Specificità nucleofila nella antranilato sintasi, amminodeossicorismato sintasi, isocorismato sintasi e salicilato sintasi.
Antranilato sintasi (AS), amminodeossicorismato sintasi (ADCS), isocorismato sintasi (IS) e salicilato sintasi (SS) sono enzimi strutturalmente omologhi che utilizzano corismato e che eseguono il primo importante step nella formazione di triptofano, folato e i siderofori enterobactina e micobactina rispettivamente; ciascun enzima catalizza una reazione di sostituzione nucleofila, ma IS e SS sono in grado di impiegare unicamente acqua come nucleofilo. E’ stato suggerito che Lys147 sia la base catalitica che attiva l’acqua per l’attacco nucleofilo nelle reazioni di IS e SS; in AS e ADCS, la glutammina occupa la posizione analoga. Per capire il ruolo della Lys147 come base catalitica, sono stati preparati i mutanti K147Q IS, K147Q SS,Q147K AS e Q147K ADCS e sono state analizzate le reazioni enzimatiche con cromatografia liquida ad alta prestazione [60]. Q147K AS impiega acqua come nucleofilo in misura ridotta, e le attività affini di K147Q IS e K147Q SS erano ridotte di circa 25 e 50 volte rispettivamente. Pertanto, Lys 147 non è la sola responsabile dell’attivazione dell’acqua come nucleofilo. Vengono proposti fattori aggiuntivi che contribuiscono all’attivazione dell’acqua. Un cambiamento nella preferenza del substrato per l’attività di piruvato liasi di K147Q SS indica che la Lys147 controlla parzialmente la specificità di reazione di SS. Infine, è stato dimostrato che AS, ADCS, IS e SS non possiedono attività promiscua di corismato mutasi [60].
La via dello scichimato si trova nei batteri, nelle piante, nei funghi e nei parassiti apicomplessi. Iniziando con fosfoenolpiruvato e D-eritrosio 4-fosfato e terminando con il corismato, permette la biosintesi de novo di composti aromatici carbociclici. Il corismato è il precursore comune di una varietà di metaboliti essenziali come la fenilalanina, la tirosina, il triptofano, il folato, i siderofori, i menachinoni e altri. Anche la produzione di diverse fenazine, note per trasmettere virulenza e capacità competitiva all’agente patogeno Pseudomonas aeruginosa, inizia con il corismato [61]. Il ruolo centrale degli enzimi che utilizzano corismato nella sopravvivenza di questi organismi e la loro assenza negli umani li rende target attraenti per erbicidi e farmaci antimicrobici. La figura 1 caratterizza sette punti di diramazione nel metabolismo del corismato. Ad eccezione della corismato liasi (CL) e corismato mutasi (CM), questi enzimi sono strutturalmente omologhi. Le strutture cristalline a raggi X dell’antranilato sintasi (AS), della deossicorismato sintasi (ADCS), della isocorismato sintasi (IS) e della salicilato sintasi (SS) rivelano che sono proteine altamente simili con siti attivi conservati [52, 54]. Queste somiglianze, insieme a numerose prove biochimiche, hanno portato He a proporre un meccanismo comune nel quale la catalisi inizia con un attacco nucleofilo in C2 del corismato, concomitante con la sostituzione del gruppo idrossile sul C4 in una reazione SN2’’[43].
In questo meccanismo, IS e SS impiegano acqua come nucleofilo, ma AS e ADCS no, nonostante la sua abbondanza (Figura 18). Invece AS e ADCS utilizzano ammoniaca che è fornita da glutammina ammidotransferasi, rispettivamente TrpG e PabA. ADCS è unico nell’uso di una lisina del sito attivo (K213) come nucleofilo iniziale che attacca in C2; in una seconda reazione SN2’’, l’attacco nucleofilo da parte di ammoniaca dell’intermedio covalente conduce al prodotto finale [43, 62]. ADCS e IS rilasciano il corismato con nucleofilo sostituito come prodotto, mentre AS e SS procedono oltre eliminando piruvato e rilasciando il prodotto aromatico risultante.
Figura 18: Il corismato subisce un attacco nucleofilo al C2 dall’ammoniaca (AS), dalla Lys213 (ADCS), o dall’acqua (IS e SS). SS e IS impiegano NH3 come nucleofilo se è fornito esogenamente, ma AS e ADCS sono incapaci di attivare l’acqua come nucleofilo. L’attività di K213A ADCS è adiuvata da (NH4)2SO4.
