11. 3. Presenza di Rickettsia nei campioni di zecca raccolti nel 2006

(1)

11. 3. Presenza di Rickettsia nei campioni di zecca raccolti nel 2006

La presenza di Rickettsia ha dimostrato una distribuzione sul territorio paragonabile nei due

anni di studio, con lievi variazioni in alcune stazioni. Rickettsia è stata individuata in 67 pool

di tre ninfe (15.2%) e 36 adulti (7.5%) di cui 16 maschi e 20 femmine. La prevalenza di

infezione nell’intera area di studio è stata del 6.1%. Il valore più alto è stato riscontrato nella

Zona 3 (8.4%), seguito dalla Zona 4 (6.4%), Zona 2 (5.7%) and Zona 1 (4.8%) (Tabella 11.3 e

Figura 11.2).

(2)

Punte di prevalenza d’infezione sono state registrate nelle località di Clauzetto (ID 26), seguita da Majano (ID 22) e Preone (ID 36), a cavallo delle aree alpina e prealpina, nella parte centrale della regione FVG. Questo dato è in linea con i risultati ottenuti nell’ anno 2005 che hanno indicato Socchieve (ID 5) come la stazione a maggior prevalenza. Al contrario, nell’anno 2006 la stazione 5 è risultata negativa, mentre un dato di prevalenza simile a quello registrato nell’anno precedente e stato rilevato nella vicina stazione 36 facendo supporre una variazione spazio-temporali a livello locale. Lo stesso fenomeno è stato osservato per la stazione di Kranjska Gora (ID 1): priva di Rickettsia durante l’anno 2005, è risultata tra le località a maggior prevalenza di infezione pur essendo le vicine stazioni scarsamente infette.

Il microrganismo è apparentemente assente soltanto nelle località situate a quote più elevate (ID 3 e ID 25) (Figure 11.3).

Anche la percentuale di esemplari adulti coinfetti con Borrelia si è dimostrata costante con un valore del 2.1%, di cui l’80% erano zecche femmine.

Figura 11.3. Prevalenza annuale (%) di Rickettsia spp nel territorio regionale del FVG e area transfrontaliera slovena durante l’anno 2006.

(3)

Stazioni Zecche infette/zecche

raccolte, n Prevalenza d’infezione, %

Zona ID Località (m a. s. l.) Pool di 3 ninfe

Adulti singoli

Ninfe singole

Adulti singoli

Zecca singola (ninfe + adulti)*

Infezione media per zona, %

1 Kranjska gora (947) 1/3 2/22 12.6 9.1 10.1

2 Valbruna (836) 0/5 1/20 0.0 5.0 2.9

3 Val Pesarina (558) 0/8 0/7 0.0 0.0 0.0

5 Socchieve (450) 0/4 0/17 0.0 0.0 0.0

30

Fusine in Val Romana

(792) 0/1 3/29 0.0 10.3 9.4

31 Tarvisio (805) 1/6 0/12 5.9 0.0 3.5

33 Val Aupa (599) 0/9 0/5 0.0 0.0 0.0

34 Campiolo (370) 2/10 0/2 7.2 0.0 6.8

35 Pluzna (371) 0/6 1/13 0.0 7.7 3.2

1

36 Preone (540) 3/7 1/13 17.0 7.7 13.4

4.8

6 Kobarid (293) 0/7 1/15 0.0 6.7 2.8

7A Taipana (722) 0/8 0/8 0.0 0.0 0.0

8A Inglagna (368) 1/7 1/12 5.0 8.3 6.2

9 Faedis (242) 0/1 2/39 0.0 5.1 4.8

10 Costa (346) 3/11 0/12 3.1 0.0 2.3

20 Bosco Romagno (105) 0/2 3/25 0.0 12.0 9.7

21

Savorgnano del Torre

(168) 0/2 2/24 0.0 8.3 6.7

22 Majano (167) 0/4 4/18 0.0 22.2 13.3

23 Valeriano (180) 2/10 0/10 7.2 0.0 5.4

24 Barcis (475) 0/8 1/24 0.0 4.2 2.1

25 Cimolais (680) 0/10 0/11 0.0 0.0 0.0

26 Clauzetto (559) 4/10 0/4 26.3 0.0 23.2

27

Lago Di Cavazzo

(202) 3/12 0/5 9.1 0.0 8.0

28 Vedronza (334) 0/6 2/15 0.0 13.3 6.1

29 Osgnetto (177) 0/2 3/26 0.0 11.5 9.4

2

32 S.Giorgio (464) 1/9 0/5 3.9 0.0 3.3

5.7

3 12 Selva d’Arvonchi (3) 1/9 3/21 3.9 14.3 8.4 8.4

0 Padriciano (348) 1/9 0/6 3.9 0.0 3.2

11 Colle di Medea (101) 0/6 3/13 0.0 23.1 9.7

13 Marcottini (89) 3/22 0/3 4.8 0.0 4.6

14A Sveto (319) 18/72 1/11 9.1 9.1 9.1

15 Borgo Grotta Gigante

(212) 4/18 0/4 8.0 0.0 7.4

16 Ocizla (440) 6/23 0/4 9.6 0.0 9.1

17 Dobravlje (337) 2/21 0/9 3.3 0.0 2.9

18 Malchina (163) 3/40 0/5 2.6 0.0 2.5

4

19 Panovec (116) 2/14 2/10 5.0 20.0 7.9

6.4

Totale nell’area di studio 61/402 36/479 5.1 7.5 6.1 6.1

Tabella 11.3. Prevalenza di Rickettsia spp. nelle zecche I. ricinus raccolte nelle quattro zone fitoclimatiche della regione FVG e area transfrontaliera slovena durante l’anno 2006.

Nell’anno 2006 è stato osservato un incremento della presenza di Rickettsia in tutta l’area di

studio, più marcato nella fascia prealpina (Zona 2) (Figura 11.4).

(4)

0 2 4 6 8 10

% media annua per ambienti

AMBIENTE ALPINO

AMBIENTE PREALPINO

BOSCO PLANIZIALE

AMBIENTE CARSICO

2005 2006

Figura 11.4. Prevalenza media annua di Rickettsia: confronto per ambienti tra le raccolte 2005 e 2006.

Idendificazione della specie infettante

Il sequenziamento e l’analisi di omologia dei campioni positivi ha dimostrato che il 55.8% era identico al gene 16S rRNA di R. helvetica (accession no. L36212), mentre il 43.2%

presentava la stessa sequenza del gene 16S rRNA di R. monacensis (accession no.

DQ100164). Inoltre, in un campione di zecca proveniente dalla località di Valbruna (ID 2), è stata identificata una specie omologa al 99.8% a R. limoniae (accession no. AF322442). La Tabella 11.4 riporta nel dettaglio le specie identificate in ogni stazione di campionamento.

La distribuzione delle specie di Rickettsia è risultata anch’essa paragonabile nei 2 anni di studio con fluttuazioni non superiori al 3%, così come evidenziato dal confronto dei grafici a torta riportati in Figura 11.5.

58,5 41,1

R. monacensis

R. helvetica

41,1 58,5

55,8 43,2

1

R. limoniae R. monacensis

R. helvetica

43,2 55,8

1,0

2005 2006

Figura 11.5. Specie di Rickettsia identificate nell’area di studio: confronto tra le raccolte 2005 e 2006.

(5)

ID Localita’ Specie Rickettsia

1 Kranjska gora R. helvetica

2 Valbruna R. limoniae

3 Val Pesarina /

4 Saletto /

5 Socchieve /

30 Fusine in Val Romana R. helvetica

31 Tarvisio R. helvetica

33 Val Aupa /

34 Campiolo R. monacensis

35 Pluzna R. monacensis

AMBIENTE ALPINO

36 Preone R. monacensis

6 Kobarid R. helvetica

7A Taipana /

8A Inglagna R. monacensis + R. helvetica

9 Faedis R. helvetica

10 Costa R. monacensis + R. helvetica

20 Bosco Romagno R. helvetica

21 Savorgnano del Torre R. helvetica

22 Majano R. monacensis + R. helvetica

23 Valeriano R. monacensis + R. helvetica

24 Barcis R. helvetica

25 Cimolais /

26 Clauzetto R. monacensis

27 Lago Di Cavazzo R. monacensis + R. helvetica

28 Vedronza R. helvetica

29 Osgnetto R. helvetica

AMBIENTE PREALPINO

32 S.Giorgio R. helvetica

BOSCO

PLANIZIALE 12 Selva d’Arvonchi R. monacensis + R. helvetica

0 Padriciano R. monacensis

11 Colle di Medea R. monacensis

13 Marcottini R. helvetica

14A Sveto R. monacensis + R. helvetica

15 Borgo Grotta Gigante R. monacensis + R. helvetica

16 Ocizla R. monacensis + R. helvetica

17 Dobravlje R. helvetica

18 Malchina R. monacensis + R. helvetica

19 Panovec R. monacensis + R. helvetica

AMBIENTE CARSICO

01^* Basovizza R. monacensis + R. helvetica

* : stazione non indicata nella mappa di prevalenza d’infezione per Rickettsia.

