Un ulteriore sito di legame per le Bz fu localizzato circa 40 anni fa nei tessuti periferici e fu denominato recettore periferico delle benzodiazepine (PBR).

Parte Generale

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Durante gli ultimi 50 anni, le benzodiazepine (Bz) hanno assunto un notevole valore in campo terapeutico; l’ampio uso clinico si basa sulla loro attività di potenti ansiolitici, anticonvulsivanti, ipnotico- sedativi e rilassanti muscolari. Il recettore centrale delle benzodiazepine (CBR), che media tutte queste azioni, è localizzato esclusivamente nel sistema nervoso centrale (SNC) e fa parte di un complesso recettoriale sovramolecolare dove sono riconoscibili il sito di legame per l’acido γ- amminobutirrico (GABA), il canale per il cloro e distinti centri di modulazione allosterica sensibili a diversi composti quali le Bz, i barbiturici, la picrotossina, ecc...

Un ulteriore sito di legame per le Bz fu localizzato circa 40 anni fa nei tessuti periferici e fu denominato recettore periferico delle benzodiazepine (PBR).

Recentemente al PBR è stato attribuito il nuovo nome di Proteina Traslocatrice (18 KDa), abbreviato TSPO. Le ragioni che hanno portato a questo cambiamento sono state determinate dalle nuove scoperte riguardo la localizzazione , la struttura e il ruolo fisiologico di questa proteina . Infatti, è stato osservato che il TSPO non interagisce solo con le Bz, ma anche con molti altri ligandi ; inoltre non è localizzato esclusivamente a livello periferico e non presenta nemmeno una struttura recettoriale nel senso tradizionale del termine.

E’ stato quindi pensato di attribuire come nuovo nome TSPO con

riferimento alla principale funzione svolta da questa proteina che è

appunto quella del trasporto di molecole come ad esempio il colesterolo

e gli intermedi per la sintesi delle porfirine.

Il TSPO ha un’elevata

distribuzione in molti tessuti del nostro corpo. Il cervello ed il fegato

presentano livelli relativamente bassi di TSPO, mentre i tessuti e le

ghiandole coinvolte nella sintesi degli steroidi ne sono particolarmente

ricchi; negli organi quali cuore, polmoni e rene , la presenza del TSPO

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è invece più moderata. Il TSPO, inoltre, è espresso in concentrazioni significative anche nel sistema immunitario e nelle varie sottopopolazioni dei leucociti.

Il TSPO è una proteina idrofobica, avente un peso molecolare di 18 KDa, costituita da 169 amminoacidi con una sequenza amminoacidica fortemente conservata. La sua struttura è costituita da 5 domini transmembrana ad α-elica, a sua volta composti ciascuno, da circa 21 amminoacidi, che attraversano il doppio strato fosfolipidico della membrana mitocondriale esterna (OMM)

. L’estremità carbossi- terminale di questa proteina è situata nel citoplasma mentre quella ammino-terminale è invece rivolta verso l’esterno del mitocondrio.

Figura 1

Figura 1. Struttura molecolare del TSPO; OMM membrana mitocondriale esterna ; IMS spazio intermembrana .

Alcuni studi hanno riportato l’espressione del TSPO sulla membrana plasmatica degli eritrociti e sulle membrane nucleari di

cellule cancerose. A livello subcellulare il TSPO si trova localizzato

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prevalentemente sulla membrana mitocondriale esterna (OMM) ed in buona parte anche nei siti di contatto tra le membrane mitocondriali interna (IMM) ed esterna. Figura 2

Figura 2

Modello del TSPO e sua localizzaione subcellulare nei siti di contatto delle membrane mitocondriali esterna/interna.

Nei mitocondri il TSPO è un costituente del poro di transizione di permeabilità mitocondriale (mithocondrial permeability transition pore, MPTP), dove è intimamente associato in un complesso trimerico con il trasportatore dei nucleotidi adenosinici (ANT, 30 KDa) ed il canale anionico voltaggio dipendente (VDAC, 32 KDa) ,( Figura 3 ) . Questo complesso costituisce un canale localizzato sui siti di contatto tra le

membrane mitocondriali esterna ed interna.

