a.C.), il mughetto descritto da Ippocrate (460 a.C.) e la dermatofitosi del capo (kerion) di Aulo Cornelio Celso (14 a.C.).

1 INTRODUZIONE

1.1 I FUNGHI E L’UOMO

I funghi o miceti sono largamente diffusi nell’ambiente; essi vivono come saprofiti negli strati superficiali del suolo, nel materiale organico in decomposizione e anche come commensali in vari organismi animali. Oltre a svolgere funzioni fondamentali nei cicli biologici della biosfera i funghi hanno occupato anche un ruolo molto importante nella storia dell’uomo e della medicina.

Le prime descrizioni di infezioni fungine risalgono a migliaia di anni fa alcuni esempi sono il micetoma del piede riportato nelle scritture indù (XX sec.

a.C.), il mughetto descritto da Ippocrate (460 a.C.) e la dermatofitosi del capo (kerion) di Aulo Cornelio Celso (14 a.C.).

Nel corso degli anni sono stati descritti altri funghi come il Saccaharomyces cerevisiae utilizzato per processi alimentari fondamentali tra cui la lievitazione del pane, la fermentazione del vino e della birra. Il Beauveria bassiana identificato nel 1835 da Agostino Bassi come primo agente eziologico di malattia, il “mal moscardino”, in un organismo animale: il baco da seta. Nel 1845-1849 è stato descritto il Phytophtora infestans, un oomicete contaminante della patata che ha direttamente causato la morte di milioni di persone in Irlanda per carestia. Nel 1928 Fleming grazie al Penicillium notatum e un suo metabolita, la penicillina, ha anticipato l’era della terapia antibiotica.

Le infezioni fungine, nel corso degli anni, sono aumentate

progressivamente, rappresentando oggi un’importante causa di morbilità e

2 mortalità. La micologia medica, infatti, e’ una disciplina esplosa negli ultimi vent’anni e le cause di questa esplosione sono legate alla diffusione del virus HIV e quindi dell’ AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome), all’ uso di nuove tecniche chirurgiche invasive, all’uso massivo di antibiotici antibatterici, ai trapianti di organo. La micologia medica, quindi, e’ cresciuta di pari passo con l’incremento del numero di pazienti immunocompromessi.

Se lo sviluppo delle pratiche diagnostiche ha permesso, da un lato, un significativo miglioramento prognostico delle patologie di base, dall’altro è diventato un fattore di rischio poiché l’incidenza delle infezioni fungine è aumentata per l’uso sempre più frequente di cateteri intravascolari, trattamenti antiblastici, terapie antibiotiche e corticosteroidi.

E’ importante sottolineare che, per quanto i miceti siano microrganismi patogeni opportunisti generalmente controllabili dai meccanismi di difesa dell’ospite, molto spesso le complicanze infettive, soprattutto se sistemiche, sono asintomatiche e si manifestano clinicamente solo in fase terminale. Per questo motivo, eseguire un’attenta e puntuale sorveglianza sui pazienti ad alto rischio diventa indispensabile, se si vuole fare una diagnosi precoce e intervenire con una terapia mirata.

Esistono più di 100.000 specie di funghi ma solo un centinaio sono

rilevanti nella micologia medica. La micologia medica si occupa dei funghi

microscopici che esplicano il loro potenziale patogeno per parassitismo diretto o

per produzione di metaboliti tossici, le micotossine. Non si considerano le

patologie da intossicazione alimentare (micetismo) derivanti dall’ingestione di

funghi macroscopici velenosi.

3 I funghi si dividono in lieviti, organismi unicellulari, e ifomiceti, organismi pluricellulari. La classificazione dei funghi si ripartisce in Classi, Ordini, Famiglie, Generi e Specie, tale inquadramento tassonomico, scientificamente corretto, risulta poco funzionale nella micologia medica dove le micosi, convenzionalmente, sono divise in relazione alla profondità e gravità dell’infezione nei vari distretti anatomici dell’organismo

.

Esistono anche altri criteri per distinguere le infezioni fungine. Si definisce infezione endogena l’infezione causata da un microrganismo commensale; si definisce infezione esogena l’infezione causata da un microrganismo proveniente dall’ambiente esterno. Un’ulteriore distinzione può essere fatta sulla base della distribuzione geografica ed in quel caso si parla di infezione endemica o infezione cosmopolita

.

1.1.1 CARATTERISTICHE GENERALI DEGLI IFOMICETI

Gli ifomiceti sono organismi pluricellulari, eucarioti, aerobi, immobili, chemiosintetici ed eterotrofi, privi di clorofilla. Presentano strutture filamentose o ramificate dette ife. Essi possono avere una riproduzione sessuata o asessuata.

L’organizzazione della cellula fungina è di tipo eucariotico. Essa presenta un genoma, costituito da cromosomi di numero variabile, racchiuso nel nucleo.

Il nucleo è delimitato da un membrana pluristratificata e presenta numerosi

pori in superficie.

4 All’interno del citoplasma della cellula fungina sono presenti diverse strutture tra cui il reticolo endoplasmatico, composto da strutture microtubulari a cui sono associati numerosi ribosomi e l’apparato del Golgi. Talvolta all’interno del citoplasma è possibile osservare delle aggregazioni complesse di lamelle concentriche, associate ad invaginazioni della membrana citoplasmatica di funzione incerta.

I mitocondri fungini presentano al loro interno il DNA e hanno una variabilità di forma e dimensione. I vacuoli sono delimitati da una membrana detta tonoplasto, frequentemente essi sono localizzati alla base dell’ifa in prossimità della parete cellulare, il loro numero sembra aumentare nel tempo probabilmente in relazione a fenomeni degenerativi cellulari. I vacuoli, possono contenere pigmenti e glicogeno.

5 La membrana citoplasmatica circonda il citoplasma ed è costituita principalmente da lipidi e proteine. I lipidi presenti nella membrana sono diversi:

tra questi ricordiamo l’ergosterolo. Esso è uno sterolo ed è uno dei principali target delle terapie antimicotiche poiché influenza l’attività di alcune proteine di membrana, il trasporto di alcuni nutrienti, la fluidità della membrana e la proliferazione cellulare

. Le proteine che troviamo a livello della membrana plasmatica possono essere intrinseche o estrinseche. Esse svolgono molteplici funzioni tra cui il trasporto dei soluti che può essere primario o secondario

.

La membrana citoplasmatica è coinvolta in complesse funzioni biologiche, dal controllo selettivo degli scambi metabolici tra citoplasma e ambiente esterno, alla sintesi della parete cellulare mediante enzimi

.

La parete cellulare è una struttura fondamentale della cellula fungina. Essa è priva di peptidoglicano e di acidi teicoici ed è situata all’esterno della membrana citoplasmatica. Per struttura e composizione rappresenta il 30% del peso secco cellulare ed è costituita principalmente da:

 chitina (polimero della N-acetilglucosamina con legami β 1-4)

 glucani (polimeri del D-glucosio con legami β 1-3, β 1-6)

 mannani (polimeri D-mannoso con legami α 1-6, α 1-2, α 1-3)

 lipidi e proteine.

La parete è pluristratificata (Fig.2), la percentuale dei componenti

costituenti varia a seconda della specie, dallo stato di crescita e dal mezzo di

coltura.

6 L’unità strutturale degli ifomiceti è l’ifa. L’ifa è un filamento mono o pluristratificato di forma e dimensioni variabili che viene prodotto quando l’unità riproduttiva del fungo (conidio o spora) si introduce in ambienti che ne permettono la crescita. L’insieme delle ife costituisce il micelio (oppure tallo) della colonia fungina che, successivamente a processi di ramificazione ed anastomosi ifale, può assumere una conformazione di tipo sferico in ambienti liberi e di tipo circolare su terreni di coltura solidi. La generazione di ife laterali (secondarie) risulta regolata dalla porzione apicale dell’ifa e si realizza, solitamente, in seguito all’interposizione del setto divisorio.