Tabella 11.4. Specie di Rickettsia evidenziate nelle zecche raccolte durante l’anno 2006 in regione FVG e area transfrontaliera slovena mediante sequenziamento dei positivi e analisii di omologia.

(6)

94 12. ANAPLASMA NELLE ZECCHE I. RICINUS

12. 1. Identificazione di A. phagocytophilum

Per la ricerca di A. phagocytophilum nei campioni di zecca sono stati utilizzati i primer diretti verso il gene epank1 del patogeno (Walls et al., 2000). In Figura 12.1 si possono osservare gli amplificati da circa 450 bp di alcuni campioni di I. ricinus risultati positivi per A.

phagocytophilum.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

450 450 bpbp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

450 450 bpbp

Figura 12.1. Visualizzazione su gel di agarosio delle bande da 450 bp di alcuni campioni di I. ricinus risultati positivi all’amplificazione con primer specifici per il gene epank1 di A. phagocytophilum; corsia 1: PM 100 bp, corsia 2: A. phagocytophilum (controllo positivo), corsie 3-17: DNA estratto da alcuni campioni di zecca, corsia 18: controllo negativo.

12. 2. Presenza di A. phagocytophilum nei campioni di zecca raccolti nel 2005

La presenza di A. phagocytophilum nei campioni di zecche I. ricinus raccolti nel territorio regionale e transfrontaliero si è dimostrata alquanto bassa. La percentuale annua massima rilevata è stata del 5.2% nella località di Mersino (ID 7), mentre in 6 delle 15 stazioni campionate Anaplasma è risultato completamente assente (Figura 12.2 e Tabella 12.1). La media annuale nell’intera area di studio è risultata di 1.6%.

Coinfezioni con B. burgdorferi e con Rickettsia sono state riscontrate rispettivamente nel

3.4% e nel 0.8% dei campioni di zecche adulte, metà maschi e metà femmine.

(7)

95

Tabella 12.1. Prevalenza di A. phagocytophilum nelle zecche I. ricinus raccolte nelle quattro zone fitoclimatiche del territorio regionale del FVG e area transfrontaliera slovena durante l’anno 2005.

Figura 12.2. Prevalenza annuale (%) di A. phagocytophilum nel territorio regionale del FVG e area transfrontaliera slovena durante l’anno 2005.

Stazioni Zecche infette/zecche raccolte, n

Prevalenza d’infezione, %

Zo

na ID Località (m a. s. l.) Pools di 3 ninfe

Adulti singoli

Ninfe singole

Adulti singoli

1 Kranjska Gora (947) 0/28 1/10 0.0 10.0 1.1

2 Valbruna (836) 1/12 0/19 3.1 0.0 2.1

3 Val Pesarina (558) 0/11 1/13 0.0 7.7 2.3

4 Saletto (558) 0/9 0/2 0.0 0.0 0.0

1

5 Socchieve (450) 1/3 1/62 0.0 1.6 1.4

2.4

6 Kobarid (293) 0/28 0/35 0.0 0.0 0.0

7 Mersino (842) 2/15 1/15 4.7 6.7 5.2

8 Tridis (425) 0/6 2/27 0.0 7.4 4.9

9 Faedis (242) 0/1 0/81 0.0 0.0 0.0

2

10 Costa (346) 0/16 0/32 0.0 0.0 0.0

3.6

3 12 Selva D'arvonchi (3) 1/14 2/26 2.6 7.7 4.6 12.2

11 Colle di Medea (101) 0/12 0/5 0.0 0.0 0.0

13 Marcottini (89) 1/35 0/9 0.9 0.0 0.8

14 Komen (264) 0/20 0/3 0.0 0.0 0.0

4

(212) 5/85 0/16 2.0 0.0 1.9

1.0

(8)

96 12. 3. Presenza di A. phagocytophilum nei campioni di zecca raccolti nel 2006

La diffusione territoriale di A. phagocytophilum durante l’anno 2006 ha dimostrato un andamento disomogeneo caratterizzato da una presenza a spot, come nelle stazioni di Socchieve (ID 5) e Savorgnano del Torre (ID 21), oppure ad area, come nell’area carsica (Zona 4), dove il microrganismo è stato rilevato in siti poco distanti tra loro (Figura 12.3 e Tabella 12.2).

La prevalenza di infezione nella località di Selva d’Arvonchi (ID 12), unico rappresentante del bosco planiziale (Zona 3), ha riportato un valore inferiore rispetto l’anno precedente, ma comunque maggiore rispetto alle altre zone fitoclimatiche (Tabella 12.2), dato che si può apprezzare meglio nel confronto tra le prevalenze annuali illustrato in Figura 12.4.

Figura 12.3. Prevalenza annuale (%) di A. phagocytophilum nel territorio regionale del FVG e area transfrontaliera slovena durante l’anno 2006.

(9)

97

Stazioni

Zecche infette/zecche

raccolte, n

Prevalenza d’infezione, %

Zona ID Località (m a. s. l.)

Pool di 3 ninfe

Adulti singoli

Ninfe singole

Adulti singoli

1 Kranjska gora (947) 0/3 0/22 0.0 0.0 0.0

2 Valbruna (836) 0/5 0/20 0.0 0.0 0.0

3 Val Pesarina (558) 0/8 0/7 0.0 0.0 0.0

5 Socchieve (450) 1/4 0/17 9.1 0.0 3.9

30 Fusine in Val Romana

(792) 0/1 0/29 0.0 0.0 0.0

31 Tarvisio (805) 0/6 0/12 0.0 0.0 0.0

33 Val Aupa (599) 0/9 0/5 0.0 0.0 0.0

34 Campiolo (370) 0/10 0/2 0.0 0.0 0.0

35 Pluzna (371) 0/6 0/13 0.0 0.0 0.0

1

36 Preone (540) 0/7 0/13 0.0 0.0 0.0

0.4

6 Kobarid (293) 0/7 0/15 0.0 0.0 0.0

7A Taipana (722) 0/8 0/8 0.0 0.0 0.0

8A Inglagna (368) 0/7 0/12 0.0 0.0 0.0

9 Faedis (242) 0/1 0/39 0.0 0.0 0.0

10 Costa (346) 0/11 0/12 0.0 0.0 0.0

20 Bosco Romagno (105) 0/2 0/25 0.0 0.0 0.0

21 Savorgnano del Torre

(168) 0/2 0/24 0.0 0.0 0.0

22 Majano (167) 0/4 0/18 0.0 0.0 0.0

23 Valeriano (180) 0/10 0/10 0.0 0.0 0.0

24 Barcis (475) 0/8 0/24 0.0 0.0 0.0

25 Cimolais (680) 0/10 0/11 0.0 0.0 0.0

26 Clauzetto (559) 0/10 0/4 0.0 0.0 0.0

27 Lago Di Cavazzo (202) 0/12 0/5 0.0 0.0 0.0

28 Vedronza (334) 0/6 0/15 0.0 0.0 0.0

29 Osgnetto (177) 0/2 0/26 0.0 0.0 0.0

2

32 S.Giorgio (464) 0/9 0/5 0.0 0.0 0.0

0.0

3 12 Selva d’Arvonchi (3) 0/9 2/21 0.0 9.5 4.2 4.2

0 Padriciano (348) 0/9 0/6 0.0 0.0 0.0

11 Colle di Medea (101) 0/6 0/13 0.0 0.0 0.0

13 Marcottini (89) 1/22 0/3 1.5 0.0 1.4

14A Sveto (319) 1/72 0/11 0.5 0.0 0.5

(212) 2/18 1/4 3.9 25.0 5.4

16 Ocizla (440) 0/23 0/4 0.0 0.0 0.0

17 Dobravlje (337) 0/21 0/9 0.0 0.0 0.0

18 Malchina (163) 1/40 0/5 0.8 0.0 0.8

4

19 Panovec (116) 0/14 0/10 0.0 0.0 0.0

1.0

Tabella 12.2.Prevalenza di A. phagocytophilum nelle zecche I. ricinus raccolte nelle quattro zone fitoclimatiche del territorio regionale del FVG e area transfrontaliera slovena durante l’anno 2006.