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Figura 3. Composizione proteica del (TSPO)

Fino ad oggi sono state identificate 4 proteine citoplasmatiche

capaci di legarsi al TSPO,

anche se la funzionalità di due di queste è ancora sconosciuta;

• PRAX-1 Peripheral Benzodiazepine Receptor-associated Protein 1(proteina associata al recettore periferico delle benzodiazepine), del peso di 240 KDa, costituita da 1857 amminoacidi;

• p10, una proteina di 10 KDa che co-immunoprecipita con il TSPO;

• Stereoidogenic Acute Regulatory Protein (STAR) che lega il colesterolo e ne promuove il trasferimento mitocondriale;

• PAP7, che regola anch’essa la stereidogenesi.

Per quanto riguarda la proteina PRAX-1 è stato ipotizzato un

modello per la sua interazione con il TSPO.

Dati stereochimici

evidenziano che la PRAX-1, come monomero, è in associazione con

più molecole (almeno due) di TSPO (18 KDa) che si trovano nelle sue

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vicinanze. La porzione della proteina TSPO accessibile per il legame con la PRAX-1 è probabilmente quella C-terminale, di 14 amminoacidi, esposta verso il lato citoplasmatico della membrana mitocondriale esterna , il ruolo della PRAX-1 è ancora sconosciuto , ma si ritiene che questa sia coinvolta nel reclutamento di siti supplementari nelle vicinanze del TSPO in maniera tale da modularne le funzioni.

Il TSPO riveste un ruolo chiave nella funzionalità cellulare. Ad esso sono attribuite le funzioni di regolazione della proliferazione cellulare, trasporto di porfirine (protoporfirine ΙΧ, mesoporfirina ΙΧ, emina), sintesi dell’eme, immunomodulazione, regolazione della

stereidogenesi e apoptosi.

TSPO e stereoidogenesi. La biosintesi degli steroidi inizia in tutti i tessuti stereoidogenici con la conversione enzimatica del precursore colesterolo in pregnegnolone. Il passaggio limitante la velocità di questo processo è il trasporto del colesterolo dai depositi intracellulari, attraverso lo spazio acquoso intermembranale, verso il lato della membrana mitocondriale interna rivolta verso la matrice, a livello della quale è presente il citocromo P-450 che catalizza la reazione ( Figura 4 ).

Il TSPO riveste un ruolo cruciale nel processo stereoidogenico:

quando viene attivato da un ligando (es. PK11195) lega il colesterolo e regola il suo trasporto dalla membrana mitocondriale esterna a quella interna , aumentando la produzione di pregnegnolone e la sintesi degli steroidi. Il meccanismo ipotizzato si basa su un modello sperimentale di dinamica molecolare : il TSPO accoglierebbe nelle sue 5 eliche la molecola di colesterolo formando un canale tramite il quale, il colesterolo verrebbe trasportato attraverso la membrana .

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Figura 4. Funzione del TSPO nella stereoidogenesi.

E’ stato inoltre osservato che i livelli sistemici di steroidi aumentano in seguito ad una lesione, ad un dolore o ad una febbre, in risposta alla stimolazione da parte di alcune citochine della secrezione del fattore di rilascio delle corticotropine. Il coinvolgimento del TSPO nella sintesi di steroidi può quindi contribuire a questo meccanismo difensivo. Inoltre, la relazione presente fra i bassi livelli di steroidi e l’ansia ha indicato il TSPO come un promettente target per il trattamento dei disturbi psichiatrici che sono correlati ad una disfunzione nella sintesi di steroidi.

Alcuni composti altamente affini al TSPO come PK11195 e la classe delle N,N-dialchil-2-fenilindol-3-ilgliossilamidi, recentemente sintetizzate nel nostro laboratorio, hanno mostrato come effetto un aumento della biosintesi del pregnegnolone, quindi dei neurosteroidi, risultando potenzialmente utili per il trattamento dell’ansia.

