici con potente attività di inibizione nei confronti di questa tirosin chinasi. I valori di IC

50

dei tre derivati sono di ordine nanomolare.

Mentre Erlotinib è piuttosto selettivo per EGFR e necessita di concentrazioni di un ordine di grandezza superiore per l’inibizione di HER-2, Lapatinib è attivo su entrambi con valori di IC

50

comparabili. Per Canertinib

²⁰

è stata riscontrata attività verso EGFR, HER2, HER3. Da un punto di vista strutturale, Canertinib è caratterizzato dalla presenza di una catena acrilammidica in posizione 6. Ha mostrato un’attività di inibizione dell’autofosforilazione di EGFR a concentrazione 7.4 nM e di HER2 a concentrazione 9nM, rispettivamente. La sua azione è ATP-competitiva irreversibile poiché è in grado di legare covalentemente il residuo di cisteina 773 posto all’ingresso del dominio dell’ATP. Per quello che riguarda le caratteristiche di biodisponibilità, sono conservati i due elementi strutturali di Gefitinib, cioè il gruppo morfolinico e il fluoro in posizione para dell’anilina.

²⁰

N N C NH

O O

CH

Erlotinib

N N Cl NH

O CH₂NHCH₂CH₂SO₂CH₃ F O

Lapatinib

(7)

N N NH F

Cl

NHCOCH=CH₂

O N

O

Canertinib

Erlotinib è stato approvato come farmaco per il trattamento di NSCLC e di tumori pancreatici, Lapatibib e Canertinib sono in fase di sperimentazione clinica.

Nell’ambito della stessa classe strutturale, opportune modifiche dei sostituenti hanno portato ad individuare ZD6474 (AstraZeneca), Vandetanib, attivo principalmente su VEGFR-2 e solo in minor misura su EGFR.

³¹

Attualmente Vandetanib è in sperimentazione clinica, in quanto saggi in vivo ne hanno evidenziato la capacità di inibire, in modo dose-dipendente, la crescita di un ampio spettro di tumori.

N N

NH

Br F

O

N CH₃

Vandetanib

Parallelamente ai derivati chinazolinici come Gefitinib sono stati sintetizzati composti

con nucleo diverso, tra cui le pirido[3,4-d]pirimidine che possono essere considerati gli

aza-derivati dei primi. Tra questi il composto lead è PD158780, in cui è il sostituente

metilamminico in posizione 7 a svolgere il ruolo di elettrondonatore che conferisce

maggiore attività alla molecola.

³²

(8)

N

N N

NH

NH Br

PD 158 780

Infatti PD158780 inibisce il recettore con una IC

50

di 0.006 nM. Inoltre studi di SAR suggeriscono che la sostituzione con un gruppo 3-bromofenilamminico in posizione 4 favorisce l’interazione col recettore sia nella serie delle chinazoline che in quella delle pirido[4,3-d]pirimidine.

³²

E’ stata identificata un’altra interessante classe di inibitori di EGFR a struttura non chinazolinica, quella delle pirrolo[2,3-d]pirimidine, che comprende CGP59326 (CIBA Pharmaceutical Division), con IC

₅₀

di 0.027 µM.

³³

N N NH Cl

NH

CGP 59 326

Le SAR della serie a cui CGP59326 appartiene hanno evidenziato ancora una volta una preferenza per la sostituzione con un atomo di alogeno nella posizione 3 del gruppo anilinico; altro requisito emerso è l’influenza favorevole di sostituenti ingombranti nelle posizioni 5 e 6.

³³

Gli stessi Autori della sintesi di CGP59326, proseguendo la ricerca sugli inibitori

delle tirosinchinasi EGFR hanno decritto successivamente derivati molto attivi,

rappresentati dalla formula generale 1, contenenti il nucleo pirazolo[3,4-

d]pirimidinico

³⁴

, che sono stati progettati a partire da studi di relazioni struttura attività

sui composti 2 e 3 (Figure 14 e 15).

(9)

N H N N

N NH R

HN R₁

1 Il composto 2 è rappresentato in rosso nella Figura 14 in sovrapposizione con l’ATP (giallo). Quest’ultimo è ancorato al sito attivo dell’enzima attraverso due legami a idrogeno che interessano il gruppo amminico e l’azoto N

₁

dell’adenina, evidenziando nuovamente che per l’interazione con il sito di legame è fondamentale la presenza di un anello eterociclico che mimi l’adenina e che sia in grado di instaurare legami a idrogeno attraverso un sistema costituito da un donatore ed un accettore con la catena polipepdidica, in modo da ancorarsi perfettamente al sito catalitico.

^33,34

Nel caso del composto 2, il sistema donatore-accettore di legame a idrogeno è rappresentato dal gruppo amminico in posizione 4 del sistema pirazolo pirimidinico e dall’atomo di azoto N

5

(Figura 14).

Allo scopo di conferire potenza e selettività per il sito EGFR, nei nuovi derivati pirazolopirimidinici il ribosio dell’ATP, che occupa la regione dello zucchero, è stato sostituito da un gruppo aromatico, che nel composto 2 è rappresentato dal fenile in posizione 1.