(10)

98 In generale, nell’anno 2006 le aree alpina (Zona 1) e prealpina (Zona 2) hanno visto una diminuzione della prevalenza d’infezione, mentre nell’area del Carso (Zona 4) la prevalenza d’infezione è risultata immutata (Figura 12.4),.

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0

% media annua per ambienti

AMBIENTE ALPINO AMBIENTE PREALPINO BOSCO PLANIZIALE AMBIENTE CARSICO 2005 2006

Figura 12.4. Prevalenza media annua di A. phagocytophilum: confronto per ambienti tra le raccolte 2005 e 2006.

Anche la presenza di esemplari coinfetti è risultata inferiore rispetto l’anno precedente, infatti è stato riscontrato un valore di 0.2% di zecche adulte contemporaneamente positive anche per B. burgdorferi.

Identificazione della specie infettante

Infine, tutti i campioni positivi all’amplificazione, sia quelli della raccolta 2005 che 2006,

sono stati sequenziali e identificati come A. phagocytophilum in base alla completa omologia

con le sequenze dei ceppi europei depositate in banca dati GenBank (accession n° AY529488,

AF482759).

(11)

99 13. VIRUS TBE NELLE ZECCHE I. RICINUS

13. 1. Identificazione del virus TBE

La ricerca di sequenze specifiche del genoma del virus TBE è stata condotta amplificando la regione non codificante all’estremità 5’ (5’-NCR) del genoma virale. In Figura 13.1 si possono osservare le bande da 128 bp di alcuni campioni di zecca risultati positivi.

Figura 13.1. Visualizzazione su gel di agarosio delle bande da 128 bp di alcuni campioni di I. ricinus risultati positivi all’amplificazione con primer specifici per la regione 5’-NCR del virus TBE: corsia M: PM 100 bp, corsie 1-2: ceppo IR 454 (controllo positivo), corsie 3-14: DNA estratto da alcuni campioni di zecca, corsia 15:

controllo negativo.

13. 2. Presenza di virus TBE nelle zecche raccolte nel 2005

Sequenze specifiche del virus TBE sono state rilevate in tutte le stazioni campionate, eccetto nella stazione di Komen (ID 14). Sono stati riscontrati valori di prevalenza compresi in un range molto ampio che va dal 11.5% di Borgo Grotta Gigante (ID 15) fino al 63,6% di Faedis (ID 9) e 75% di Kobarid (ID 6) (Tabella 13.1).

I dati di prevalenza così ottenuti sono stati integrati con l’abbondanza di zecche al fine di

calcolare l’indice di rischio (IR) per ogni stazione. Dall’elaborazione presentata in Figura

13.2 appare evidente che la distribuzione del rischio per l’infezione da virus TBE è maggiore

nell’area alpina-prealpina, a cavallo del confine italo-sloveno.

(12)

100

Tabella 13.1: Prevalenza del virus TBE nelle zecche I. ricinus raccolte nelle quattro zone fitoclimatiche del territorio regionale del FVG e area transfrontaliera slovena durante l’anno 2005.

Figura 13.2. Distribuzione del rischio (IR) per il virus TBE nel territorio regionale del FVG e area transfrontaliera slovena.

Stazioni Prevalenza d’infezione per zecca singola (ninfe + adulti)* , %

Zona ID Località (m a. s. l.) annuale Infezione media per zona, %

1 Kranjska Gora (947) 22.1

2 Valbruna (836) 54.6

3 Val Pesarina (558) 34.8

4 Saletto (558) 52.5

1

5 Socchieve (450) 44.0

41.6

6 Kobarid (293) 75.0

7 Mersino (842) 35.3

8 Tridis (425) 50.0

2

9 Faedis (242) 63.6

37.2

10 Costa d’Alviano 12.6

3 12 Selva d’Arvonchi (3) 32.0 32.0

11 Monte di Medea 50.0

13 Marcottini (89) 38.5

14 Komen 0.0

4

15 Borgo Grotta Gigante (212) 11,5

24.7

(13)

101 Un tasso d’infezione maggiore è stato osservato nelle zecche adulte rispetto alle ninfe, ad un livello di significatività di p = 0.031 (Figura 13.3).

37,7

16 ,2 27,1

23,0

11,1 58 ,3

6 4 74,7

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

ALPIN E LAN D SC APE PR EALPIN E LAN SC APE PLAIN FO R EST K AR ST LAN D SC APE

% IN F. N YM PHS

% IN F. AD U LTS

Zona 1 Zona 2 Zona 3 Zona 4

NINFE INF.

ADULTI INF.

Figura 13.3. Prevalenza del virus TBE in ninfe ed adulti nelle quattro zone fitoclimatiche.

Come si può osservare nell’istogramma di Figura 13.4, l’elaborazione effettuata in relazione alle zone fitoclimatiche ha messo in evidenza un incremento della prevalenza del virus dalla costa (Zona 4) verso l’arco alpino (Zona 1).

4 1,6

3 7 ,2

2 4 ,7 3 2 ,0

0 10 20 3 0 40 5 0

ALPIN E LAN D SC APEZona 1 PR EALPIN E LAN SC APEZona 2 PLAIN FO R ESTZona 3 K AR ST LAN D SC APEZona 4

Figura 13.4. Prevalenza di infezione media annua per il virus TBE nelle quattro zone fitoclimatiche

(14)

102 Nelle zecche adulte analizzate singolarmente sono state rilevate coinfezioni con B.

burgdorferi nel 7.7%, con Rickettsia nel 1.5% e con A. phagocytophilum nel 0.8%. Inoltre, sono state evidenziate coinfezioni con 3 patogeni: nel 0.8% dei campioni positivi al virus TBE erano presenti anche B. burgdorferi e Rickettsia, mentre nel 0.4% erano copresenti B.

burgdorferi e A. phagocytophilum. Da notare che l’83% di tutte le confezioni sono state riscontrate in zecche femmine adulte.

Un’attenta comparazione tra gli IR del virus TBE e B. burgdorferi nell’area di studio ha evidenziato una distribuzione contrapposta dei due patogeni: il virus mostra di predominare ad altitudini maggiori, mentre B. burgdorferi prevale nella zona carsica (Tabella 13.2).

Zona ID località IR B.burgdorferi IR virus TBE

1 Kranjska gora 8.5 15.9

2 Valbruna 1.0 14.6

3 Val Pesarina 0.0 6.0

4 Saletto 0.0 9.5

1

5 Socchieve 6.0 12.0

6 Kobarid 7.8 42.0

7 Mersino 0.3 14.1

8 Tramonti di Sotto 2.7 8.0

9 Faedis 5.4 24.6

2

10 Costa 15.5 1.0

3 12 Bosco Baredi 10.7 7.2

11 Monte di Medea 2.7 1.0

13 Marcottini 20.7 5.8

N. Komen 4.3 0.0

4

15 Borgo Grotta Gigante 18.2 9.1

Tabella 13.2: Confronto tra gli indici di rischio per Borrelia e virus TBE nell’area di studio.

(15)

103 13 .3 Identificazione del sottotipo del virus TBE

Tutti i campioni risultati positivi sono stati sequenziati e allineati con le sequenze disponibili in banca dati GenBank al fine di identificare il sottotipo di appartenenza. Nell’analisi è stato incluso anche il controllo positivo IR 454 isolato nel bellunese.

Le sequenze del virus TBE presenti nelle zecche infette si sono dimostrate identiche al ceppo IR 454 e differenti dal ceppo Neudoerfl (accession n° U27495), appartenente al sottotipo Western European TBE, in 2 posizioni (nucleotidi 5 e 110 dell’amplificato) corrispondente ad una omologia del 98,4%. La Figura 13.5 mostra alcune sequenze rappresentative dell’allineamento.

Figura 13.5. Allineamento delle sequenze 5’-NCR di 5 campioni di zecca positivi e del ceppo bellunese IR 454 con la sequenza depositata in banca dati GenBank del ceppo Neudoerfl appartenente al sottotipo Western European TBE virus (U27495).