TSPO e apoptosi. La cascata apoptotica che porta alla morte cellulare è stata ben caratterizzata e in questo processo, l’evento critico iniziale risulta essere la dissipazione del potenziale transmembranale mitocondriale causata dall’apertura dell’MPTP.

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L’apertura di tale poro, se reversibile e a basso livello di conduttanza, causa un netto influsso di ioni ed acqua dentro la matrice mitocondriale al fine di mantenere il corretto equilibrio ionico dell’organello.

L’apertura prolungata del MPTP-poro può al contrario innescare una serie di eventi che hanno importanti conseguenze sulla fisiologia mitocondriale e sull’equilibrio bioenergetico della cellula. In particolare è stata osservata la dissipazione del potenziale transmembrana. Inoltre influenza l’omeostasi degli ioni intracellulari, favorendo il rilascio di calcio dalla matrice e determina il rigonfiamento colloido-osmotico della matrice mitocondriale e l’efflusso dal mitocondrio di proteine e molecole tra cui il citocromo c e la flavoproteine AIF (fattore d’induzione dell’apoptosi). Quest’ultima trasloca nel nucleo dove

induce condensazione della cromatina e frammentazione del DNA.

Nel citosol il citocromo c interagisce con Apaf-1 (fattore attivante dell’apoptosi) innescando le reazioni della caspasi che portano

all’attivazione di un complesso di enzimi fondamentale nell’indurre il riarrangiamento strutturale del nucleo, del citoscheletro e della membrana plasmatica, caratteristici dell’apoptosi.

Il TSPO è un modulatore endogeno di questo processo, ma l’esatto meccanismo non è ancora definitivamente stabilito. La sua regolazione può avvenire a diversi livelli e il meccanismo proposto include la modulazione dell’MPTP o la diretta interazione con molecole pro o anti-apoptotiche.

E’ stato dimostrato che i suoi ligandi PK11195 e FGIN-1-27

modulando l’MPTP e la risposta apoptotica, sono in grado di

diminuire il potenziale di membrana mitocondriale, provocando apoptosi ed arresto del ciclo cellulare nella fase G

/G

in diverse linee cellulari tumorali.

Il secondo meccanismo è stato proposto dal momento che, a livello dei siti di contatto tra la membrana esterna e

quella interna del mitocondrio, il TSPO è coinvolto nella formazione

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dell’MPTP-poro.

TSPO e immunomodulazione. La presenza del TSPO in un gran numero di cellule immunomodulatorie come la microglia, i monociti del sangue, i linfociti e i leucociti, ha portato a pensare ad un coinvolgimento del TSPO nella risposta immunitaria; tuttavia, il meccanismo attraverso il quale ciò avviene è ancora sconosciuto. I macrofagi presentano molti siti di legame per il TSPO, ed in particolari studi effettuati sui topi è stato osservato che le Bz inibiscono la capacità dei macrofagi di produrre ROS ed alcune citochine infiammatorie come ad esempio IL-1, TNFα e IL-6 .

Inoltre, il TSPO è coinvolto nel metabolismo ossidativo ad opera dei fagociti, processo necessario per eliminare definitivamente

antigeni esterni. La funzione immunosoppressiva di alcuni

ligandi che vanno ad interagire con il TSPO ha dimostrato l’importante ruolo rivestito da questa proteina nella risposta infiammatoria. Nel SNC il TSPO è espresso prevalentemente nelle cellule microgliali. L’attivazione della microglia da inizio ad una risposta infiammatoria che può esacerbare la perdita neuronale in varie malattie infiammatorie neuodegenerative, come ad esempio l’Alzheimer. Poichè si è osservata una sovraespressione di TSPO nella microglia attivata, si è pensato che l’infiammazione presente a livello celebrale durante le patologie neurodegenerative coinvolga tale recettore. Si presenta così la possibilità di utilizzare degli specifici ligandi per il TSPO per prevenire o limitare la neuroinfiammazione.