Le ife fungine sono di diametro sempre maggiore di 1 µm. Nella maggior parte delle muffe le diverse porzioni miceliali possono comunicare tra loro, anche se intercalati da setti, per mezzo di pori settali che assicurano il flusso di nuclei e di materiale citoplasmatico verso la porzione apicale dell’ifa (Fig. 3).

Fig. 2 Parete cellulare.

7 I setti incompleti permettono la cooperazione delle cellule che compongono l’ifa durante l’accrescimento ifale.

In condizioni di emergenza si ha la chiusura completa del setto; ciò accade durante la riproduzione sessuata oppure quando una parte dell’ifa va incontro a necrosi. In entrambi i casi la chiusura del setto è una forma di difesa.

Le dimensioni della colonia fungina variano e risultano definite dalla limitazione fisica dell’ambiente di crescita e dalla disponibilità di metaboliti essenziali oltre che, probabilmente, da intrinseci meccanismi genetici di regolazione.

Il micelio fungino, morfologicamente, è costituito da un micelio vegetativo, con funzione di assorbimento di materiale nutritizio dal terreno e un micelio aereo specializzato alla funzione riproduttiva, che conferisce l’aspetto tipico alla colonia.

Fig. 3 Ifa fungina

8 1.1.2 CLASSIFICAZIONE DEI FUNGHI

Esiste una classificazione dei funghi, corretta dal punto di vista scientifico, in cui vengono suddivisi in base alle caratteristiche morfologiche ed alla presenza o meno del ciclo sessuato.

Tale inquadramento, però, risulta poco funzionale in micologia medica in quanto gli agenti eziologici di infezioni fungine si presentano molto spesso nella forma imperfetta (Deuteromiceti). Per tale motivo le infezioni fungine (micosi), vengono suddivise, convenzionalmente, in relazione alla profondità e conseguente gravità dell’infezione nei vari distretti anatomici dell’organismo

La suddivisione dei funghi in base alle caratteristiche morfologiche e riproduttive è indicata nella tabella di seguito indicata (Tab.1)

Fig. 4 Micelio aereo e Micelio vegetativo.

9

patogeni

Classe Genere rappresentativo Caratteristiche Ascomycetes Saccaromyces

Aspergillus Histoplasma Trichophyton

Funghi unicellulari e filamentosi a micelio settato.

Riproduzione asessuata mediante blastoconidi o conidi prodotti su conidifori molto differenziati morfologicamente.

Riproduzione sessuata mediata da asco spore formate all’interno di aschi, contenuti in ascocarpi

Basidiomycetes Filobasidiella neoformans ( Cryptococcus

neoformans)

Funghi unicellulari e filamentosi a micelio settato.

Riproduzione asessuata mediante conidi.

Riproduzione sessuata realizzata da basidiospore originatesi da basidi.

Deuteromycetes Candida Malassezia Coccidioides Bipolaris Aspergillus

Funghi unicellulari e filamentosi a micelio settato.

Riproduzione asessuata mediata da conidi molto differenziati

morfologicamente e per modalità di conidio genesi.

Riproduzione sessuata sconosciuta o riscontrata raramente.

Zygomycetes Rhizopus Mucor Absidia Basidiobolus

Funghi (omotallici ed eterotallici) con micelio scarsamente settato.

Riporduzione asessuata mediante spore prodotte in sporangi o sporandioli Riproduzione sessuata mediante zigospore

Le micosi, invece, suddivise in base gli aspetti clinici tra cui la profondità

e la gravità dell’infezione fungina nei vari distretti anatomici dell’organismo, si

differenziano in:

10



MICOSI SUPERFICIALI: infezioni che interessano esclusivamente gli strati cornei della cute e gli annessi cutanei con nulla o scarsissima reazione immunitaria da parte dell'ospite (Fig. 5);



MICOSI MUCOCUTANEE: infezioni che interessano i tessuti cheratinizzati della cute, gli annessi cutanei e le mucose con danni tessutali e significativa reazione immunitaria da parte dell'ospite (Fig. 6-7);



MICOSI SOTTOCUTANEE: infezioni che coinvolgono la cute e i tessuti sottocutanei; possono diffondere per contiguità o per via linfatica, con rilevante reazione immunitaria da parte dell'ospite (Fig. 8);



MICOSI PROFONDE: infezioni, solitamente a localizzazione polmonare, che possono eventualmente disseminare per via ematica con coinvolgimento degli organi interni e della cute (micosi disseminate o sistemiche), con massima reazione immunitaria da parte dell’ospite (Fig.9)

Spesso agenti eziologici che causano micosi superficiali possono essere, in

particolari condizioni dell’ospite, causa di infezioni sistemiche. Pertanto molti

miceti opportunisti sono oggi sempre più frequentemente associati a malattia,

particolarmente in ospiti immunocompromessi, causando infezioni che

prescindono dalle convenzionali localizzazioni anatomiche delle micosi

.

11

Fig. 5 Micosi superficiale - Pitiriasi versicolor

Fig.6 Micosi cutanea – Trichophyton rubrum

Fig.7 Micosi cutanea – Tigna capitidis

12

Fig. 9 Micosi profonda – Aspergillosi polmonare

13 Le infezioni fungine si distinguono anche in esogene ed endogene. Le infezioni esogene sono le infezioni il cui agente infettante si acquisisce dall’esterno; quelle endogene sono quelle che si sviluppano in seguito ad uno squilibrio della risposta immunitaria o squilibrio della flora microbica locale di un distretto corporeo. L’agente infettante è un commensale.

Fig. 10 Micosi

umane

14 1.1.3 EPIDEMIOLOGIA E DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA

Negli ultimi anni l’impatto delle infezioni fungine sulla salute umana ha richiamato l’attenzione di molti ricercatori poiché l’incidenza dei nuovi casi per anno è aumentata. I dati recenti, infatti, dimostrano che le infezioni da parte dei funghi patogeni per l’uomo sono in aumento, in parallelo con l’aumento dei soggetti immunocompromessi a causa di varie patologie che vanno dall’infezione da HIV, alle mielodisplasie e tumori. Le specie di Candida, ad esempio, sono diventate la quarta causa più comune di setticemia nosocomiale negli USA e nella maggior parte delle nazioni europee. Oltre alle patologie ci sono anche fattori di rischio, ben definiti, che determinano micosi profonde persino in pazienti immunocompetenti e sono:

- elevata colonizzazione da parte del microrganismo;

- chirurgia gastrointestinale e chirurgica;

- lunga permanenza in reparti di terapia intensiva;

- uso di antibiotici ad ampio spettro;

- nutrizione parenterale;

- esposizione massiva alle spore fungine, come nel caso delle infezioni primarie endemiche.

Le infezioni invasive fungine sono frequenti e gravi, in particolar modo, in

soggetti che si sottopongono a trapianti di organo, trapianti di cellule staminali

ematopoietiche o che sono affetti da tumori maligni ematologici. In tali casi i

soggetti sono vulnerabili a un’ampia varietà di funghi patogeni e la mortalità è

molto elevata

.