(16)

14. BABESIA NELLE ZECCHE I. RICINUS

14. 1. Area di studio e campionamento di I. ricinus

Le zecche della specie I. ricinus sono state raccolte nelle località di Padriciano e Basovizza, sul Carso triestino (Figura 14.1). A Padriciano è stato campionato lo stesso sito (indicato con il numero 0) in entrambi gli anni di raccolta, mentre nella località di Basovizza i siti campionati sono stati diversi tra i 2 anni. Con il sito di Padriciano si è voluto verificare la dinamica della presenza di Babesia nel tempo mantenendo lo stesso punto di raccolta. Invece, il sito 01 di Basovizza, molto vicino al Sincrotrone, quindi in un’area modificata dall’attività umana vista la sua importanza per le attività sportive, è stato campionato solo nel 2006; per il campionamento 2007 si è pensato di individuare altri 3 siti (indicati con 1R, 1V e 1G) sempre nella località di Basovizza, in una zona considerata più “selvaggia”, caratterizzata da prati non sfalciati. Lo scopo era quello di campionare un maggior numero di siti in un’area ristretta per poter valutare la differenza di infettività delle zecche in siti contigui e di fare un confronto tra aree a diverso impatto ambientale.

Figura 14.1. Foto aerea dell’area di studio localizzata sul Carso triestino. I siti di raccolta delle zecche sono indicati con le sigle di colore giallo 0, 01, 1R, 1V e 1G. Sono visibili i centri abitati di Padriciano e Basovizza e il Sincrotrone.

(17)

La popolazione di zecche I. ricinus raccolta nelle località di Padriciano e Basovizza nel biennio 2006-2007era composta da 1623 ninfe (85,8%) e da 238 adulti (12,6%), di cui 151 maschi e 87 femmine. L’abbondanza cumulata delle zecche nelle due località campionate ha evidenziato una costante presenza dello stadio ninfale (85-87%), mentre il numero degli adulti è raddoppiato nel secondo anno di raccolta.

14. 2. Identificazione di Babesia spp.

Dall’esperienza maturata in laboratorio abbiamo verificato che amplificare il DNA proveniente da estratti di zecca può dare problemi di inibizione, probabilmente dovuti a sostanze che il protocollo di estrazione non riesce ad eliminare. Prove di amplificazione eseguite sui controlli positivi e su controllo positivo+estratto di zecca (spike-DNA) hanno consentito di valutare la sensibilità di alcuni protocolli descritti in letteratura. I metodi di amplificazione del gene 18S rRNA proposti da Persing et al. (1992) e Herwaldt et al. (2004) hanno dato prodotti di amplificazione scarsamente visibili e sono stati scartati. Il sistema migliore è risultato quello creato da Cacciò et al. (2000), ossia, un sistema nested-PCR specifico per il gene della β-tubulina; abbastanza sensibile si è rivelata anche l’amplificazione singola del gene 18S rRNA con la coppia di primer disegnata dal Dott. Pleniazek.

Amplificazione del gene per la ββββ -tubulina

Il DNA estratto dai campioni di zecca sono stati amplificati con primer specifici per il gene che codifica la β-tubulina di Babesia.

Figura 14.2 Visualizzazione su gel di agarosio delle bande da circa 310-320 bp di alcuni campioni di I. ricinus amplificati con primer specifici per il gene per la β-tubulina di Babesia: corsia 1: peso molecolare da 100 bp, corsia 2: SLO1-B. divergens (controllo positivo), corsia 3: controllo negativo, corsie 4: SLO3-Babesia EU1 (controllo positivo), corsie 5-9: campioni di zecca.

(18)

Il metodo descritto da Cacciò et al. (2000) non includeva la specie Babesia EU1.

L’amplificazione del controllo positivo SLO3 (Babesia EU1) ha evidenziato un prodotto di amplificazione di circa 310-320 bp, leggermente più basso rispetto a quello ottenuto per SLO1 (B. divergens). La Figura 14.2 mostra gli amplificati da circa 310-320 bp dei controlli positivi SLO 1 (B. divergens), SLO3 (Babesia EU1) e di alcuni campioni di I. ricinus risultati positivi dopo nested-PCR e visualizzati su gel di agarosio.

Amplificazione del gene 18S rRNA

I campioni risultati positivi all’amplificazione del gene per la β-tubulina di Babesia sono stati nuovamente amplificati con primer specifici per il gene 18S rRNA di Babesia disegnati dal Dott. Pleniazek. La figura 14.3 mostra gli amplificati da circa 650 bp dei controlli positivi e di alcuni campioni di zecca. Questo sistema è risultato meno sensibile rispetto la nested-PCR, per cui è stato possibile riamplificare soltanto una parte dei campioni positivi.

Figura 14.3. Visualizzazione su gel di agarosio delle bande da circa 650 bp di alcuni campioni di I. ricinus amplificati con primer specifici per il gene 18S rRNA di Babesia: corsia 1, 6: controlli negativi; corsia 2:

controllo positivo (SLO1-B. divergens), corsie 3: controllo positivo (SLO3-Babesia EU1); corsie 4: controllo positivo (SLO2-B. microti); corsie 5: controllo positivo (BABDNA1-B. microti); corsia 7-13: campioni di zecca;

corsie 14: peso molecolare da 100 bp.

14. 3. Presenza di Babesia nei campioni di zecca raccolti negli anni 2006-2007

In totale sono risultati positivi 19 campioni, di cui 4 raccolti nel sito 0 di Padriciano nel 2006

e 15 distribuiti tra le zecche provenienti dalle quattro stazioni del 2007 (Tabella 14.1). In tutti

i siti è stato trovato almeno un campione positivo, eccetto nella stazione 01 di Basovizza.

(19)

anno 2006 anno 2007

ID località

pool di ninfe adulti pool di ninfe adulti

0 Padriciano 4/112 0/22 4/359 7/195

01 Basovizza 0/32 0/10 / /

1G Basovizza / / 0/8 1/5

1R Basovizza / / 2/22 0/4

1V Basovizza / / 0/7 1/2

Tabella 14.1. Numero di campioni positivi per Babesia raccolti nelle località di Padriciano e Basovizza nel biennio 2006-2007, tenendo conto dello stadio di sviluppo.

La prevalenza di infezione annuale ha evidenziato un valore paragonabile tra i 2 anni di campionamento: 0.8% nel 2006 e 1.1% nel 2007. Per la stazione di Padriciano, l’andamento annuale si è dimostrato stabile, oscillando tra l’ 1.1% e 0.9% nei 2 anni. Al contrario, nel campionamento della località di Basovizza nell’anno 2006 (sito 01) non è stata riscontrata la presenza del patogeno, che invece è stata dimostrata nelle 3 raccolte a spot effettuate nel 2007 (siti 1R, 1V, 1G), ma in un’area a minor impatto ambientale. Le prevalenze nei 3 siti di Basovizza 2007 sono state decisamente più alte rispetto a Padriciano, con valori tra il 2.5% e 4.3% (Tabella 14.2).

Osservando i dati di prevalenza di Babesia nelle zecche in relazione allo stadio di sviluppo si può notare che è maggiore il numero di adulti infetti rispetto a quello delle ninfe.

ID Località prevalenza anno 2006, % prevalenza anno 2007, %

ninfe singole

adulti singoli

singola zecca (ninfe + adulti)

ninfe singole

adulti singoli

singola zecca (ninfe+adulti)

0 Padriciano 1.2 0.0 1.1 0.4 3.6 0.9

01 Basovizza 0.0 0.0 0.0 / / /

1G Basovizza / / / 0 20.0 3.4

1R Basovizza / / / 2.7 0.0 2.5

1V Basovizza / / / 0 50.0 4.3

TOTALE 0.8 1.1

Tabella 14.2. Valori di prevalenza per Babesia nei campioni di zecca raccolti nelle località di Padriciano e Basovizza nel biennio 2006-2007, riportati in base allo stadio di sviluppo e come valore cumulato.

(20)

14.4. Identificazione della specie di Babesia

Sequenze del gene per la ββββ -tubulina

I campioni risultati positivi all’amplificazione del gene per la β -tubulina di Babesia sono stati sequenziati. L’analisi di omologia ha permesso di evidenziare 2 gruppi genetici distinti: un gruppo di 2 sequenze simili tra loro e vicine alla specie B. divergens compongono il gruppo definito “gruppo B. divergens-like” (Figura 14.4 e 14.6), mentre 12 sequenze identiche tra loro hanno dimostrato un’alta omologia con la specie Babesia EU1 ed è stato definito

“gruppo Babesia EU1-like” (Figura 14.5 e 14.6). Purtroppo per 5 campioni non è stato possibile ottenere una sequenza chiara che permettesse l’identificazione della specie; è stato possibile, però, confermare che le sequenze amplificate allineavano esclusivamente col genere Babesia.

