Dr.ssa Chiara Severoni Dr.ssa Maria Carla Menconi Prof. Antonio Lucacchini C R ’ ” “ D - Tesi di Specializzazione: Corso di Specializzazione in Biochimica Clinica F F U S P

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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PISA

FACOLTÀ DI FARMACIA

Corso di Specializzazione in Biochimica Clinica

Tesi di Specializzazione:

“ DETERMINAZIONE SEMI-QUANTITATIVA DELLA ISOFORMA DI

PROTEINA PRIONICA ASSOCIATA ALL’INFETTIVITÀ ”

CANDIDATO RELATORE

Dr.ssa Chiara Severoni Dr.ssa Maria Carla Menconi

Prof. Antonio Lucacchini

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I

NDICE Elenco abbreviazioni………. 4 Riassunto……… 6 Abstract……….. 8 CAPITOLO 1: Introduzione ……….. 10 1.1 Malattie da prioni………..……....10 1.2 PrPSc e PrPc………….……….. 13

1.3 Diagnosi delle malattie da prioni………. 15

1.3.1 Diagnosi clinica……….. 16

1.3.2 Diagnosi Istopatologica………. 16

1.3.3 Saggi di infettività ……….. 18

1.3.4 Diagnosi molecolare……….. 19

1.4 Saggi diagnostici di recente sviluppo……….. 20

1.4.1 Conformational Dependent Immunoassay………... 20

1.4.2 Elettroforesi capillare……… 21

1.4.3 Cell Blot e Slot Blot……… 21

1.4.4 DELFIA test su campioni estratti con cloridrato di guanidina ………22

1.4.5 PMCA (Protein Misfolding Cycling Amplification)……….….22

1.4.6 Immunosaggio Prionics AG………...22

1.4.7 FMI, FCS, FT-IR, SIFT………23

1.4.8 Aptameri………. 23

1.5 Ulteriori marker diagnostici………... 24

1.6 Test diagnostici su sangue……… 25

1.7 vCJD e utilizzo di plasma-derivati………....26

SCOPODELLATESI………. 29

CAPITOLO2:Materiali e metodi………...31

2.1Reagenti e soluzioni………...31

2.2Strumenti per elettroforesi e blotting………... 31

2.3 Campioni………... 32

2.4 Principio del metodo………. 32

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3

2.5.1 Digestione dei campioni con proteinasi K……… 33

2.5.2 Denaturazione e diluizioni seriali dei campioni………... 33

2.5.3 Separazione mediante elettroforesi ………...34

2.5.4 Trasferimento delle proteine su membrana………. 34

2.5.5 Immunodetection………...35

2.5.6 Criteri di accettazione e condizioni di retesting………36

2.6 Validazione del metodo………. 37

2.6.1 Verifica della linearità………...38

2.6.2 Verifica dell’accuratezza………... 39

2.6.3 Verifica della precisione intermedia………. 40

2.6.4 Verifica della precisione entro la serie………. 40

2.6.5 Verifica del range del metodo………41

2.6.6 Verifica della robustezza del metodo……….41

2.6.7 Limite di quantificazione……….. 43

CAPITOLO3:Risultati……….. 44

3.1Dati grezzi……….. 44

3.2Elaborazione dati……….. 74

3.2.1 Verifica della linearità……….. 74

3.2.2 Verifica dell’accuratezza………... 74

3.2.3 Verifica della precisione intermedia………. 75

3.2.4 Verifica della precisione entro la serie………. 76

3.2.5 Verifica del range del metodo………... 76

3.2.6 Verifica della robustezza del metodo……… 77

3.2.7 Verifica limite di quantificazione………. 79

CAPITOLO4:Discussione………. 80