In AS e ADCS, la subunità simile dell’ammidotransferasi libera ammoniaca direttamente al sito attivo dove il corismato si lega e subisce sostituzione nucleofila. Si ritiene che esista un tunnel di ammoniaca tra i siti attivi dell’ammidotransferasi e del corismato amminante; questo è un meccanismo comune per evitare ammoniaca libera intracellulare [63, 64]. In assenza di L-glutammina e un’unità di ammidotransferasi, AS e ADCS possono impiegare (NH4)2SO4 come fonte di ammoniaca [43]. Sebbene ad IS e SS manchi una fonte di ammoniaca in vivo, ciascuno la accetterà come nucleofilo in vitro per formare rispettivamente amminodeossicorismato (ADIC) e antranilato [62]. Poiché le concentrazioni di ammoniaca intracellulare sono generalmente basse, IS e SS non hanno bisogno di sviluppare un mezzo di discriminazione contro questo nucleofilo. Comunque , dal momento che l’acqua è un nucleofilo povero e non è
utilizzato da AS e ADCS, l’attivazione dell’acqua deve esistere esclusivamente in IS e SS per spiegare la specificità nucleofila osservata per questi enzimi.
L’allineamento della sequenza indica che esiste un residuo di lisina conservato nel sito attivo in tutte le sequenze di IS e SS [48]. Un residuo di glutammina occupa la posizione analoga in tutte le sequenze di ADCS e AS. Le recenti strutture cristalline di MenF, un IS menachinone specifico, e Irp9, l’SS di Yersinia enterocolitica, rivelano che questa lisina è ben posizionata tra una molecola d’acqua ordinata e il C2 del corismato [52, 54]. Sulla base delle evidenze strutturali disponibili e del fatto che un mutante K147A di IS era inattivo, Kolappan e al. hanno proposto che la Lys147 sia il catalizzatore di base generico che attiva l’acqua per l’attacco nucleofilo nelle reazioni di IS e SS [48]. Cercando di fornire una spiegazione biochimica aggiuntiva nel ruolo catalitico della Lys147, è stata trasformata in una glutammina in Mbt1 (SS da Mycobacterium tubercolosis) e EntC (enterobactina specifico di IS); sono stati preparati anche i corrispondenti mutanti della glutammina in lisina di AS e ADCS che utilizzano ammoniaca [60]. Kebarh e al. hanno svolto esperimenti simili con AS e Irp9 di SS [65]. In questo studio, le reazioni catalizzate dall’enzima sono state svolte a pH 7 e le miscele del prodotto sono state analizzate con ¹H NMR; un cambiamento reciproco nella specificità nucleofila non è stato osservato. Il risultato principale di Kebarth e al. è stato che i mutanti di AS e Irp9 apparentemente catalizzano la formazione di fenilpiruvato. Come illustrato in Figura 19, Kebarth e al. hanno proposto che SS, K147Q di SS, e Q147K di AS catalizzano due reazioni successive promiscue: il riarrangiamento periciclico del corismato per formare prefenato, seguito dalla decarbossilazione e perdita d’acqua per formare il fenilpiruvato.
Figura 19: Abell e collaboratori hanno proposto il meccanismo per la formazione promiscua di fenilpiruvato da AS e SS. La conformazione diassiale del corismato subisce un riarrangiamento periciclico per formare prefenato, seguito da una decarbossilazione e da una generale perdita d’acqua acido-assistita. Glu197 è conservata in tutte le sequenze di AS e SS. I dati presentati dimostrano che queste reazioni non sono catalizzate da AS e SS.
La rimozione di Lys 147 non elimina la formazione di isocorismato da parte di IS e SS [60]. Se K147 è la base responsabile dell’attivazione dell’acqua come nucleofilo nelle reazioni catalizzate da IS e SS, allora ci si aspetta che la mutazione KQ renda questi enzimi incapaci di catalizzare la formazione dell’isocorismato. Inoltre, ci si aspettava che la capacità di catalizzare la formazione di ADIC e di antranilato da parte dei mutanti KQ, rispettivamente di IS e SS, rimanesse invariata rispetto a quella di WT IS e SS se veniva fornita ammoniaca esogena (Figura 18). Sorprendentemente, il mutante K147Q forma isocorismato nonostante abbia perso la sua base catalitica presunta, ad un tasso ridotto di ~ 25 volte relativo al tasso di WT. I dati di HPLC per WT IS riflettono una miscela equilibrata; il rapporto della concentrazione isocorismato/corismato è 0.56 che è identico al Keq riportato da Liu e al. [66]. Come ci si aspettava, K147Q di IS mantiene la capacità di catalizzare la formazione di ADIC e i dati di HPCL indicano che i tassi di formazione di ADIC da parte di WT e K147Q IS sono simili [60].