Tuttavia il coinvolgimento della microglia attivata in varie patologie del

SNC è differente a seconda del suo ruolo nella progressione e nella

gravità della patologia. E’ plausibile quindi ipotizzare che , attraverso

l’utilizzo del TSPO come marker di tali cellule, sia possibile

determinare con esattezza quale ruolo la neuroinfiammazione gioca in

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specifiche condizioni patologiche che coinvolgono il SNC, aprendo così le porte alla cura o all’inibizione della progressione della malattia.

Altre funzioni del TSPO. Numerosi studi sul TSPO hanno dimostrato la modulazione della sua espressione in stati fisiologici e patologici. L’espressione del TSPO è sotto il controllo del sistema ormonale che colpisce l’interazione del suddetto recettore con VDAC e ANT. Anche altri fattori come le citochine (IL-1 o TFN-α), la vitamina A e le catecolammine modulano l’espressione del TSPO. L’attività del TSPO sembra comprendere anche la modulazione della risposta cellulare nelle infezioni virali. Una delle strategie adottate dai virus per aggirare i meccanismi protettivi della cellula contro le infezioni, è quella di bloccare il processo di apoptosi.

Molteplici studi hanno dimostrato che i diversi virus patogeni

utilizzano proprio il TSPO come target per mettere in atto il blocco

dell’apoptosi. Questa scoperta offre quindi numerose prospettive per

nuove strategie antivirali. L’attività del TSPO risulta implicata anche

nello stress. Infatti la sua attivazione durante l’esposizione acuta ad

agenti stressogeni può essere vista come una predisposizione neuronale

e metabolica per un migliore adattamento allo stress.

Un’elevata

espressione di tale recettore è stata inoltre riscontrata nelle cellule e nei

tessuti neoplastici dell’avorio, nell’adenocarcinoma, nel carcinoma del

fegato, del colon e nei gliomi. Questo aumento dell’espressione del

TSPO è correlabile con il grado di aggressività della forma tumorale. Il

monitoraggio dell’espressione di tale recettore, dunque, può essere una

procedura rilevante in clinica per diagnosticare e/o seguire la

progressione della patologia. Il TSPO è sovraespresso anche nelle

cellule microgliali attivate ed in generale nelle aree in cui è in corso una

significativa risposta infiammatoria. Una up-regulation della proteina è

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osservabile anche in vari disturbi neurodegenerati come ad esempio il morbo di Alzheimer e di Huntington e nella sclerosi multipla.

Una down- regulation di tale recettore è stata al contrario osservata in paziente affetti da ansia, da stress post traumatico e stress cronico.

La comprensione dei meccanismi attraverso i quali il TSPO modula le risposte cellulari, insieme alla descrizione delle variazioni della sua espressione, costituisce la base razionale per un uso terapeutico dei ligandi di tale recettore. Di conseguenza il TSPO ha assunto un notevole

interesse come possibile target terapeutico.

Una grande varità di molecole endogene mostra alta affinità per il TSPO. Una delle prime molecole identificate, isolata sia a livello centrale che nei tessuti periferici (ghiandola surrenale, rene e testicoli), è un residuo di neuropeptide di 11 KDa composto da 86 amminoacidi

che inibisce il Diazepam con il sito recettoriale delle Bz

chiamato ″inibitore del legame del Diazepam (DBI)″ . Oltre a questa molecola e ai suoi metaboliti, sono stati isolati altri ligandi endogeni come le porfirine (protoporfirina ΙΧ, mesoporfirina ΙΧ ed emina) ed il colesterolo.

Le principali classi di ligandi sintetici descritti in letteratura sono:

( Figura 5 ) :

• benzodiazepine (4-clorodiazepam, Ro5-4864)

• isochinolincarbossiamidi (PK11195)

• imidazopiridine (Alpidem)

• derivati indolacetamidici (FGIN-1, SSR180575)

• derivati fenossifenilacetamidici (DAA1097)

• pirazolopirimidine (DPA714, DPA713)

• N,N-dialchil-2-fenilindol-3-ilgliossilamidi.