15 La maggior parte dei funghi che provocano infezioni ha una distribuzione cosmopolita; altri agenti di infezione sistemica non opportunistica, invece, hanno una nicchia ecologica caratteristica in natura. In questo ambiente (suolo ricco di humus vegetale e di varie deiezioni di uccelli) gli organismi fungini, normalmente saprofiti, proliferano e si sviluppano producendo particelle infettanti e/o spore in grado di infettare incidentalmente animali e uomini. Ad esempio B. dermatidis e H. capsulatum sono presenti soprattutto in Nord America (Stati Uniti e Canada) e raramente in Europa. Il Paracoccidioides brasiliensis è stato isolato in Brasile ed è presente nel Sud e Centro America. Il Coccidiodies immitis è presente nelle regioni sud occidentali degli Stati Uniti e poche altre zone del Centro e Sud- America. In Europa la patologia da miceti è dovuta a Cryptoccoccus neoformans, ai dermatofiti e agli opportunisti come Aspergillus e Candida.

Le infezioni fungine oltre che per inalazione di spore, originano anche per attivazione endogena della patogenicità di funghi che sono normalmente presenti nella flora microbica del soggetto sano (candidosi).

Molte delle infezioni fungine non sono trasmissibili e solo alcune dermatofizie sono contagiose tramite l'uomo o l'animale infetto.

I dati riguardanti la prevalenza e incidenza delle infezioni fungine sistemiche e mucosali sono difficili da reperire, in quanto queste non sono malattie notificabili.

La distribuzione geografica delle infezioni fungine è riportata nella tabella

seguente; esse possono essere endemiche o cosmopolite poiché alcuni funghi sono

endemici in alcune aree geografiche.

16

MICOSI SUPERFICIALI PIETRA BIANCA PIETRA NERA PITIRIASI NERA PITIRIASI VERSICOLOR

Cosmopolita

Africa, America latina,Asia Africa, Asia, (Europa, USA) Cosmopolita

MICOSI CUTANEE CANDIDOSI DERMATOFITOSI

Microsporum ferrugineum Trichopyton concentricum FEICOMICOSI

IALOIFOMICOSI ZIGOMICOSI

Cosmopolita Cosmopolita Cina, Giappone

Asia, Brasile, Guatemala, Messico Cosmopolita

Cosmopolita Cosmopolita MICOSI SOTTOCUTANEE

CROMOBLASTOMICOSI FEIOFOMICOSI

IALOIFOMICOSI LOBOMICOSI MICETOMI SPOROTRICOSI ZIGOMICOSI

Africa, America latina, Asia Cosmopolita

Cosmopolita

America latina (USA) Africa,America Latina,Asia, Cosmopolita

Cosmopolita MICOSI PROFONDE

ADIASPIROMICOSI ASPERGILLOSI BALSTOMICOSI CANDIDOSI CRIPTOCCOSI COCCIDIOIDOMICOSI Coccidioides immitis FEOIFOMICOSI

IALOIFOMICOSI ISTOPLASMOSI

Histoplasma capsulatum PENICILLOSI

Penicillium marnaffei PNEUMOCISTOSI

TRICOSPORONOSI ZIGOMICOSI

Cosmopolita Cosmopolita

Canada, USA, Africa, Arabia Saudita, Europa Cosmopolita

Cosmopolita

California, USA Cosmopolita Cosmopolita

Africa, America, Asia, Australia, Europa

Cina, Hong Kong, Indonesia, Tailandia Cosmopolita

Cosmopolita Cosmopolita

17 Dal punto di vista ecologico, i funghi patogeni possono anche essere schematicamente distinti in geofili, zoofili, antropofili.

Sono detti geofili quei funghi che vivono abitualmente nell’ambiente naturale in qualità di saprofiti a spese di sostanze inanimate; zoofili quelli che sono solitamente commensali o parassiti prevalentemente di animali domestici o selvatici; antropofili infine quelli che lo sono generalmente dell’uomo.

A causa del commensalismo di molte specie patogene e della grande facilità di adattamento ambientale della maggior parte dei funghi geofili, le micosi generalmente sono malattie ubiquitarie, presenti cioè in tutte le regioni del mondo con una incidenza variabile dovuta a molteplici fattori che possono essere climatici, igienici ed iatrogeni

.

I miceti, con la possibile eccezione dei dermatofiti antropofili, non necessitano di parassitare l'uomo o gli animali (zoonosi) per diffondersi poiché l'infezione è quasi sempre un evento casuale.

La maggior parte dei miceti potenzialmente patogeni per l'uomo ha una

nicchia ecologica ben definita, con distribuzione geografica ubiquitaria o

circoscritta. Da un punto di vista strettamente epidemiologico, alcune micosi

possono essere considerate endemiche in determinate aree geografiche; altre

possono essere correlate allo stato socioeconomico della popolazione; altre ancora

possono essere ritenute malattie professionali, in quanto individui appartenenti a

particolari categorie lavorative sono esposti a rischio più di altri individui.

18 1.1.4 OPPORTUNISMO FUNGINO

Con il termine “opportunismo” si indica la patogenicità “condizionata” di quei microrganismi che, intrinsecamente incapaci di provocare uno stato morboso, possono tuttavia causare infezione e conseguente patologia in un organismo che offra loro una “opportunità” generalmente rappresentata da una riduzione delle capacità difensive dell’organismo stesso.

A causa della sempre maggiore diffusione di fattori iatrogeni predisponenti, terapie immunosoppressive in particolare, la frequenza delle infezioni microbiche opportunistiche presenta attualmente una preoccupante tendenza all’aumento nella patologia umana, ove crea rilevanti problemi sia di ordine clinico che epidemiologico. Il fenomeno dell’opportunismo microbico trova ampia espressione nel campo delle micosi.

I fattori predisponenti all’opportunismo fungino sono variabili e tutti riconducibili ad una riduzione della capacità di reazione antimicrobica dell’organismo, come ad esempio neoplasie, leucemie, AIDS oppure interventi diagnostici o terapeutici invasivi

Molti miceti patogeni opportunisti appartenenti ai generi Aspergillus,

Fusarium, Mucor, Rhizopus, sono ubiquitari nell'ambiente e interessano

particolari categorie di lavoratori, ad esempio gli agricoltori. Molte specie

fungine che causano micosi sottocutanee vivono allo stato saprofitario

(vegetativo) su materiali vegetali in decomposizione; il contagio può avvenire

mediante innesto traumatico accidentale da rovi, spine, schegge negli arti inferiori

19 di individui che non portano calzature, come negli umidi paesi tropicali, generando così una eventuale infezione.

Esistono diversi fattori di rischio che possono dar luogo ad una infezione fungina; i principali sono elencati nella tabella 3.

Tab. 3 Fattori di rischio per le micosi opportunistiche

20 1.1.5 MECCANISMI DI PATOGENICITÀ DEI MICETI

I funghi si sono evoluti da un'esistenza di tipo saprofita rio (l'infezione nei mammiferi rappresenta un evento accidentale in quanto lo stato parassitario non è necessario per la riproduzione della specie). Molti prodotti considerati fattori di virulenza sono in realtà elementi funzionali facenti parte della normale fisiologia cellulare, alcuni prodotti sono utilizzati a scopi metabolici e riproduttivi, altri, come il dimorfismo termico, sembrano corrispondere ad una evoluzione più specifica di tipo parassitario; altri ancora potrebbero essersi originati e mantenuti in seguito a interazione con competitori ambientali. I fattori determinanti la patogenicità dei miceti sono stati studiati particolarmente in Candida albicans, il più frequente agente eziologico di micosi umane. I fattori di virulenza sono molteplici (Tab.4) e molti ancora sono da definire, anche se ci sono stati di recente molti progressi grazie alle ricerche in ambito molecolare.