La Mutazione GlnLys Non Produce Alta Attività di IS in AS e ADCS. Nella situazione più semplice, ci si aspettava che la mutazione QK conferisse ad AS e K213A ADCS rispettivamente l’attività di salicilato sintasi e di isocorismato sintasi. Per ADCS, la mutazione K213A è stata introdotta per renderlo incapace di formare un intermedio covalente Lys213-corismato [62].
Attività di Aminotrasferasi della Glutammina di TrpG e PabA. AS è un eterotetramero che è composto da un eterodimero di TrpE-TrpG. ADCS è un eterodimero delle subunità PabA e PabB. Per verificare che la mutazione QK in PapB o TrpE non influenzi l’attività di aminotransferasi della glutammina, rispettivamente di PabA o TrpG, è stata monitorata la produzione di ammoniaca libera utilizzando la deidrogenasi del glutammato. PabA è un aminotransferasi condizionata; solo quando si trova in complesso con ADCS possiede attività [60]. I dati cinetici dell’aminotransferasi, ottenuti con WT e TrpE e PabA mutanti, confermano che né l’attività di TrpG, né quella di PabA è stata influenzata dalla\e mutazione\i rispettivamente di TrpE o PabB [60].
AS, ADCS, IS e SS Non Possiedono Attività Promiscue di Corismato Prefenato Deidratasi. Prima di essere sottoposti a una seconda purificazione, ogni enzima in esame, compresi i mutanti, hanno mostrato attività promiscua di corismato mutasi (CM). Inoltre, anche WT AS, Q147K AS, K213A ADCS e K213A/Q147K ADCS hanno mostrato attività di prefenato deidratasi (PDT). Ossia, hanno formato fenilpiruvato quando dotati di prefenato come substrato. Comunque, queste attività promiscue sono state o completamente rimosse o significativamente ridotte dopo che le proteine sono state sottoposte a un’ulteriore purificazione aggiuntiva (e.g., purificazione con scambio anionico, dopo la purificazione per affinità con il nickel) [60]. Il fenilpiruvato è il prodotto di decomposizione acido-catalizzata del prefenato.
Come già detto, la sopravvivenza di batteri, piante, funghi e parassiti apicomplessi dipende dall’attività di diversi enzimi che utilizzano corismato, che catalizzano il primo step importante nella biosintesi di aminoacidi aromatici, folato, siderofori, chinoni e altri. Questi enzimi sono bersagli attrattivi per i farmaci antimicrobici, ma non sono ancora stati sfruttati per questo scopo. Capire più pienamente i loro meccanismi catalitici può coadiuvare gli sforzi per scoprire il farmaco. AS, ADCS, IS e SS catalizzano ognuno una reazione di sostituzione nucleofila.
Una scoperta importante è che AS, ADCS, IS e SS non possiedono attività promiscua di CM [60]. L’attività di CM si osserva nelle proteine purificate singolarmente, ma scompare o è significativamente ridotta nelle proteine purificate due volte. Perciò, l’attività di CM, che originariamente si pensava essere un’attività promiscua di ADCS, AS, IS e SS, è dovuta ad una autentica corismato mutasi presente nelle proteine purificate singolarmente che sono state espresse da un ceppo di laboratorio di E. Coli [BL21(DE3)]. La corismato mutasi di E. Coli è un enzima bifunzionale, che possiede attività di mutasi e prefenato deidratasi, con un kcat di 50 s-1. Un tale enzima potrebbe generare un prodotto individuabile dopo 3 ore anche se presente in concentrazioni da nanomolare a picomolare.
La rimozione della proteina CM di E. coli contaminante attraverso schemi di purificazione secondaria ha facilitato gli sforzi di individuare la specificità nucleofila in AS, ADCS, IS e SS. In alcuni enzimi mutanti, quasi il 100% del corismato è convertito in fenilpiruvato. Così, la rimozione dell’attività di CM competitivo ha permesso l’individuazione attraverso HPLC di prodotti di reazione catalizzati da enzima mutante.