Tutti questi ligandi, che mostrano un’alta affinità di legame per il

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TSPO, con valori di Ki nell’ordine del nanomolare, sono stati utilizzati come strumenti farmacologici di ricerca per caratterizzare le proprietà e le funzioni del TSPO.

N O

N

Cl

CH₃ CH₃ CH₃

PK 11195 (1) Ro5-4864 (2) Alpidem (3)

N

N R₁

R₂

X O

R₃

H

FGIN-1 (4) SSR180575 (5) FGIN-1-27:R₁=R₂=n-C₆H₁₃;R₃=F

Cl O

N

O CH₃

O CH₃

CH₃

N

N N

OR

N CH₃

CH₃ O H₃C

DAA1097 (6) DPA714 (7) R =CH2CH2Cl

Figura 5. Ligandi sintetici per il TSPO

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I ligandi FGIN-1-27 e PK11195 hanno mostrato, in vitro, attività antitumorale, inducendo l’apoptosi e l’arresto del ciclo cellulare in linee cellulari di cancro esofageo, colon-rettale e in colture primarie di cancro. L’ipotesi che il TSPO partecipi allo sviluppo della malattia è supportata dalla sua localizzazione anche a livello nucleare e perinucleare in alcune linee cellulari cancerose: in questa sede il recettore regolerebbe la proliferazione cellulare facilitando il trasporto del colesterolo nel nucleo. Inoltre studi di imaging diagnostico non invasivo, mediante l’utilizzo di ligandi marcati per il TSPO ([

H]

PK11195), hanno fornito dati di notevole interesse nella visualizzazione

dei tumori in test come la tomografia ad emissione di positroni ( PET).

Ligandi come il Ro5-4864 ed PK-11195 limitano la gravità e la progressione di diversi processi infiammatori. Ciò è stato dimostrato utilizzando questi ligandi in studi sperimentali come il test della carragenina e nella terapia di patologie infiammatorie (infiammazione e iperplasie sinoviale, degenerazione del tessuto osseo e cartilagineo).

SSR180575 è risultato efficace nella terapia dell’artrite reumatoide.

Ulteriori sperimentazioni hanno dimostrato l’efficacia del SSR180575 e del PK11195 nella terapia del Lupus erithematosus (patologia autoimmune).

Recentemente è stata sintetizzata una nuova classe di farmaci, le pirazolopirimidine, affine e selettiva per il TSPO ed in particolare il composto DPA714, in grado di aumentare la stereoidogenesi dell’80% rispetto ai livelli fisiologici. E’ stato osservato che i livelli sistemici di steroidi risultano significamente aumentati a seguito di una lesione , di un dolore o di una febbre, a causa della stimolazione da parte di alcune citochine sulla secrezione del fattore di rilascio delle corticotropine. L’utilizzo di ligandi in grado di interagire con il TSPO e stimolare la sintesi di steroidi può quindi contribuire ad

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una risposta difensiva e anti-infiammatoria. Altri ligandi in grado di stimolare la sintesi di steroidi sono i derivati fenossifenilacetamidici (DAA1097).

Come descritto in precedenza a livello cerebrale il TSPO è localizzato principalmente nelle cellule gliali. E’ stato riscontrato un elevato aumento della sua densità in caso di lesioni o situazioni patologiche a livello del sistema nervoso centrale (SNC), in modo particolare negli stati acuti e cronici di patologie neurodegenerative. Da ciò è nata l’ipotesi che la regolazione delle funzioni del TSPO possa avere un ruolo neurotrofico e neuroprotettivo nelle lesioni neuronali. I risultati sperimentali hanno suggerito che l’espressione del TSPO poteva essere regolata da segnali provenienti da assoni in via di rigenerazione. Un recente studio ha dimostrato come il ligando SSR180575 manifesti proprietà neuroprotettive in diversi modelli di patologie degenerative progressive del sistema nervoso centrale e periferico. Precisamente, sia il ligando SSR180575 che il Ro5-4864 promuovono la sopravvivenza del neurone e la riparazione successiva ad assotomia. I meccanismi ipotizzati per tale azione sono: (i) regolazione del processo apoptotico, che favorisce la sopravvivenza delle cellule gliali; (ii) produzione di mediatori come neurosteroidi, citochine o altri fattori neurotrofici, che supportano la sopravvivenza del nervo.