Tab. 4 Fattori di virulenza dei funghi

21 Molti funghi esercitano un potere patogeno attraverso la capacità di sfuggire alle difese immunitarie (variazioni antigeniche, dimorfismo, blocco della maturazione della cellula dendritica ed altri fenomeni)

Nel caso degli ifomiceti, il meccanismo di patogenicità sembra ricondursi prevalentemente a:

1) capacità di penetrazione nei tessuti, resa possibile dall'azione meccanica di spinta che deriva dall’allungamento ifale;

2) produzione di particolari enzimi (cheratinasi nei dermatofiti, elastasi in Aspergillus fumigatus);

3) capacità di adattarsi alle condizioni avverse dei tessuti parassitati, quali temperatura e pH fisiologici;

4) capacità di eludere le risposte immunitarie modificandosi morfologicamente e variando antigenicamente (dimorfismo).

La certezza che un fattore possa essere considerato di virulenza si ha con indagini molecolari come esperimenti di delezione e restaurazione del gene codificante in ceppi isogenici. Tuttavia, il criterio di patogenicità dei miceti, inteso come capacità di produrre malattia, risulta riduttivo se riferito esclusivamente alla virulenza di un singolo ceppo o all’intervento di un singolo fattore di virulenza;

infatti bisogna considerare, nel processo patogenetico fungino, la multifattorialità

della virulenza del ceppo infettante e le condizioni dell’ospite, in particolare le

sue difese immunitarie che spesso sono alterate

.

22 1.1.6 PATOGENESI DELLE MICOSI

L’instaurarsi di un processo patologico varia in relazione al tipo di agente eziologico e di micosi. Nelle micosi di natura esogena l'agente eziologico, rappresentato generalmente dai conidi fungini della forma saprofitica asessuata, proviene dall'esterno. Nelle micosi superficiali, il contagio si verifica per contatto con cute ed annessi cutanei anche se, solitamente, è necessario il concorso di un trauma locale come un semplice sfregamento. Nelle micosi sottocutanee, invece, l'infezione è di solito mediata da ferite provocate da spine o schegge contaminate che innestano il fungo oltre la soluzione di continuo di cute e mucose che, se integre, rappresentano una barriera efficace nei confronti dei miceti patogeni.

Nelle micosi profonde, infine, la via di ingresso di gran lunga più frequente è quella aerogena e la prima localizzazione è, quasi invariabilmente, polmonare; la gravità dell'infezione risulta strettamente correlata allo stato immunitario dell'ospite ed al numero di cellule fungine inalate. Particolarmente rischiosa e l'inspirazione di blastoconidi, conidi e spore di diametro inferiore ai 2 µm, in grado di penetrare nell'albero respiratorio fino a livello alveolare, dove l'assenza di epitelio vibratile riduce la possibilità di difesa aspecifica. Nei soggetti immunodeficienti si può avere, successivamente, una disseminazione prevalentemente ematica ma anche linfatica dell'infezione con possibile coinvolgimento di tutti gli organi interni e della cute (micosi disseminate).

Nelle infezioni disseminate è talvolta riscontrabile un tropismo tissutale da

parte del micete infettante, come nel caso del neurotropismo manifestato da

Cryptococcus neoformans. Molto meno rilevante è la via digestiva che esige la

23 presenza di stasi gastrointestinale. Solo in questo caso, infatti, i miceti, che di solito attraversano il tubo digerente senza produrre danni, sono in grado di penetrarne la mucosa.

Nelle micosi endogene l'agente eziologico è, invece, un micete commensale (ad esempio, specie del genere Candida) localizzato in genere nelle prime vie respiratorie, nella cute o nelle mucose. Il passaggio dallo stato di commensalismo a quello di parassitismo è mediato da numerosi fattori predisponenti (immunologici, endocrini, iatrogeni), anche in relazione ad un decremento della disponibilità locale di metaboliti e ossigeno.

Tab. 5 Infezioni più frequenti dovute a Candida e fattori associati predisponenti

24 L'invasione delle cellule lievitiformi nella sottomucosa, in mancanza di un'adeguata risposta immunitaria aspecifica e specifica, può successivamente condurre, per introduzione nel circolo ematico e linfatico, alla disseminazione sistemica (setticemia, endocardite, encefalite, pielonefrite)

.

1.2 MICETI DI INTERESSE MEDICO

I miceti di interesse medico sono quei miceti responsabili di micosi opportunistiche (Tab.6). Grazie allo sviluppo di tecniche di laboratorio sempre più specifiche e sensibili, il numero di miceti isolati in laboratorio da campioni clinici è aumentato sempre di più nel corso degli anni.

Tab.6 Miceti di interesse medico

25 1.2.1 IL GENERE CANDIDA

Il genere Candida è costituito da un eterogeneo gruppo di microrganismi che crescono prevalentemente sotto forma di lieviti, blastoconidi ovali che si replicano per gemmazione a varie condizioni di pH e temperatura

.

La maggior parte delle specie del genere Candida è capace di sostenere anche un tipo di crescita filamentosa dando origine a pseudoife, tipiche strutture settate che conferiscono al lievito un aspetto pseudomiceliare; C. albicans e C. dubliniensis sono in grado di formare anche ife

.

La distinzione tra ife e pseudoife si basa sulla modalità con cui queste strutture si originano. Le pseudoife si formano a partire dal blastoconidio per gemmazione: la nuova cellula rimane adesa alla cellula madre e si allunga, producendo un filamento che presenta una costrizione nella zona di giunzione tra le due cellule. Le ife propriamente dette, invece, si sviluppano a partire dal blastoconidio o da porzioni di ife già esistenti, si accrescono per crescita apicale (formazione di tubulo germinativo) con apposizione di parete cellulare (setti) nella porzione apicale del tubulo germinativo in crescita.

In vitro, i blastoconidi crescono sia a 25°C che a 37°C, dando origine a colonie con aspetto cremoso, emisferiche, dal caratteristico odore di lievito.

L'osservazione microscopica di preparati allestiti a partire dalla patina della colonia e colorati con il metodo di Gram, mette in evidenza la presenza di forme gemmanti e pseudomiceliali.

Il genere Candida comprende almeno 150 differenti specie, di cui

solamente alcune sono in grado di causare patologie nell’uomo: il 65% delle

specie appartenenti al genere Candida, infatti, non è in grado di crescere a 37°C,

26 requisito fondamentale affinché un microrganismo possa colonizzare ed eventualmente essere causa di processi patologici di varia natura

.

Alcune specie del genere Candida, e Candida albicans in particolare, sono abituali commensali della cute e delle cavità naturali dell’uomo; esse possono determinare l’insorgenza di processi patologici qualora si verifichi la rottura del delicato equilibrio con la flora batterica locale . Nella popolazione sana, infatti, vi è un equilibrio tra la capacità invasiva del lievito ed i meccanismi invasivi dell’ospite. L’insorgenza di un processo patogeno è una diretta conseguenza della rottura di tale equilibrio e ciò può essere determinato sia da diminuita resistenza dell’ospite, come avvalorato dall’alta incidenza di candidosi sintomatiche in individui immuncompromessi

sia dalla virulenza del ceppo infettante

.

Le specie appartenenti al genere Candida presentano un comportamento definito “opportunista”. Dati ottenuti da 180 ospedali americani, partecipanti al programma di sorveglianza nazionale delle infezioni nosocomiali (NNIS), riportano circa 27000 isolati fungini associati ad infezioni nosocomiali negli Stati Uniti, tra gennaio 1980 ed aprile 1990. Di questi le specie appartenenti al genere Candida sono presenti in circa 20000 casi.