Gruppo B. divergens-like:

42-0FR5a ---GACATGATTCGTA-GCGTGCACCATAACACATAAGCTACATGACTGC 36-01FRa CTGCCATATGATAGACTGTATGGGCGTGTGTTCACCAAAACACATAAGCTACATGACTGC

42-0FR5a GTGGTTTGTGGCAAATGCCATGTCTTGCTTCACAATGTACTTCACCAAAGACTTTTATAT 36-01FRa GTGGTTTGTGGCAAATGCCATGTCTTGCTTCACAATGTACTTCACCAAAGACTTTTATAT

42-0FR5a TCAATGCGCTAACAACGACACAGAGCGGAACATACCACGGAGACAGTGACTTGCAACTGG 36-01FRa TCAATGCGCTAACAACGACACAGAGCGGAACATACCACGGAGACAGTGACTTGCAACTGG

42-0FR5a AGCGTGTTGATGTATTCTACAATGAAGCCGCTGGTGGGCGCTACGTCCCCCGTGCCATCT 36-01FRa AGCGTGTTGATGTATTCTACAATGAAGCCGCTGGTGGGCGCTACGTCCCCCGTGCCATCT

42-0FR5a TGATGGACCTGGAACCTGGAACCATG--- 36-01FRa TGATGGACCTGGAACCCGGAACCATGGGACTCAGTA

Figura 14.4. Allineamento multiplo delle sequenze corrispondenti al gene per la β-tubulina di Babesia dei campioni inclusi nel gruppo B. divergens-like. Le sigle corrispondono ai campioni di zecca risultati positivi per Babesia divergens

AGCT: introne AGCT: esone

(21)

Gruppo Babesia EU1-like:

6-0FR5a AATATAGAGAGTGTGTAGATAGTGTGCATGATTATACACAAGTGTGTTTCGTGACCAGTA 71-0FR4a AATATAGAGAGTGTGTAGATAGTGTGCATGATTATACACAAGTGTGTTTCGTGACCAGTA 40-01FRa AATATAGAGAGTGTGTAGAT-GTGTGCATGATTATACACAAGTGTGTTTCGTGACCAGTA 44-01FRa AATATAGAGAGTGTGTAGAT-GTGTGCATGATTATACACAAGTGTGTTTCGTGACCAGTA 3-01FRa AATATAGAGAGTGTGTAGAT-GTGTGCATGATTATACACAAGTGTGTTTCGTGACCAGTA 37-0FR5a ---TAGTGTGCATGATTATACACAAGTGTGTTTCGTGACCAGTA 340-0FR5a -ATATAGAGAGTGTGTAGAT-GTGTGCATGATTATACACAAGTGTGTTTCGTGACCAGTA 81-0FR4a ----TAGAGAGTGTGTAGATAGTGTGCATGATTATACACAAGTGTGTTTCGTGACCAGTA 384-0FR5a -ATATAGAGAGTGTGTAGAT-GTGTGCATGATTATACACAAGTGTGTTTCGTGACCAGTA 97-0FR4a ---AGAGTGTGTAGATAGTGTGCATGATTATACACAAGTGTGTTTCGTGACCAGTA 82-0FR4a ---AGAGAGTGTGTAGATAGTGTGCATGATTATACACAAGTGTGTTTCGTGACCAGTA 29-0FRa ---ATAGAGAGTGTGTAGAT-GTGTGCATGATTATACACAAGTGTGTTTCGTGACCAGTA

6-0FR5a ATATGTATTCCTGCGCAATCTAAGTTGCTGGCAACACCTTGCGCAATGCATTCACAACGC 71-0FR4a ATATGTATTCCTGCGCAATCTAAGTTGCTGGCAACACCTTGCGCAATGCATTCACAACGC 40-01FRa ATATGTATTCCTGCGCAATCTAAGTTGCTGGCAACACCTTGCGCAATGCATTCACAACGC 44-01FRa ATATGTATTCCTGCGCAATCTAAGTTGCTGGCAACACCTTGCGCAATGCATTCACAACGC 3-01FRa ATATGTATTCCTGCGCAATCTAAGTTGCTGGCAACACCTTGCGCAATGCATTCACAACGC 37-0FR5a ATATGTATTCCTGCGCAATCTAAGTTGCTGGCAACACCTTGCGCAATGCATTCACAACGC 340-0FR5a ATATGTATTCCTGCGCAATCTAAGTTGCTGGCAACACCTTGCGCAATGCATTCACAACGC 81-0FR4a ATATGTATTCCTGCGCAATCTAAGTTGCTGGCAACACCTTGCGCAATGCATTCACAACGC 384-0FR5a ATATGTATTCCTGCGCAATCTAAGTTGCTGGCAACACCTTGCGCAATGCATTCACAACGC 97-0FR4a ATATGTATTCCTGCGCAATCTAAGTTGCTGGCAACACCTTGCGCAATGCATTCACAACGC 82-0FR4a ATATGTATTCCTGCGCAATCTAAGTTGCTGGCAACACCTTGCGCAATGCATTCACAACGC 29-0FRa ATATGTATTCCTGCGCAATCTAAGTTGCTGGCAACACCTTGCGCAATGCATTCACAACGC

6-0FR5a TGCAGAGCGGAACCTACCACGGAGACAGTGACCTGCAACTGGAGCGCGTTGATGTGTTCT 71-0FR4a TGCAGAGCGGAACCTACCACGGAGACAGTGACCTGCAACTGGAGCGCGTTGATGTGTTCT 40-01FRa TGCAGAGCGGAACCTACCACGGAGACAGTGACCTGCAACTGGAGCGCGTTGATGTGTTCT 44-01FRa TGCAGAGCGGAACCTACCACGGAGACAGTGACCTGCAACTGGAGCGCGTTGATGTGTTCT 3-01FRa TGCAGAGCGGAACCTACCACGGAGACAGTGACCTGCAACTGGAGCGCGTTGATGTGTTCT 37-0FR5a TGCAGAGCGGAACCTACCACGGAGACAGTGACCTGCAACTGGAGCGCGTTGATGTGTTCT 340-0FR5a TGCAGAGCGGAACCTACCACGGAGACAGTGACCTGCAACTGGAGCGCGTTGATGTGTTCT 81-0FR4a TGCAGAGCGGAACCTACCACGGAGACAGTGACCTGCAACTGGAGCGCGTTGATGTGTTCT 384-0FR5a TGCAGAGCGGAACCTACCACGGAGACAGTGACCTGCAACTGGAGCGCGTTGATGTGTTCT 97-0FR4a TGCAGAGCGGAACCTACCACGGAGACAGTGACCTGCAACTGGAGCGCGTTGATGTGTTCT 82-0FR4a TGCAGAGCGGAACCTACCACGGAGACAGTGACCTGCAACTGGAGCGCGTTGATGTGTTCT 29-0FRa TGCAGAGCGGAACCTACCACGGAGACAGTGACCTGCAACTGGAGCGCGTTGATGTGTTCT

6-0FR5a ACAATGAAGCCGCTGGTGGACGCTACGTGCCCCGTGCCATCCTCATGGACCTGGAACCCG 71-0FR4a ACAATGAAGCCGCTGGTGGACGCTACGTGCCCCGTGCCATCCTCATGGACCTGGAACCCG 40-01FRa ACAATGAAGCCGCTGGTGGACGCTACGTGCCCCGTGCCATCCTCATGGACCTGGAACCCG 44-01FRa ACAATGAAGCCGCTGGTGGACGCTACGTGCCCCGTGCCATCCTCATGGACCTGGAACCCG 3-01FRa ACAATGAAGCCGCTGGTGGACGCTACGTGCCCCGTGCCATCCTCATGGACCTGGAACCCG 37-0FR5a ACAATGAAGCCGCTGGTGGACGCTACGTGCCCCGTGCCATCCTCATGGACCTGGAACCCG 340-0FR5a ACAATGAAGCCGCTGGTGGACGCTACGTGCCCCGTGCCATCCTCATGGACCTGGAACCCG 81-0FR4a ACAATGAAGCCGCTGGTGGACGCTACGTGCCCCGTGCCATCCTCATGGACCTGGAACCCG 384-0FR5a ACAATGAAGCCGCTGGTGGACGCTACGTGCCCCGTGCCATCCTCATGGACCTGGAACCCG 97-0FR4a ACAATGAAGCCGCTGGTGGACGCTACGTGCCCCGTGCCATCCTCATGGACCTGGAACCCG 82-0FR4a ACAATGAAGCCGCTGGTGGACGCTACGTGCCCCGTGCCATCCTCATGGACCTGGAACCCG 29-0FRa ACAATGAAGCCGCTGGTGGACGCTACGTGCCCCGTGCCATCCTCATGGACC---