La conservazione di attività simili in K147Q IS e K147Q SS è stato un risultato sorprendente che contrasta con le precedenti relazioni [48, 65, 67]. E’ improbabile che questa attività si debba alla contaminazione di IS e SS di WT
nelle preparazioni di mutanti. Dopo che ogni mutante è stato sottoposto a un passo di purificazione aggiuntivo, l’attività di isocorismato sintasi è aumentata lievemente. Inoltre, i dati di HPLC [60] indicano che la mutazione QK permette ad AS di attivare l’acqua come nucleofilo, sebbene in misura minore. Con un limite di rivelabilità calcolato di HPLC di ~0.3 µM per l’isocorismato, l’introduzione di Lys147 in AS ha aumentato la sua capacità di attivare l’acqua al pH di almeno 100 volte rispetto a quella di WT. Le reazioni di WT non hanno mostrato quantità rilevabili di isocorismato o salicilato a pH 7, 8 o 9, mentre il mutante QK ha dato aumenti di 10 e 2 volte crescenti, rispettivamente a pH da 7 a 8, e da pH 8 a 9. Questi cambiamenti in funzione del pH sono meglio interpretati come deprotonazione di un catalizzatore di base generale nel sito attivo (che qui si suppone essere la Lys introdotta); essi sono incoerenti con l’idrossido che agisce come nucleofilo poiché si osserva solo un aumento di due volte crescente da pH 8 a 9, mentre un aumento crescente di 10 volte si osserva da pH 7 a 8.
Mentre i risultati descritti sopra concordano qualitativamente con l’affermazione di Kolappan secondo cui la Lys147 è la base catalitica [48], suggeriscono con forza che la Lys147 non è l’unico determinante dell’attivazione dell’acqua come nucleofilo data l’alta attività che rimane nei mutanti KQ. I risultati suggeriscono anche che in IS e SS un residuo diverso può agire come catalizzatore generale di base in assenza della Lys147; tuttavia, la sua identificazione non è possibile sulla base dei dati disponibili. Una spiegazione alternativa è che la Lys147 aumenta la reattività dell’acqua, 25, 50 e 100 volte rispettivamente in IS, SS e Q147K AS.
L’insuccesso dell’introduzione dell’attività di IS in ADCS con una mutazione QK e la quantità più piccola del previsto dell’attività di SS trasmessa ad AS attraverso la stessa mutazione ha suggerito un esame preciso degli allineamenti di sequenza multipla (54 in totale) e strutturali (6 in totale) di AS, ADCS, IS e SS. Questa analisi ha rivelato due caratteristiche strutturali aggiuntive che sono
in correlazione con la capacità di attivare l’acqua come nucleofilo: (1) la presenza di due accettori di legami a idrogeno, uno su ogni lato della Lys147, per posizionare appropriatamente il gruppo ε-amino verso il C2 del corismato e (2) la presenza di leucina o isoleucina in posizione 244 invece di metionina (Figura 20), che occupa la posizione analoga in tutte le sequenze di AS e ADCS.
Figura 20: Siti attivi di SS, IS, AS e ADCS. (A) Sovrapposizione dei residui Irp9 di SS (carboni grigi) e MenF di IS (carboni pesca). I residui IS che differiscono da SS sono indicati tra parentesi. Irp9 di SS cristallizza in presenza dei suoi prodotti di reazione salicilato e piruvato. La Lys147 è la presunta base catalitica che attiva l’acqua come nucleofilo. (B) Residui di AS (carboni grigi) e residui di ADCS analoghi (carboni pesca). I residui unici di ADCS sono indicati tra parentesi. Il corismato è stato sovrapposto sulla molecola del benzoato presente nella struttura cristallina di AS.
L’orientamento corretto della Lys147 rispetto al C2 del corismato è critica, dal momento che ci si aspetta che agisca come base generale (i.e. rimuovendo un protone dall’acqua contemporaneamente all’attacco di O sul C2). Questo viene ottenuto attraverso due legami a idrogeno, uno su ogni lato del gruppo ε-amino. Nella struttura di Irp9 SS, questi accettori di legame dell’idrogeno sono Ser245 e il carbonile dello scheletro della Glu241 (Figura 20 A). La Ser245 viene
conservata in tutte le sequenze di SS, mentre la leucina, l’isoleucina, e la valina si trovano in posizione omologa rispettivamente nelle sequenze di AS, ADCS e IS. Nella struttura di MenF IS, il carbonile dello scheletro della Ala 303, che è circa 3 Å dalla Lys, è posizionato per sostituire la Ser245 come accettore di legame a idrogeno. Le analoghe interazioni di legame dell’idrogeno non sono disponibili per posizionare correttamente il residuo di lisina introdotto nei mutanti QK, AS e ADCS. Questo può parzialmente spiegare la loro bassa attività di IS. Ogni sequenza di IS e SS contiene leucina o isoleucina in posizione 244. La Leu244 si trova nelle due strutture di SS e in una struttura IS disponibile. La Leu244 può anche coadiuvare il posizionamento corretto della Lys147 in IS e SS; dalle strutture sembra causare interazioni di van der Waals con i carboni del metilene della catena laterale della Lys147.