I fattori predisponenti e le cause sono:

 aumento della chemioterapia, dei trapianti di midollo e di altri organi

associati a profonda immunodepressione;

 soggiorni prolungati in ospedale;

 cateterizzazione vascolare;

 somministrazione prolungata di agenti antimicrobici ad ampio spettro;

 uso estensivo di farmaci antifungini come profilassi(46);

27 Wright e Wenzel

, in una revisione di pazienti con candidasi nosocomiale , riportano come fattori di rischio addizionali siti di bruciature, punti di assistenza alla respirazione, colonizzazione da parte di Candida albicans e trasfusioni ripetute. Questi autori citano uno studio nazionale del 1996 su ospedali partecipanti, condotto durante il programma di sorveglianza e controllo dei patogeni di importanza epidemiologica (SCO-PE), in cui le specie di Candida superano altre specie di microrganismi nel causare setticemie in pazienti ospedalizzati.

E’stato rilevato da un altro studio condotto da Kalin e Pedrini

che anche l’età avanzata può contribuire all’insorgenza di infezioni fungine come nel caso della stomatite da dentiera. Nella parte opposta dello spettro di età ci sono i neonati, anch’essi suscettibili a diverse infezioni fungine: tra le più comuni il mughetto infantile e la candidosi da pannolino

.

Le specie appartenenti al genere Candida possono causare anche vulvovaginiti in caso di disordini ormonali ed infezioni profonde e/o sistemiche in soggetti infetti da virus ad azione immunosoppressiva ( HIV, HTLV I e II).

Pfaller et all. nel 2007

hanno rilevato, in uno studio, che il 90% di infezioni del circolo ematico sono associati a cinque specie appartenenti al genere Candida e sono: C.albicans (62.3%), C. glabrata (12%), C.tropicalis (7.5%), C.parapsilosis (7.3), C.krusei (2.7). Il resto appartiene ad altre specie di Candida tra cui C.dubliniensis, C.guilliermondii, C.lusitaniae, C.rugosa, C.famata.

Le infezioni da Candida rappresentano una delle principali cause di

morbosità e mortalità nei soggetti immunocompromessi

.

28 1.2.2 CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS

Cryptococcus neoformans (Filobasidiella neoformans) è un lievito capsulato opportunista, ubiquitario. Esso ha come habitat naturale il suolo, contaminato da escrementi di piccione, galline o tacchini in cui il pH è alcalino e l’elevata concentrazione di azoto promuove, in modo particolare, la replicazione del microrganismo. Le cellule lievitiformi possono diventare volatili nelle nuvole di polvere che si creano durante i processi di pulizia massiccia e le escavazioni.

Fig. 11 Pseudoife di Candida albicans al microscopio ottico

Fig. 12 Forma blastoconidiale e pseudoifale di Candida albicans

29 Inoltre i lavoratori in allevamenti di polli, i custodi dei parchi frequentati da stormi e altri uccelli e gli speleologi, che possono esplorare cave infestate da pipistrelli, sono particolarmente a rischio, possono facilmente contrarre l’infezione.

C. neoformans è l’agente eziologico della criptococcosi. Il suo principale fattore di virulenza è rappresentato dalla presenza di una capsula mucopolisaccaridica costituita da galattoxilomannani e glucoronoxilomannani. La capsula favorisce l’aderenza alla superficie della mucosa, inibisce la migrazione leucocitaria e la fagocitosi. Il C. neoformans ha un tropismo particolare per il sistema nervoso centrale ed in molti casi può dare meningite. Esso produce un pigmento melaninico che lo protegge dal danno ossidativo, produce proteinasi, mannoproteine, rilascia metaboliti poliolici che favoriscono l’invasione e la distruzione cellulare osservabile nei siti di infezione

.

La capsula, che caratterizza cinque tipi sierologici (A, B, C, D ed AD),

può essere messa in evidenza in laboratorio sospendendo le cellule di C. neoformans in inchiostro di china (Fig.13)

L’infezione viene contratta solitamente per via aerogena, molto più

raramente per via digestiva e la localizzazione primaria, quasi invariabilmente, è

polmonare. Si ritiene che l'infezione inizi nel polmone, per inalazione di cellule

lievitiformi, e, successivamente, dissemini per via ematica, soprattutto in soggetti

immunocompromessi, ad altri distretti. A causa dello specifico tropismo di

C. neoformans per il sistema nervoso centrale, le complicanze più diffuse sono

rappresentate da leptomeningiti che possono evolvere in meningoencefaliti

. Lo

specifico tropismo tissutale sembra dovuto alla presenza di creatinina ed

30 asparagina, fattori stimolanti la crescita del fungo, e dalla scarsa presenza di fagociti

.

La criptococcosi è endemica in tutto il mondo; il fungo è frequentemente isolato dalle feci di piccione o di altri uccelli, rimane vitale per molti mesi e può contaminare il suolo divenendo una fonte di infezione.

Il contatto con le varietà di C.neoformans non comporta, solitamente, l'insorgenza di sintomi clinici nell'ospite immunocompetente. Le cellule infettanti sono, infatti, eliminate dai macrofagi alveolari o contenute in un granuloma polmonare che induce la produzione di anticorpi. Alcune infezioni possono andare incontro ad uno stato di latenza e in presenza di condizioni predisponenti, riattivarsi e causare malattia. Una aumentata sensibilità all'infezione è di solito correlata con un'immunodeficienza cellulo-mediata in particolare a carico dei linfociti Th. Tale situazione è tipicamente osservabile in pazienti neoplastici, affetti da AIDS o sottoposti a terapie immunosoppressive come i soggetti trapiantati, per i quali questa micosi viene definita come tipica "malattia segnale"

(103)

. La criptococcosi, infatti, è un’infezione poco comune, emersa come importante causa di morbosità e mortalità tra le persone affette da AIDS sia nei paesi sviluppati sia in quelli in via di sviluppo durante gli anni 80 e 90

.

Negli Stati Uniti, uno studio di sorveglianza condotto tra il 1992 e il 2000

ha consentito di documentare una diminuzione nell’incidenza dell’infezione tra i

malati di AIDS, per la maggior parte dovuta all’uso intensivo di farmaci

anti-retrovirali.

31 1.2.3 IL GENERE ASPERGILLUS

Il genere Aspergillus comprende ifomiceti saprofiti diffusi in ogni ambiente, tanto da risultare fra i più comuni contaminanti delle colture microbiche.

Tutte le specie appartenenti al genere sono caratterizzate dalla loro particolare modalità di riproduzione conidiale: la presenza di un conidioforo terminante con un rigonfiamento denominato vescicola; su quest’ultima si formano le fialidi, direttamente o attraverso una serie di corte cellule sterili dette metulae (sterigmates); ogni fialide produce una catena di conidi ramificati (spore);

l’insieme della vescicola, delle fialidi e dei conidi prende il nome di testa aspergillare (Fig. 14)

Fig. 13 Capsula di Cryptococcus neoformans evidenziata con inchiostro di china al microscopio ottico

32 Anche se la maggior parte degli aspergilli non presenta la forma di riproduzione sessuale, alcuni di essi sono in grado di produrre delle formazioni sessuate dette cleistoteche contenenti degli aschi ad 8 ascospore. Nel genere è incluso un gran numero di specie (185), raccolte in ben 18 gruppi, la cui chiave tassonomica di identificazione sfrutta caratteristiche colturali diverse:

macroscopiche, in base alla morfologia e colore della colonia e microscopiche, in base alla morfologia delle teste aspergillari, morfologia delle fialidi e della vescicola, presenza o meno di metulae, forma e dimensione dei conidi

.

Gli aspergilli sono l’agente eziologico dell’aspergillosi, termine che definisce diversi quadri clinici causati da alcune delle circa 180 specie del genere Aspergillus.