6-0FR5a GAACCAT--- 71-0FR4a GAACCATGACTCAGTA 40-01FRa GAACCATGACTCAGTA 44-01FRa GAACCATGACTCAGTA 3-01FRa GAACCATGACTCAGTA 37-0FR5a GAACCATGACTCAGTA 340-0FR5a GAACCATGACTCAGTA 81-0FR4a GAACCATGACTCAGTA 384-0FR5a GAACCATGACTCAGTA 97-0FR4a GAACCATGA--- 82-0FR4a GAACCATGA--- 29-0FRa ---

Figura 14.5. Allineamento multiplo delle sequenze corrispondenti al gene per la β-tubulina di Babesia dei campioni inclusi nel gruppo Babesia EU1-like. Le sigle corrispondono ai campioni di zecca risultati positivi per Babesia EU-1

AGCT: introne AGCT: esone

(22)

Le sequenze sono state sottoposte ad analisi filogenetica con il programma Multialin (http://bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/multalin/multalin.html). Come dimostra la figura 14.6, la sequenza 36-01, che rappresenta il gruppo B. divergens-like fa cluster (gruppo) con la specie B. divergens, mentre la sequenza 3-01 che rappresenta il gruppo Babesia EU1-like fa cluster con la specie Babesia EU1 corrispondente al controllo positivo SLO3.

Theileria annulataAJ289245 Theileria annulataEF060268

B. microtiAB124587 B. microtiAB219803

B. microtiAB083377 B. microtiAJ289250

B. bovis B. bovisAJ289247

B. bovisXM001611566

B. odocoilei B. odocoileiAY144705

B. odocoileiAY144706 B. divergensAY144704

B. divergens SLO1 strain

B. divergensAJ289248 B. divergensAY144703

BABBO strain 36-01 sample

B. sp.EU1 3-01 sample

SLO3 strain

Theileriasergenti AJ289244

Homo sapiens NG002334 10 PAM

B. microti

3-01 sample= Campione positivo rappresentante il gruppo B. EU1-like 36-01 sample= Campione positivo rappresentante il gruppo B. divergens-like SLO3 strain= B. EU1 (Controllo positivo)

BABBO strain= B. divergens (Controllo positivo) SLO1 strain= B. divergens (Controllo positivo) SIGLA GI= Sequenze in banca dati GenBank

Figura 14.6. Risultato dell’analisi filogenetica eseguita sulle sequenze del gene della β-tubulina di Babesia con il programma Multialin che utilizza le distanze PAM (Percent Accepted Mutation). Il campione 36-01 rappresenta il gruppo B. divergens-like, mentre il campione 3-01 rappresenta il gruppo Babesia EU1-like.

(23)

Amplificazione del gene 18S rRNA

Sono stati sequenziati anche gli amplificati del gene 18S rRNA di Babesia di alcuni dei campioni positivi per la β-tubulina. L’analisi di omologia ha permesso di confermare che il raggruppamento in “gruppo Babesia EU1-like” e “gruppo B. divergens-like” era corretto, così come dimostrano le elaborazioni riportate in Figura 14.7, 14.8 e 14.9.

Gruppo Babesia EU1-like:

44-01BABES5a GAGATAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAACTTGTTGCAGTTAAAA-AGCTCGTAGT 151-0BABES5a ---CTTGTTGCAGTTAAAA-AGCTCGTAGT 3-01BABES5a ---GCAGTTAAAA-AGCTCGTAGT 40-01BABES5a ---CTTGTTGCAGTTAAAA-AGCTCGTAGT 340-0BABES5a ---GCTCGAAGT 384-0BABES5a ---CTTGTTGCAGTTAAAATAGCTCGTAGT

44-01BABES5a TGAATTTCTGCGTTATCGAGTTATTGACTCTTGTCTTTAATCGATTTCGCTTTTGGGATT 151-0BABES5a TGAATTTCTGCGTTATCGAGTTATTGACTCTTGTCTTTAATCGATTTCGCTTTTGGGATT 3-01BABES5a TGAATTTCTGCGTTATCGAGTTATTGACTCTTGTCTTTAATCGATTTCGCTTTTGGGATT 40-01BABES5a TGAATTTCTGCGTTATCGAGTTATTGACTCTTGTCTTTAATCGATTTCGCTTTTGGGATT 340-0BABES5a TGAATTTCTGCGTTATCGAGTTATTGACTCTTGTCTTTAATCGATTTCGCTTTTGGGATT 384-0BABES5a TGAATTTCTGCGTTATCGAGTTATTGACTCTTGTCTTTAATCGATTTCGCTTTTGGGATT

44-01BABES5a TATCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTT 151-0BABES5a TATCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTT 3-01BABES5a TATCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTT 40-01BABES5a TATCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTT 340-0BABES5a TATCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTT 384-0BABES5a TATCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTT

44-01BABES5a CAGCATGGAATAATAGAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTTTGAACCTTAGTAA 151-0BABES5a CAGCATGGAATAATAGAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTTTGAACCTTAGTAA 3-01BABES5a CAGCATGGAATAATAGAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTTTGAACCTTAGTAA 40-01BABES5a CAGCATGGAATAATAGAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTTTGAACCTTAGTAA 340-0BABES5a CAGCATGGAATAATAGAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTTTGAACCTTAGTAA 384-0BABES5a CAGCATGGAATAATAGAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTTTGAACCTTAGTAA

44-01BABES5a TGGTTAATAGGAACGGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGAT 151-0BABES5a TGGTTAATAGGAACGGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGAT 3-01BABES5a TGGTTAATAGGAACGGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGAT 40-01BABES5a TGGTTAATAGGAACGGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGAT 340-0BABES5a TGGTTAATAGGAACGGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGAT 384-0BABES5a TGGTTAATAGGAACGGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGAT

44-01BABES5a TTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCTTTTGCCAAGGACGTTTCCATTAATCAAGAACG 151-0BABES5a TTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCTTTTGCCAAGGACGTTTCCATTAATCAAGAACG 3-01BABES5a TTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCTTTTGCCAAGGACGTTTCCATTAATCAAGAACG 40-01BABES5a TTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCTTTTGCCAAGGACGTTTCCATTAATCAAGAACG 340-0BABES5a TTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCTTTTGCCAAGGACGTTTCCATTAATCAAGAACG 384-0BABES5a TTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCTTTTGCCAAGGACGTTTCCATTAATCAAGAACG

44-01BABES5a AAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGA 151-0BABES5a AAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGA 3-01BABES5a AAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGA 40-01BABES5a AAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGA 340-0BABES5a AAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGA 384-0BABES5a AAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGA

44-01BABES5a CTAGGGATTGGAGGTCGTCATTTTTCCGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAGGTC 151-0BABES5a CTAGGGATTGGAGGTCGTCATTTTTCCGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCA--- 3-01BABES5a CTAGGGATTGGAGGTCGTCATTTTTCCGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTC 40-01BABES5a CTAGGGATTGGAGGTCGTCATTTTTCCGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTC 340-0BABES5a CTAGGGATTGGAGGTCGTCATTTTTCCGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTC 384-0BABES5a CTAGGGATTGGAGGTCGTCATTTTTCCGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTC

Figura 14.7. Allineamento multiplo delle sequenze corrispondenti al gene 18S rRNA di Babesia dei campioni inclusi nel Gruppo Babesia EU1-like. Le sigle corrispondono ai campioni di zecca risultati positivi per Babesia

(24)

Gruppo B. divergens-like:

gi|57472249|B. capreoli CACCAGAGTAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGC-AGCCGC-GGTA gi|55709804|B. divergens CACCAGAGTAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGC-AGCCGC-GGTA SLO1-BABES|B. divergens ---GTCTGGTGCCAGC-AGCCGC-GGTA 36-01BABES| ---GTCTGGTGCCAGC-AGCCGC-G-TA BABBO-BABES|B. div/cap ---GTCTGGTGCCAGCGAGCCGCTGGTA

Figura 14.8. Allineamento multiplo della sequenza corrispondente al gene 18S rRNA di Babesia del campione positivo 36-01BABES incluso nel Gruppo B. divergens-like con sequenze di controllo (SLO1-BABES = controllo positivo B. divergen; BABBO-BABES = controllo positivo per B. divergens GI 57472249 e GI 55709804 = sequenze in banca dati GenBank)

(25)

Con i primer per il gene 18S rRNA è stato possibile amplificare soltanto il campione 36-01 del gruppo B. divergens-like. L’analisi della sequenza 36-01 ha messo in evidenza un’omologia leggermente più alta con la specie B. capreoli, rispetto alla specie B. divergens, così come il controllo positivo BABBO (B. divergens) proveniente da Bologna. Il confronto con il controllo positivo SLO1 (B. divergens) indica che le specie B. divergens e B. capreoli sono estremamente vicine dal punto di vista genetico (Figura 14.8 e Tabella 14.3).

campione omologia con le sequenze in GenBank

B. divergens gi|55709804| B. capreoli gi|57472249|

36-01 99,4 % 99,8 %

SLO1 100 % 99,6 %

BABBO 98,2 % 98,6 %

Tabella 14.3. Analisi di omologia tra le sequenze del gene 18 S rRNA ottenute dal campione 36-01 (gruppo B.

divergens-like) e dai controlli positivi SLO1 (B. divergens) e BABBO (B. divergens).