La classe delle N,N-dialchil-2-fenilindol-3-ilgliossilamidi Ι è stata recentemente individuata nel laboratorio di ricerca presso il quale è stato svolto questo lavoro di tesi. Questi nuovi ligandi, che rappresentano una variazione della struttura base dell’Alpidem, sono altamente affini e selettivi nei confronti del TSPO.

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I

Sono state sintetizzate numerose indolgliossilamidi portanti gruppi sostituenti con diverse proprietà steriche, lipofile ed elettroniche.

Moltissimi nuovi derivati sono risultati attivi e selettivi per il TSPO, con valori di Ki nell’ordine nanomolare. La selettività verso il recettore periferico è stata accertata con test di binding per il CBR nei quali i composti hanno dimostrato scarsa o nulla affinità ( Tabella 1 ^{). Per} alcune delle indolgliossilamidi I è stata inoltre evidenziata la capacità di stimolare la biosintesi del pregnegnolone in cellule C6 di glioma di ratto.

Le più importanti considerazioni sulle relazioni struttura–attività (SAR), emerse dall’esame dei dati di affinità riportati nella Tabella 1 ^, sono le seguenti: per quanto riguarda la natura dei sostituenti R

ed R

sull’azoto della catena gliossilamidica in posizione 3, sono stati ottenuti ottimi risultati in termini di affinità attraverso la disostituzione con catene alchiliche lineari ed uguali tra loro, di lunghezza compresa tra 3 e 6 atomi di carbonio; si sono inoltre dimostrati altamente affini composti

con sostituzione asimmetrica dell’azoto amidico, in particolare N-etilbenzilamidi e N-metilbutilamidi.

Considerando la posizione para sul fenile in posizione 2, i

composti recanti un sostituente elettronattrattore (F, Cl, NO

) (1n-1y)

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si sono dimotrati più attivi, con valori di Ki subnanomolari.

Tra questi derivati, quelli con catene n-esiliche e con un sostituente in posizione 4' come un alogeno, fluoro (1p) e cloro (1t) , o un gruppo nitro (1x), risultano particolarmente potenti con valori di Ki rispettivamente 0.37 nM , 0.55 nM e 0.27 nM. E’ interessante notare che l’affinità mostrata è simile, se non superiore, a quella dell’Apidem, preso come riferimento (Ki = 0.5-7 nM). Al contrario l’inserzione di un gruppo elettrondonatore come il metile nella posizione 4' non ha determinato un aumento significativo di affinità: infatti questi composti (1dd-1gg) sono equipotenti ai corrispondenti non sostituiti.

Infine per quanto riguarda la posizione 5 del sistema indolico, prodotti recanti un sostituente di tipo elettronattrattore come F, Cl, NO

(1hh-1ss), hanno mostrato una buona attività, che risulta ulteriormente potenziata in co-presenza di un sostituente elettronattrattore in posizione 4' (1yy-1jjj, 1www-1zzz).

In particolare, il derivato più attivo di tutta la serie delle indolgliossilamidi è rappresentato dal 4',5-dicloro sostituito, portante in posizione 3 una catena N-metilbutilamidica (1xxx, Ki = 0.15 nM).

Le SAR di questa classe di composti sono state razionalizzate sulla base di un modello di farmacoforo-recettore, secondo il quale i siti di legame sono costituiti da tre tasche lipofile (L1, L3 e L4) e da un sito donatore, capace di formare un legame a idrogeno H1.

Nella Figura 6 è rappresentato lo schema di interazione delle indolgliossilamidi I con il recettore, paragonato con le modalità di legame del derivato isochinolinico PK11195.