Aspergillus fumigatus è il più frequente agente eziologico di aspergillosi umana, anche se numerose altre specie possono essere considerate come

Fig. 14 Caratteristiche del genere Aspergillus

33 potenziali agenti eziologici di tale infezione, soprattutto negli ospiti immunocompromessi. Le specie appartenenti al genere Aspergillus presentano una distribuzione geografica cosmopolita e vivono nel suolo allo stato saprofitario nutrendosi di detriti vegetali ed animali. L'infezione, spesso riscontrabile esclusivamente a livello autoptico, si contrae per inalazione dei conidi prodotti in notevole quantità nell'ambiente naturale e disseminati dal vento.

La malattia presenta un decorso diverso a seconda del tipo di infezione, della quantità di conidi inalati e delle condizioni generali del soggetto infettato.

La localizzazione più frequente è quella polmonare, in cui svolge un ruolo importante l'adesività dei conidi aspergillari, probabilmente mediata dal fibrinogeno. Le forme invasive si presentano, radiologicamente, come una broncopolmonite con infiltrati multipli o come una massa singola ad aspetto tumorale per la diagnosi della quale risultano utili la tomografia assiale computerizzata e la risonanza magnetica nucleare

.

I ceppi riconosciuti patogeni sono oggi circa una ventina ed appartengono

per circa il 56% alla specie A. fumigatus, in ragione della sua termotolleranza a

37°C. Le altre specie di Aspergillus associate ad infezioni comprendono A. flavus

(19%) e A. terreus (16%). Quest’ultimo è stato visto emergere solo negli ultimi

anni ed è motivo di preoccupazione in quanto è meno suscettibile di A. fumigatus

a farmaci come l’amfotericina B ed ha la capacità di provocare infezioni

fulminanti invasive in pazienti immunocompromessi. Alcuni agenti antifungini

più recenti, tra cui vorniconazolo, posaconalzolo e caspofungina sono attivi contro

uno spettro di specie di Aspergillus, compreso A. terreus

.

34 1.2.4 I DERMATOFITI

I dermatofiti, ifomiceti appartenenti a tre generi, Trichophyton,

Microsporum ed Epidermophyton, sono responsabili di dermatofitosi (o dermatofizie), tra le più frequenti micosi cutanee, riconosciute sin dall'antichità

a causa delle evidenti e caratteristiche lesioni cliniche manifestate.

Questi miceti sono suddivisi in geofili, zoofili o antropofili, in relazione alla possibilità di isolamento preferenziale, rispettivamente, dal suolo, dagli animali o dall'uomo. Le infezioni da dermatofiti antropofili si trasmettono, prevalentemente, per contatto diretto oppure, meno frequentemente, per esposizione a materiali, quali indumenti intimi, o a strumenti contaminati come forbici e spazzole da barbiere. I dermatofiti antropofili, presunti parassiti obbligati, sono di sempre minore isolamento clinico nei paesi industrializzati, probabilmente a causa delle migliorate condizioni socio economiche che hanno portato nelle popolazioni all'abolizione di situazioni di promiscuità ed utilizzo di materiali comuni.

Alla diminuita incidenza dei dermatofiti antropofili ha fatto riscontro, nel corso del secolo scorso, un complementare incremento dei dermatofiti zoofili, e di Microsporum canis in particolare, lasciando ipotizzare, epidemiologicamente, un ruolo fondamentale esercitato dagli animali d'affezione (cani, gatti) e da pascolo (mucche, pecore, capre) nella diffusione delle dermatofitosi umane

.

Negli ultimi anni, infatti, sono state sempre più frequentemente riscontrate

dermatofitosi contratte da agricoltori e da veterinari a contatto con animali da

allevamento, conigli in particolare, e animali domestici con infezioni

35 dermatofitiche. Non deve essere trascurata, inoltre, la possibilità di contrarre infezioni dermatofitiche frequentando piscine molto affollate.

I dermatofiti sono caratterizzati da uno spiccato tropismo per i tessuti cheratinizzati nonostante la cheratina non rappresenti un fattore essenziale di crescita in vitro.

Le dermatofitosi sono anche denominate tigne (tinea) e contraddistinte in relazione alla sede anatomica infettata: tinea barbae, tinea capitis, tinea corporis, tinea cruris, tinea faciei, tinea favosa, tinea imbricata, tinea manuum, tinea pedis, tinea unguium. Qualunque sia il sito anatomico interessato, il dermatofita determina nell'ospite coinvolto una reazione di tipo eczematoso, seguita da manifestazioni infiammatorie ed allergiche . Diverse specie di dermatofiti possono provocare lesioni simili, così come un'unica specie può essere responsabile di varie forme cliniche di dermatofitosi

.

Trichophyton rubrum è l’agente eziologico più comune delle dermatofitosi anche se T. mentagrophytes, M. canis, M. gypseum ed Epidermophyton floccosum sono spesso associati a questo tipo di infezione. Recentemente, Tricofiton tonsurans è stato isolato sempre più frequentemente da pazienti con tigna in America, Europa e Giappone. Malattie infettive causate da dermatofiti costituiscono nel mondo uno dei più importanti gruppi di infezioni fungine, così come le infezioni da Candida.

Nonostante la sintomatologia delle dermatofitosi sia facile da

diagnosticare, il quadro clinico delle dermatofitosi in ospiti immunocompromessi

è spesso atipico e la diagnosi, in questi casi, risulta più difficile. Tali osservazioni

suggeriscono che una identificazione corretta a livello di specie di un agente

36 eziologico coinvolto nelle dematofitosi è necessaria per una rapida diagnosi e per approntare un trattamento accurato

.

La maggior parte delle specie di dermatofiti produce due tipi di conidi nella forma colturale di crescita: grandi e pluricellulari con setti trasversali (macroconidi) e piccoli e unicellulari (microconidi)

.

L’identificazione dei dermatofiti è di solito basata sull’osservazione delle caratteristiche morfologiche di colonie mature e sull’osservazione microscopica delle strutture riproduttive asessuate (micro e macroconidi). Tuttavia, l’identificazione morfologica richiede tempi lunghi ed una certa esperienza dell’operatore, in quanto, talvolta, specie diverse di uno stesso genere possono mostrare poche differenze nelle caratteristiche morfologiche micro e macroscopiche

.

1.2.5 IL GENERE FUSARIUM

Fusarium è un genere frequentemente coinvolto in ialoifomicosi, micosi

opportuniste causate da ifomiceti ialini, caratteristiche di pazienti con gravi forme

di neutropenia. Le infezioni comprendono cheratiti, onicomicosi e,

occasionalmente, peritoniti

Dal punto di vista epidemiologico, gli agenti

eziologici sono saprofiti ambientali o fitopatogeni, per cui il semplice riscontro

colturale non è sufficiente per la diagnosi di ialoifomicosi, che deve essere sempre

confermata dalla sintomatologia clinica e dalla contemporanea indagine

istologica.

37 Nell'ambito del genere Fusarium la specie più frequentemente associata a forme di infezione invasiva profonda è F. solani, anche se sono stati riportati casi di infezioni gravi sostenute anche da altre specie, come F. oxysporum, F.

verticillioides e F. moniliforme

.

I granulociti neutrofili ed i macrofagi svolgono un ruolo essenziale nelle difese immunitarie nei confronti di Fusarium spp. che, pur essendo diffusamente presente nell'ambiente, è solo occasionalmente associato a gravi infezioni nel soggetto non neutropenico.