Le sequenze sono state sottoposte ad analisi filogenetica con il programma Multialin (http://bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/multalin/multalin.html).

Come dimostra la Figura 14.9, la sequenza 36-01, che rappresenta il gruppo B. divergens-

like, fa cluster (gruppo) con la specie B. divergens, ma nel cluster c’è anche B. capreoli, a

conferma del fatto che queste due specie sono filogeneticamente molto simili tra loro. La

sequenza 3-01, che rappresenta il gruppo Babesia EU1-like, fa indubbiamente cluster con il

controllo positivo SLO3 (Babesia EU1) e con le sequenze della specie Babesia EU1

depositate in banca dati GenBank.

(26)

B. odocoilei B. odocoilei AY046577

B. odocoilei AY237638 B. odocoilei AY339761

B. sp. EU1 3-01 sample

B. sp. EU1 AY046575 B. sp. EU1 EF185818

B. sp. EU1 AY553915 SLO3 strain

B. sp. EU1 AY572457

B. divergens BABBO strain

SLO1 strain 36-01 sample B. capreoli AY726010 B. capreoli AY726009 B. divergens EF458229 B. divergens AY046576 B. divergens AY789076

B. capreoli

B. divergens

G1 strain G2 strain B. microti AY693840 B. microti AY144700 B. microti AY144701

B. microti

B. bovis B. bovis EF643472

B. bovis EF458213 B. bovis L31922 10 PAM

3-01 sample= Campione positivo rappresentante il gruppo B. EU1-like 36-01 sample= Campione positivo rappresentante il gruppo B. divergens-like SLO3 strain= B. EU1 (Controllo positivo)

BABBO strain= B. divergens (Controllo positivo) SLO1 strain= B. divergens (Controllo positivo) G1 strain= B. microti (Controllo positivo) G2 strain= B. microti (Controllo positivo) SIGLA GI= Sequenze in banca dati GenBank

Figura 14.9. Risultato dell’analisi filogenetica eseguita sulle sequenze del gene 18S rRNA di Babesia con il programma Multialin che utilizza le distanze PAM (Percent Accepted Mutation). Il campione 36-01 rappresenta il gruppo B. divergens-like, mentre il campione 3-01 rappresenta il gruppo Babesia EU1-like.

(27)

115 15. MULTIPLEX PCR

La tecnica multiplex PCR consente di amplificare due o più bersagli genetici con coppie di primer specifiche per ogni singolo bersaglio, in un’unica reazione di amplificazione. Lo sviluppo di un protocollo specifico per l’identificazione simultanea di Borrelia, Rickettsia, Anaplasma e Babesia risulta di particolare utilità nel far risparmiare tempo e denaro quando si effettuano screening su grandi numeri oppure, nel caso di un’applicazione diagnostica, accelerare la risposta di laboratorio, soprattutto per quei casi che presentano una sintomatologia atipica difficilmente riconducibile, in tempi brevi, ad una specifica malattia trasmessa da zecche.

15. 1. Creazione dei primer

Le sequenze dei patogeni depositate in banca dati GenBank sono state allineate con il software ChromasPro Version 1.41. (Figura 15.1) al fine di individuare le regioni costanti presenti nelle diverse specie di ogni singolo patogeno.

Figura 15.1. Parte dell’allineamento delle sequenze di diverse specie di Borrelia depositate in banca dati GenBank con il software ChromasPro Version 1.41.

(28)

116 Su queste regioni costanti sono state disegnate le sequenze dei primer utilizzando il programma Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/) disponibile in rete. Un esempio dell’elaborazione viene presentata in Figura 15.2.

Figura 15.2. Elaborazione dei primer specifici per il gene epank1 di A. phagocytophilum nel sistema multiplex PCR

In base all’elaborazione ottenuta con il programma Primer 3 sono stati scelti 4 set di primer di diverso peso molecolare del prodotto di amplificazione (Tabella 15.1), al fine di distinguerli su gel di agarosio. L’altra caratteristica che ha condizionato la scelta di queste 4 coppie è stata la temperatura di appaiamento di circa 58°C - 60°C, in modo da poter applicare un comune ciclo di amplificazione, in particolare, una temperatura di appaiamento egualmente favorevole alle 4 coppie di primer del sistema multiplex PCR.

patogeno bersaglio nome primer Sequenza primer 5’→3’ Peso dell’

amplificato

BORMUL1 GAGTTCGCGGGAGAGTAAGTT

B. burgdorferi s. s. spazio inter-

genico 5S-23S BORMUL2 TTTGCCAATTTGTTTATGCAAC 200 bp

BABMUL1 GACGAACTACTGCGAAAGCA

Babesia spp. gene 18S

rRNA BABMUL2 GTGCTGAAGGAGTCGGAAAA 153 bp

ANAMUL1 CTGTCGGCCACTCTCTTCTC

A. phagocytophilum gene epank1

ANAMUL2 ACGGACGAGCTTTCAATGAT 311 bp

RICMUL1 GAGGATGATCAGCCACACTG

Rickettsia spp. gene 16S

rRNA RICMUL2 AATTAAACCGCATGCTCCAC 638 bp

Tabella 15.1. Nomi e caratteristiche delle coppie di primer del sistema multiplex PCR disegnati con il programma Primer 3.

(29)

117 15. 2.Verifica dell’efficienza dei primer

Amplificazione con coppia singola di primer

La verifica dell’efficienza delle singole coppie di primer è stata effettuata applicando il seguente protocollo: 2.5 o 5 µl del DNA estratto, 1X tampone di reazione per Taq polimerasi (New England Biolabs), 0.3 µM di ogni primer (Sigma-Genosys Ltd), 200 µM di ogni desossinucleotide (Eppendorf), 0.8 U di Taq polimerasi (New England Biolabs), e acqua ultrapura fino a un volume finale di 25 µl.

Sono state effettuate diverse prove di amplificazione variando sia la temperatura e il tempo di appaiamento, che il tempo di allungamento. Le condizioni di PCR del ciclo riportato di seguito sono quelle che hanno dimostrato di favorire al meglio tutti e quattro i set di primer portando ad un prodotto di amplificazione ben visibile su gel di agarosio:

PROGRAMMA “MULTIPLEX“

n° di cicli denaturazione T / t appaiamento T / t allungamento T / t

1 95°C / 3’

40 94°C / 1’ 58°C / 1’ 72°C / 1’

1 72°C / 15’

La valutazione della specificità di ogni coppia di primer verso quel patogeno per il quale è stata disegnata è stata effettuata includendo nelle analisi:

1) il DNA degli altri patogeni al fine di rilevare eventuali amplificazioni in comune con un patogeno che quella coppia di primer non doveva amplificare,

2) il DNA estratto da alcuni campioni di zecca al fine di accertare che nessuna delle 4 coppie fosse in grado di amplificare il genoma di I. ricinus.

La coppia di primer BORMUL ha dimostrato un’elevata specificità di amplificazione per B.

burgdorferi amplificando soltanto il DNA di Borrelia, anche nei campioni di zecca (Figura

15.3). Infatti, uno degli estratti di zecca è risultato positivo per il microrganismo, perciò è

stato possibile dimostrato che BORMUL è in grado di amplificare in maniera specifica anche

il DNA di Borrelia presente nelle zecche senza subire evidente inibizione (Figura 15.3A,

corsia 5).