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I ,II

Figura 6. Interazione di legame di PK11195 e N,N-dialchil-2-fenilindol gliossilammidi con il modello farfacoforico del recettore (TSPO).

Per le indolgliossilamidi si può ipotizzare che il fenile in posizione 2 sia coinvolto in una interazione con un anello aromatico elettron-ricco presente nell’area lipofila L1 e che questa interazione sia rafforzata da sostituenti elettronattrattori come gli alogeni o il gruppo nitro in posizione 4'. I sostituenti alchilici R

ed R

interagirebbero, rispettivamente, con le aree lipofile L4 e L3, , mentre il secondo carbonile del ponte ossalilico svolgerebbe il ruolo di accettore nella formazione di un legame a idrogeno con il sito H1 presente sul recettore.

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Recentemente è stata sviluppata una nuova classe di indolgliossilamidi portanti un gruppo metilico sull’N-H indolico da utilizzare come probes molecolari utili per lo studio della localizzazione e del livello di espressione del TSPO nei tessuti di interesse. Questi composti, sono suscettibili di marcatura con [

C], (t½= 20.4 min) e possono essere impiegati come utili strumenti diagnostici tramite l’utilizzo della PET.

L’affinità di legame dei nuovi derivati N

-metilati (1aaaa- 1mmmm) recentemente sintetizzati, espressa in valori di Ki, è riportata in Tabella 1 insieme ai valori di Ki dei ligandi standard (1 ,2 e 3) del TSPO. Inoltre sono riportati per confronto anche i valori di affinità di legame degli omologhi N-demetilati (1d, 1e, 1g, 1i, 1n, 1p, 1v, 1hh, 1ttt, 1vvv).

La maggior parte dei derivati 1aaaa-1mmmm mostrano valori di K i nell’intervallo compreso tra 0,3 e 60 nM, valori, essenzialmente comparabili con quelli dei loro omologhi non sostituiti 1d, 1e, 1g, 1i, 1n, 1p, 1v, 1hh, 1ttt e 1vvv.

Questi risultati perciò concordano con l’ipotesi precedentemente enunciata, riguardante l’ausilio del modello farmacoforo-recettore, tramite la quale si supponeva che NH indolico non fosse coinvolto nel legame con la proteina recettoriale.

La scelta del miglior candidato per essere radiomarcato con il [

C] tra i derivati è stata fatta sulla base di due requisiti principali: un’alta affinità di legame per il TSPO, in modo da avere bassi livelli di legami aspecifici e un adeguato rapporto lipofilia/idrofilia tale da permetterne l’attraversamento della barriera ematoencefalica (BEE), quindi la loro entrata nel tessuto nervoso

centrale. Sulla base di questi due parametri, è stato perciò

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selezionato, il composto 1mmmm come ligando della nuova serie ,che mostra la migliore combinazione di affinità di legame (Ki 5,7 nM) e lipofilia (cLogP 3,95) per essere radiomarcato con il [

C] e valutato come radioligando per il TSPO in vivo.

A tale proposito il composto 1mmmm è stato radiomarcato . Una volta somministrato ha rapidamente superato la BEE e raggiunto il cervello delle scimmie, dando un’elevata percentuale di legame specifico reversibile nei confronti del TSPO.

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Tabella 1. Dati di binding dei derivati 2-arilindol-3-ilgliossilamidici 1a-1mmmm

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[a] La concentrazione dei composti saggiati che inibisce il 50% del legame del [³H] PK11195 nelle membrane mitocondriali delle cellule di rene di ratto (IC50) è stata determinata mediante l’analisi log-probit, utilizzando 6 concentrazioni diverse del composto. I valori di Ki sono medie± SEM di 3 determinazioni. [b] Le percentuali di inibizione del legame specifico del [³H] flumazenil ad una concentrazione di 10 µM del composto sono medie ± SEM di 5 determinazioni. I valori di Ki sono medie ± SEM di 3 determinazioni.[c] Dati di rif. 10-7