I casi di fusariosi invasiva profonda descritti in letteratura sono stati diagnosticati in oltre il 95% dei casi in soggetti affetti da emopatie maligne, solo occasionalmente, in altre categorie di pazienti immunocompromessi come pazienti affetti da HIV, con tumori solidi o sottoposti a trapianto d'organo.

Esistono solo tre segnalazioni di fusariosi invasiva in soggetti senza apparenti alterazioni del sistema immunitario

La mortalità in corso di infezione disseminata e elevatissima (oltre il 70%) e la prognosi è strettamente correlata al ripristino del numero dei granulociti neutrofili, senza il quale la sola terapia antifungina è difficilmente in grado di modificare il decorso fatale dell'infezione.

La singolare associazione di F. solani con casi di cheratite, favoriti dal prolungato uso di lenti a contatto contaminate, potrebbe essere riferita all'attività collagenolitica del fungo ed all'evidenza della sua rapida crescita, in vitro, su tessuto corneale

.

I ceppi dematiacei come Alternaria, Aureobasidium, Bipolaris,

Cladosporium, Curvularia e i ceppi ialini come Acremonium, Fusarium,

Paecilomyces, Scopulariopsis sono ceppi da tenere in considerazione quando

38 sono isolati da materiale cutaneo o ungueale. Frequenti sono anche le oculomicosi causate da specie dematiacee ed ialine

.

1.2.6 PENICILLIUM MARNEFFEI

La penicilliosi è una malattia rara, l’agente eziologico è un fungo patogeno opportunista: Penicillium marneffei. In contrasto con la distribuzione ubiquitaria di altre specie di Penicillium, comuni contaminanti ambientali, Penicillium marneffei è endemico nell’Asia Sud-Orientale ed è responsabile di gravi infezioni opportunistiche disseminate in persone con difetti nell’immunità cellulo-mediata, come soggetti con patologie tumorali, malattia di Hodgkin e, specialmente, in individui affetti da AIDS

. Prima della pandemia di AIDS, P. marneffei veniva riportato in casi sporadici. Tuttavia, con la diffusione in questa regione del virus umano dell’immunodeficienza, l'infezione opportunistica da P. marneffei è aumentata significativamente ed è stata descritta sempre più frequentemente

.

Nel paziente immunocompromesso le infezioni disseminate autoctone o importate, successive ad una localizzazione polmonare primaria contratta in seguito ad inalazione di conidi dell'agente eziologico dall'ambiente di zone endemiche quali Cina, Hong Kong, Indonesia, Tailandia, possono dare luogo a lesioni cutanee, eventualmente ulcerate, con possibile interessamento osseo.

Casi di infezione da P. marneffei sono stati riportati anche tra soggetti HIV

positivi in Italia, Stati Uniti, Regno Unito, Paesi Bassi, Francia, Germania,

Svizzera, Svezia, Australia e Giappone, dopo che questi ultimi avevano visitato la

regione endemica

39 Le vie di infezione e i meccanismi di patogenicità di P. marneffei, tuttavia, devono ancora essere del tutto delucidati. La via di infezione, nella maggior parte dei casi, è rappresentata dall’inalazione di conidi di P. marneffei; si pensa infatti che l'abilità dei conidi di persistere all'interno dell'ospite rappresenti un requisito essenziale per l’insorgenza dell'infezione

.

P. marneffei è un fungo dimorfico, cioè è in grado di convertirsi da forma miceliare non patogena, in condizioni ambientali, a una forma tissutale di lievito a seguito di inalazione di conidi a livello polmonare. Si ritiene che la fase di transizione da micelio a lievito sia la chiave della patogenicità di questo micete, anche se il meccanismo che regola questa transizione di fase è ancora oggi sconosciuto

.

1.3 DIAGNOSI MICROBIOLOGICA DI MICOSI

Una corretta diagnosi di micosi dovrebbe essere, auspicabilmente, la sintesi ottenuta da osservazioni cliniche sul paziente e da indagini microbiologiche dirette (microscopia e coltura) ed indirette (sierologia). Quando si sospetta una infezione, non bisogna escludere l’infezione fungina, dato il crescente numero di individui a rischio per tale tipo di malattia. Non si può quindi classificare un fungo “contaminante o insignificante” quando è isolato da materiale clinico. E’ chiaro che la prognosi e la risposta alla terapia varia con il tipo di fungo infettante e con lo stato immunologico del paziente.

In generale la prima diagnosi di infezione fungina è una diagnosi clinica,

che nel caso di micosi invasive è effettuata anche attraverso esami strumentali

40 (TAC,NMR,Rx). Tuttavia gli esami clinici e strumentali mancano di specificità e consentono al massimo di porre una diagnosi presuntiva.

Per una diagnosi definitiva sono necessari tre tipi di indagini di laboratorio: microbiologica. immunologica, istopatologia.

L’esame microbiologico oggi può essere utilmente integrato dai saggi molecolari (PCR, RT-PCR) utili per tipizzare la specie fungina. In ogni caso l’esame microscopico diretto in combinazione con l’esame colturale e/o biopsia, in alcuni casi, rappresenta la prova diagnostica principale per identificare il microrganismo responsabile. Per alcune malattie fungine è necessaria la sierologia per evidenziare antigeni fungini e/o anticorpi dell’ospite.

La diagnosi di laboratorio di una infezione fungina, come per tutte le infezioni in genere, è strettamente dipendente da un prelievo ben eseguito di un materiale clinico appropriato e da una pronta consegna del campione al laboratorio attraverso un corretto mezzo di trasporto.

I campioni devono essere prelevati asetticamente o dopo decontaminazione del sito del prelievo e devono essere posti in contenitori sterili sigillati, in quantità adeguata per l’esame microscopico e colturale, accompagnati da una completa storia clinica

.

La diagnosi di laboratorio delle specie fungine si basa fondamentalmente

sull’indagine microbiologica e la dimostrazione microscopica e/o colturale

dell’agente eziologico resta tuttora la prova diagnostica principale. Tuttavia

importanti indicazioni sono fornite, soprattutto nelle micosi profonde, dalle

ricerche sierologiche

.

41 Con il passare degli anni le tecniche di laboratorio e gli strumenti utilizzati per l’identificazione e tipizzazione dei funghi sono aumentati. Oggi insieme alla biologia molecolare viene impiegata per l’identificazione anche la spettrometria di massa.

Nella tabella 7 sono riportate le principali indagini di laboratorio per la diagnosi microbiologica delle specie fungine.

42 1.3.1 ESAME MICROSCOPICO

La diagnosi di micosi effettuata mediante esame microscopico diretto, quando viene eseguita correttamente, è tra le più sicure. Viene altamente raccomandato, infatti, di eseguire un esame microscopico diretto sulla maggior parte dei campioni inviati per la coltura fungina. Questo esame non solo fornisce una diagnosi presuntiva immediata per il medico curante ma può anche essere un aiuto fondamentale per la scelta del terreno di coltura

.

Si può effettuare l’osservazione microscopica diretta (esame morfologico) se i materiali patologici sono fluidi; nel caso di materiali densi e compatti (squame epidermiche, peli, frammenti di unghia o di tessuto) può essere necessario il preventivo trattamento a caldo con soluzioni di idrato sodico e potassico al 10%, che ne determinano una sufficiente trasparenza per idrolisi dei costituenti lipidci, proteici e, in parte, polisaccaridici. L’osservazione degli elementi fungini, la cui parete ricca di glucani alcali resistenti, risulterà grandemente facilitata. In aggiunta, possono essere utilizzate anche colorazioni di Gram, Giemsa ed altre, soprattutto quando l’osservazione microscopica diretta può essere ancora più importante della coltura. La colorazione negativa con inchiostro di China del liquido-cefalo rachidiano risulta particolarmente utile nella diagnosi presuntiva di criptococcosi meningo-encefalica.