(30)

118

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

200 bp

500 bp 500 bp

200 bp

A) B)

Figura 15.3. Visualizzazione su gel di agarosio dell’amplificato da 200 bp ottenuto con la coppia di primer BORMUL specifica per B. burgdorferi s. l. A) corsia 1: PM 100 bp, corsia 2: Borrelia afzelii (controllo positivo), corsia 3: Borrelia garinii (controllo positivo), corsia 3: controllo negativo, lane 4, 5: DNA estratto da campioni di zecca. B) corsia 1: PM 100 bp, corsia 2: controllo negativo; corsia 3: Borrelia garinii (controllo positivo), corsia 4: Rickettsia helvetica, corsia 5: Anaplasma phagocytophilum, corsia 6: Babesia EU1.

Anche la coppia di primer BABMUL ha dimostrato di essere specifica appaiandosi soltanto con le sequenze genomiche di Babesia. Infatti, come si può osservare in Figura 15.4 le corsie contenenti le amplificazioni del DNA degli altri patogeni e di zecca sono completamente negative.

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7

200 bp 200 bp

500 bp 500 bp

A) B)

Figura 15.4. Visualizzazione su gel di agarosio dell’amplificato da 153 bp ottenuto con la coppia di primer BABMUL specifica per Babesia spp. (foto in contrasto) A) corsia 1: PM 100 bp, corsia 2: Babesia EU1 (controllo positivo); corsia 3: controllo negativo, lane 4, 5: DNA estratto da campioni di zecca, corsia 6:

controllo negativo. B) corsia 1: PM 100 bp, corsia 2: Babesia EU1 (controllo positivo); corsia 3: controllo negativo, corsia 4: Rickettsia helvetica, corsia 5: Anaplasma phagocytophilum, corsia 6: Borrelia afzelii, corsia 7: Borrelia garinii.

(31)

119 L’amplificazione con la coppia ANAMUL ha dimostrato che i genomi di Babesia, Borrelia e zecca non vengono amplificati, mentre ha evidenziato una banda positiva per il DNA di Rickettsia (Figura 15.5, corsia 10). Un’analisi di omologia effettuata con il database di GenBank ha fatto supporre che la coppia ANAMUL sia in grado di amplificare una parte del gene fusA di Rickettsia. Comunque, questa ipotesi verrà verificata in seguito tramite il sequenziamento e l’analisi di omologia del prodotto di amplificazione.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

200 bp 500 bp

Figura 15.5. Visualizzazione su gel di agarosio dell’amplificato da 311 bp ottenuto con la coppia di primer ANAMUL specifica per A. phagocytophilum. Corsia 1: PM 100 bp, corsia 2: Anaplasma phagocytophilum (controllo positivo), corsia 3: controllo negativo, corsie 4-6: DNA estratto da campioni di zecca, corsia 7:

controllo negativo, corsia 8: Borrelia afzelii, corsia 9: Borrelia garinii, corsia 10: Rickettsia helvetica, corsia 11:

Babesia EU1, corsia 12: controllo negativo.

Estremamente deludente è stata l’amplificazione con il set RICMUL dal momento che è stato

in grado di amplificare anche il genoma degli altri procarioti, oltre a quello previsto di

Rickettsia (Figura 15.6). Questa coppia di primer è stata scartata vista la sua eccessiva

aspecificità. Dal momento che questa coppia di primer non riconosce il DNA di zecca, la sua

unica applicazione può essere quella di evidenziare un qualsiasi DNA procariota in un esame

preliminare del vettore.

(32)

120

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9

200 bp

200 bp 500 bp 500 bp

A) B)

Figura 15.6. Visualizzazione su gel di agarosio dell’amplificato da 638 bp ottenuto con la coppia di primer ANAMUL specifica per Rickettsia spp. A) corsia 1: PM 100 bp, corsia 2: Rickettsia helvetica (controllo positivo), corsia 3: Rickettsia monacensis (controllo positivo - estratto di zecca), corsia 4: controllo negativo;

lane 5, 6: DNA estratto da campioni di zecca. B) corsia 1: PM 100 bp, corsia 2: Rickettsia helvetica (controllo positivo), corsia 3: Rickettsia monacensis (controllo positivo - estratto di zecca), corsia 4: controllo negativo, corsia 5: Borrelia afzelii, corsia 6: Borrelia garinii, corsia 7: Anaplasma phagocytophilum, corsia 8: Babesia EU1, corsia 9: controllo negativo.

Amplificazione con il sistema multiplex PCR

Per l’ottimizzazione del sistema multiplex PCR con le coppie BORMUL, BABMUL e ANAMUL sono state effettuate varie prove a differenti concentrazioni di ogni coppia di primer simulando coinfezioni e valutando, anche in questo caso, la specificità del sistema. Le seguenti concentrazioni sono risultate ottimali per la produzione di amplificati ben visibili su gel di agarosio:

0.16 µM di ogni primer BORMUL, 0.12 µM di ogni primer BABMUL, 0.34 µM di ogni primer ANAMUL,

in un volume finale di 25 µl contenente 2.5 µl del DNA estratto, 1X tampone di reazione per Taq polimerasi (New England Biolabs), 200 µM di ogni desossinucleotide (Eppendorf), 0.8 U di Taq polimerasi (New England Biolabs), acqua ultrapura.

Il primo risultato positivo è stata l’osservazione che la contemporanea amplificazione del

DNA di Anaplasma e Rickettsia da parte della coppia ANAMUL ha portato a 2 prodotti di

amplificazione di peso molecolare diverso, quindi ben distinguibili su gel di agarosio: 311 bp

per Anaplasma e circa 250 bp per Rickettsia (Figura 15.7A).

(33)

121

1 2 3 4 5 6 7 8 9

500 bp

200 bp

B) 1 2 3 4 5 6 7 8

500 bp

200 bp

A)

Figura 15.7. Visualizzazione su gel di agarosio degli amplificati ottenuti con il sistema multiplex PCR: A) corsia 1: controllo negativo, corsia 2: Borrelia garinii+Rickettsia helvetica, corsia 3: controllo negativo, corsia 4:

Borrelia garinii+Rickettsia helvetica+ Anaplasma phagocytophilum, corsia 5: controllo negativo, corsia 6:

Borrelia garinii+Anaplasma phagocytophilum, corsia 7: controllo negativo, corsia 8: PM 100 bp. B) corsia 1:

PM 100 bp, corsia 2: Borrelia garinii, corsia 3: controllo negativo, corsia 4: Babesia EU1, corsia 5: controllo negativo, corsia 6: Babesia EU1+ Borrelia garinii, corsia 7: controllo negativo, corsie 8, 9: DNA estratto da campioni di zecca.

D’altro canto, come si può osservare nella Figura 15.7B, l’amplificazione multiplex PCR con

tutte e tre le coppie di primer ha portato alla sintesi di una banda inattesa di circa 300 bp

riferita al DNA di Babesia. Come mostra la Figura 15.8, questa banda inattesa si è dimostrata

riproducibile quando nella soluzione di amplificazione erano contemporaneamente presenti le

coppie BABMUL e BORMUL. Infatti, l’amplificazione del DNA di Babesia con la

contemporanea presenza di BABMUL e ANAMUL, senza BORMUL, nella soluzione di

reazione non ha prodotto la banda da 300 bp (Figura 15.9).

(34)

122

1 2 3 4 5 6

200 bp 500 bp

Figura 15.8. Visualizzazione su gel di agarosio degli amplificati ottenuti con sistema BABMUL + BORMUL:

corsia 1: PPMM 110000 bpbp, corsia 2: Borrelia garinii, corsia 3: controllo negativo, corsia 4: Babesia EU1, corsia 5:

controllo negativo, corsia 6: Babesia EU1+ Borrelia garinii.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

200 bp 500 bp

Figura 15.9. Visualizzazione su gel di agarosio degli amplificati ottenuti con il sistema BABMUL +ANAMUL:

corsia 1: Babesia EU1, corsia 2: controllo negativo, corsia 3: Rickettsia helvetica, corsia 4: controllo negativo, corsia 5: Anaplasma phagocytophilum, corsia 6: controllo negativo, corsia 7: Babesia EU1+Rickettsia helvetica, corsia 8: controllo negativo, corsia 9: Babesia EU1+Anaplasma phagocytophilum, corsia 10: controllo negativo, corsia 11, 12: DNA estratto da campioni di zecca, corsia 13: PM 100 bp, corsia 14: Babesia EU1+Rickettsia helvetica+ Anaplasma phagocytophilum.

In ogni caso questo problema non compromette l’uso di questo sistema multiplex PCR dal momento che Babesia ha dimostrato una prevalenza sul territorio di circa l’1% (vedi pag.