Il residuo di metionina conservato in posizione 244 nelle sequenze AS e ADCS è collegato con la loro specificità per l’ammoniaca come nucleofilo. Come mostrato in Figura 20B, un legame a idrogeno tra l’atomo di zolfo della metionina e la catena laterale dell’ammide della Gln147 è possibile. Questa interazione mantiene la catena laterale della Gln147 rivolta verso la Met244. Quando la Gln147 è tenuta in questa posizione, crea una cavità appropriatamente dimensionata attraverso la quale l’ammoniaca, proveniente attraverso il tunnel dal sito attivo di TrpG, può estrarre il C2 dal corismato.
Un’analisi di correlazione posizionale a coppie delle sequenze 54 AS, ADCS, IS e SS, eseguite utilizzando il programma online CRASP [68], ha confermato l’ipotesi che l’identità del residuo 244 sia una componente critica della specificità nucleofila mostrata da questi enzimi. Nell’analisi CRASP, il parametro dell’ “energia di trasferimento dall’acqua all’etanolo” è stato scelto con una soglia di variabilità di 2 e un valore di prodotto di rilievo del 99.99%. Secondo questi parametri , si è scoperto che la Lys147 è correlata alla Leu244 con un valore di correlazione lineare di 0.98. La Leu244 corrisponde alla metionina in tutte le sequenze AS e ADCS.
Kebarth e al. [65] hanno suggerito che la Lys147 gioca un doppio ruolo nella specificità nucleofila di SS e IS, sia come attivatore di acqua che, attraverso forze steriche e/o elettroniche, come repressore di ammoniaca come nucleofilo [65]. Tuttavia la formazione di ADIC attraverso WT IS, WT SS e K213/Q147K ADCS e la formazione di antranilato attraverso Q147K AS, fornisce argomenti contrari a questa affermazione. Dal momento che le concentrazioni intracellulari di ammoniaca sono generalmente basse, IS e SS apparentemente non hanno sviluppato un mezzo per discriminare verso questo nucleofilo.
La presenza di una subunità di amido transferasi è il fattore più importante che determina quale enzima impiegherà l’ammoniaca come nucleofilo. La riduzione di circa 450 volte dell’attività analoga in Q147K AS quando la L-glutammina è la fonte di ammoniaca indica che l’identità del residuo 147 è importante nella misura in cui non deve bloccare l’accesso di ammoniaca al sito attivo di TrpE. Si è osservata una riduzione di circa 30 volte nell’attività analoga di K213/Q211K ADCS in condizioni di L-Gln. Questo suggerisce che l’interfaccia di PabA-PabB, e, di conseguenza, il tunnel di ammoniaca che si ritiene connettere i due siti attivi, è orientato in modo leggermente differente rispetto all’interfaccia TrpG-TrpE osservata nella struttura cristallina di AS [10]. La struttura cristallina di ADCS non è stata determinata in presenza di PabA [55]; perciò l’organizzazione precisa delle subunità PabA e PabB è sconosciuta.
Morollo e Bauerle hanno dimostrato che ADIC è un intermediario nella reazione AS [69]. Se la Lys147 fosse l’unico determinante della specificità di reazione (i.e. formazione di antranilato vs salicilato), allora una mutazione KQ farebbe diventare SS equivalente di AS, poiché ognuno possiede attività di piruvato liasi. Tuttavia, WT SS forma poco antranilato, nonostante le alte concentrazioni di ADIC nella miscela di reazione. D’altra parte, l’antranilato rappresenta il 97% di tutti i prodotti formati nelle reazioni Q263K AS-NH3. Questi risultati contrastanti suggeriscono che la specificità di reazione di SS è controllata da fattori al di là della selezione di acqua come nucleofilo. La capacità aumentata di K147Q SS di
aromatizzare ADIC e la capacità attenuata di aromatizzare l’isocorismato (rispetto a WT SS) supporta ulteriormente questa ipotesi. Ulteriori studi saranno volti a scoprire le forze che dettano specificità di eliminazione tra AS, SS, ADCS e IS.