L’esame microscopico e quindi la ricerca di miceti su preparati istologici,

viene eseguita utilizzando colorazioni micologiche specifiche come la colorazione

al PAS (Periodic Acid-Schiff), il metodo Gridley, il metodo Gomori-Grocott e

altre

.

43 L’esame diretto del materiale patologico, sia a fresco, sia su preparati istologici, ha acquisito un’importanza sempre maggiore in relazione all’aumento di ospiti immunodepressi soggetti alle infezioni opportuniste da miceti. In tali pazienti le indagini sierologiche più convenzionali che utilizzano anticorpi specifici, possono risultare negative poiché non per tutte le micosi è possibile praticare la ricerca di antigeni in circolo.

La diagnosi istologica è rapida, poco costosa, può essere implementata dall'indagine in immunofluorescenza e, compatibilmente con l'agente eziologico coinvolto, può essere realizzata anche con un’adeguata colorazione, che insieme all’esperienza dell'osservatore consentono la necessaria accuratezza diagnostica.

Per alcune micosi, causate da specie uniche nell'ambito di un genere, la diagnosi istologica può risultare assolutamente specifica; per altre, causate da varie specie congeneriche, la diagnosi è invece generica. Per altre ancora, ad eziologia composita, è il tipo di micosi a poter essere identificato.

Una più grossolana ma fondamentale, distinzione può essere fatta, inoltre, dall'osservazione dei granuli nei casi di micetoma, per appurare se essi siano di natura eumicotica od actinomicotica

.

1.3.2 INDAGINI COLTURALI

Il più tradizionale approccio diagnostico delle micosi è l’identificazione

colturale dell’agente eziologico, essenzialmente basata sull’osservazione delle

caratteristiche macro e microscopiche di colonia. Questa tecnica presenta alcuni

svantaggi dovuti, soprattutto nel caso degli ifomiceti, alla lunghezza dei tempi di

44 crescita ed alla laboriosità di alcune delle metodologie di identificazione utilizzate.

L’esame colturale è di fondamentale importanza sia perché può risultare positivo anche in caso di negatività della ricerca microscopica diretta, sia perché quest’ultima non fornisce, salvo eccezioni, elementi definitivi per l’identificazione specifica del micete

.

Le tecniche colturali utilizzate in micologia medica sono simili a quelle adottate in batteriologia. Poichè i miceti lievitiformi appartengono alla flora normale dell’orofaringe, della vagina e dell’apparato gastro-enterico il loro isolamento dall’escreato, da tamponi faringei e vaginali, da lavaggi gastrici e dalle feci, ha un’importanza clinica discutibile. Spesso il significato dell’isolamento dei miceti lievitiformi da questi campioni deve essere stabilito dall’anamnesi clinica, mentre l’isolamento ripetuto di miceti lievitiformi da una serie di campioni sequenziali provenienti dallo stesso paziente è fortemente indicativo di un’infezione in atto.

Due tipi principali di terreni di coltura sono essenziali per l’isolamento primario dei miceti da campioni clinici: un terreno non selettivo, che deve permettere la crescita di tutti i miceti, e un terreno selettivo, addizionato con antibiotici, in cui viene favorita la crescita dei funghi e inibita quella dei batteri costituenti la normale flora endemica. La scelta di utilizzo di terreno non selettivo o selettivo dipende dalla natura del campione (monomicrobico o polimicrobico).

Il terreno universalmente utilizzato per l'isolamento dei miceti da materiale

patologico è l'agar Sabouraud, definito nel tardo ottocento da Raymond. Tale

terreno è costituito, essenzialmente, da glucosio e peptone con valore di pH 5,6

45 circa. Addizionato spesso con antibiotici quali cloramfenicolo, per eliminare la popolazione batterica eventualmente presente, e cicloeximide, un antimicotico idrosolubile isolato da Streptomyces noursei, per inibire miceti contaminanti a rapida crescita, attivo su gran parte delle muffe contaminanti.

Alcune specie di miceti patogeni sono, tuttavia, sensibili alla cicloeximide (Actidione) e pertanto il terreno contenente tale antibiotico non deve essere utilizzato come unico mezzo di crescita (ad es. Cryptococcus neoformans).

I miceti patogeni crescono bene, solitamente, sui più comuni terreni di coltura in condizioni di aerobiosi, sia a temperatura ambiente (25°C), sia a 37°C.

E’ utile incubare le colture dei miceti a entrambe le temperature, in modo da poter isolare anche i funghi dimorfi: infatti, a 25-30°C il fungo dimorfico si sviluppa come ifomicete, mentre a 35-37°C nella forma di lievito. L'esame colturale prevede l'incubazione per periodi più o meno lunghi (fino a sei settimane), che variano a seconda del tipo di materiale e dell’agente eziologico sospettato presente nel campione.

La maggior parte delle specie appartenenti al genere Candida formano su

terreno solido, nell’arco di 24/48 ore, colonie di colore bianco e di consistenza

cremosa (Fig.15).

46 Per gli ifomiceti è molto importante valutare macroscopicamente la colonia, ossia: l’aspetto, la consistenza, il colore della superficie ed il colore del retrocolonia, le dimensioni e la produzione di pigmenti sul terreno di isolamento.

1.3.3 SISTEMI DI IDENTIFICAZIONE DEI LIEVITI

L’identificazione dei lieviti si basa essenzialmente sulla valutazione delle caratteristiche biochimiche e metaboliche (proprietà enzimatiche).

Attualmente, l’identificazione dei lieviti viene effettuata principalmente tramite sistemi semiautomatici. I saggi vengono effettuati in dispositivi miniaturizzati che vengono letti da sistemi automatici in grado di fornire, in un tempo variabile tra 4 e 48 ore, l’identificazione di specie.

Il sistema Vitek 2 AMS (antimicrobic system) yeast biochemical card (Vitek System, bioMerieux, Francia) è costituito da un supporto plastico contenente una serie di pozzetti separati, all’interno dei quali sono presenti

Fig. 15 Candida albicans su Sabouraud CG agar (BD)

47 substrati disidratati per la determinazione dell’utilizzazione di carboidrati e altre reazioni biochimiche(Fig.16).

Dopo l’isolamento primario su piastra, viene allestita una sospensione batterica del microrganismo a densità ottica standardizzata (2 McFarland). Il sistema prevede l’inoculo della sospensione nei pozzetti delle card ID di Vitek 2 (per i lieviti, yeast card ID).

Il sistema Vitek 2 (Fig.17) per l’identificazione dei microrganismi isolati si avvale di un sistema ottico sia a fluorescenza sia a trasmittanza,.

Il sistema esegue un monitoraggio continuo nel tempo della crescita fungina e dell’attività dei microrganismi inoculati nei pozzetti delle card ID di Vitek 2, permettendo una identificazione in tempi rapidi del microrganismo in esame. I contenitori sono incubati in un modulo di lettura automatica, dove un fotorilevatore evidenzia un aumento di torbidità nei pozzetti di reazione.

L’impulso elettronico della fotocellula raggiunge un microprocessore programmato che identifica il microrganismo ed indica il nome della specie sul monitor.

Un altro metodo semiautomatizzato per l’identificazione rapida di lieviti è il Rapid Yeast Plus (Remel, USA). Questo sistema utilizza un pannello con 18 substrati che, sfruttando le capacità biochimiche specifiche dei lieviti, permette di identificare, in 4 ore, più di 40 specie rilevanti dal punto di vista clinico.

Il risultato colorimetrico di ogni galleria è interpretato da un software che

identifica la specie del lievito in esame.