L’altro fenile presente nella posizione 3 della molecola si dirige invece verso l’ampia tasca lipofila, denominata regione nascosta, normalmente non occupata dall’ATP (Figura 14).

Analoghi del composto 2 hanno mostrato attività di inibizione nei confronti di EGFR,

confermando l’ipotesi formulata.

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Figura 14. Sovrapposizione del composto 2 con ATP

Gli stessi Autori

³⁴

hanno poi sviluppato una seconda serie di derivati pirazolo pirimidinici, il cui prototipo è il composto 3, rappresentato in bianco nella Figura 15 per il quale è stata ipotizzata una diversa interazione con il sito catalitico.

Figura 15. Sovrapposizione del composto 3 con ATP

Questa modalità d’interazione prevede che siano l’NH (1) del pirazolo e N

₇

della

pirimidina a costituire il sistema donatore-accettore di legame a idrogeno nella regione

del legame con l’adenina dell’ATP, che il gruppo amminico legato a C (4) si diriga

verso la regione del ribosio, senza posizionarsi al suo interno, mentre il sostituente

anilinico nella posizione 3 del pirazolo si inserirebbe, anche in questa caso, nella tasca

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lipofila. Questo modello ha suggerito l’introduzione di un secondo gruppo aromatico su NH

2

in posizione 4 (evidenziato in rosso nella Figura 15), allo scopo di favorire una migliore interazione con la regione dello zucchero. I composti con struttura generale 1, sintetizzati a seguito di questa indicazione, si sono rivelati effettivamente potenti inibitori della EGFR tirosin chinasi, ad esempio, per il composto in cui R = OH e R

1

= Cl, IC

₅₀

nei confronti di EGFR è 1 nM.

Altri composti caratterizzati dal nucleo pirazolo[3,4-d]pirimidinico riportati in letteratura sono i derivati PP1 e PP2, descritti come potenti inibitori della famiglia Src delle tirosin chinasi.

³⁵

I composti PP1 e PP2 sono analoghi del composto 2, che differiscono da questo per la presenza di un gruppo terz-butilico sull’azoto N

₁

pirazolico e di un sostituente (Cl, CH

₃

) in para sul fenile in posizione 3. Ciò mette in evidenza come variazioni della sostituzione del sistema pirazolopirimidinico possano spostare l’attività inibitoria di un composto da EGFR ad altre tirosin chinasi.

³⁵

CH₃

N N N

N NH₂

PP1

Cl

N N N N

NH₂

PP2

Un altro inibitore a struttura pirazolo[3,4-d]pirimidinica è stato individuato mediante virtual screening utilizzando una struttura cristallizzata EGFR-ligando.

³⁶

Attualmente sono disponibili le strutture cristallizzate di recettori legati ad alcuni noti inibitori di EGFR, come Erlotinib e Lapatinib.

La struttura con Erlotinib è stata utilizzata per lo screening di una collezione di oltre

trecentomila composti della Cambridge Express Library. Sono state selezionate 50

molecole, di cui è stata valutata l’attività inibitoria su EGFR purificato da cellule di

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carcinoma epiteliale A431. Tra le molecole saggiate, il composto pirazolo[3,4- d]pirimidinico 4 ha mostrato una discreta attività, con IC

50

15µM.

N N HN

N N O

O

4 Le molecole selezionate sono state ulteriormente valutate per l’attività antiproliferativa nei confronti di cellule cancerose. Sono state utilizzate ancora cellule di epitelioma A431 poiché esse esprimono alti livelli di EGFR. Il composto 4 non ha mostrato la massima attività antiproliferativa, che è stata raggiunta da molecole con scaffold diversi e che non avevano esercitato attività inibitoria di EGFR in vitro. E’ stato perciò ipotizzato che i composti più attivi sulle cellule potessero agire su bersagli alternativi ad EGFR e che il composto 4 fosse più selettivo per il recettore. Nella Figura 16 è rappresentato un modello d’interazione del composto 4 con il sito di EGFR.

L’idrogeno amminico e l’azoto 5 della pirimidina formano legami a idrogeno

rispettivamente con O e NH di Met769. nel modello è inclusa una molecola d’acqua che

instaura legami a idrogeno con N(7) della pirimidina e Thr766. Il sostituente 3-

metilfenilico occupa la cavità idrofobica. Nella Figura 17 il composto 4 è sovrapposto

con Erlotinib.

(13)

Figura 16. Modello d’interazione del composto 4 con EGFR.

Il recettore è rappresentato nella forma a nastro grigio e la superficie del sito di legame è illustrata come rete colorata in modo diverso a seconda delle proprietà di binding: proprietà idrofobiche, verde;

donatori di legami a idrogeno, blu; accettori di legami a idrogeno, rosso. Colori degli atomi: carbonio, giallo; ossigeno, rosso; azoto, blu; idrogeni polari, grigio. I legami a idrogeno sono rappresentati come

serie di punti.

Figura 17. Sovrapposizione di 4 con Erlotinib. Colori degli atomi: ossigeno, rosso; azoto, blu;

idrogeni polari, grigio; zolfo, verde. Gli atomi di carbonio sono in giallo (composto 4) oppure in bianco (erlotinib). I legami a idrogeno sono rappresentati come serie di punti.