Promotori eucariotici

(1)

RNA pol I trascrive rRNA

RNA pol II trascrive mRNA per proteine

RNA pol III trascrive tRNA e 5S rRNA

(2)

LE RNA POLIMERASI COME

RICONOSCONO I PROMOTORI?

Transcribed region Promotore

-contiene sequenze

Specifiche per il legame della polimerasi

(3)

FATTORI DI TRASCRIZIONE

• FATTORI DI TRASCRIZIONE GENERALI (BASALI) - RICONOSCONO ELEMENTI “core promoter”

• REGOLATORI SPECIFICI - ATTIVATORI

- REPRESSORI

Transcribed region

ELEMENTO

ENHANCER ELEMENTO DEL

PROMOTORE Basal factor binding sites

(4)

• Il legame promotore RNA polimerasi richiede i fattori di trascrizione generali

(5)

Promotori

~200 bp

gene

(6)

Reporter gene

COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE

eg CAT, luciferase

ATTIVITA’

100%

Reporter gene 100%

Reporter gene 20%

Reporter gene 1%

Reporter gene 0%

(7)

Reporter gene eg CAT, luciferase

ATTIVITA’

100%

Reporter gene 100%

Reporter gene 400%

Reporter gene 1%

Reporter gene 0%

COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE

(8)

Livello di trascrizione

basale

attivato

represso

(9)

Transcribed region

Elementi del Core promoter

• siti di legame per I fattori di trascrizione generali Che supportano un livello di trascrizione basale

La regolazione della trascrizione e’ ottenuta dalla Azione di fattori di trascrizione gene-specifici

(10)

~24bp TATA

BRE Inr DPE

TATA-box 8 bp elemento ricco in AT

BRE 6 bp elemento ricco in purine Bound by TFIID

Bound by TFIIB Inr DPE Bound by TFIID RNAP II

(11)

TFIIA

TFIIE

TFIIF

TFIIH RNAP II

TFIIB

TFIID 2-3 subunits

2 subunits

1 subunit

10 subunits

2 subunits

12 subunits

~40 polipeptidi

(12)

~24bp TATA

BRE Inr DPE

TATA-box 8 bp AT

BRE 6 bp

lega TFIID

lega TFIIB

Inr DPE lega TFIID RNAP II

(13)

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(15)

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(16)

~24bp TATA

BRE Inr DPE

TFIIH TFIID TFIIA

TFIIB

TFIIF

RNAP II

TFIIE

(17)

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(18)

TFIID contiene la

TATA-Box Binding Protein TBP

TFIID

(19)

TFIID e’ composta da vari TBP Associated Factors

—TAFs

-aiutano il posizionamento di TFIID riconoscendo L’elemento Inr

-legano i fattori di trascrizione gene specifici -aiutano a decompattare la cromatina

(20)

~24bp TATA

BRE Inr DPE

TFIID

(21)

~24bp TATA

BRE Inr DPE

TFIID TFIIA

-aumenta e stabilizza il legame di TBP al DNA -interagisce con vari attivatori gene specifici Aiutandoli a legarsi ai vari TAF

TFIIA

(22)

~24bp TATA

BRE Inr DPE

TFIID TFIIA

TFIIB

-si lega a TBP e richiama la polimerasi

-Partecipa alla selezione del sito d’inizio e Stabilisce la direzione

(23)

~24bp TATA

BRE Inr DPE

TFIID TFIIA

TFIIB

TFIIF

RNAP II

TFIIF

Stabilizza il complesso di preinizio e induce Una torsione nel DNA

(24)

~24bp TATA

BRE Inr DPE

TFIID TFIIA

TFIIB

TFIIF

RNAP II

TFIIE

Attira una elicasi ed insieme srotolano il Promotore.

Stimola l’attivita’ chinasica di TFIIH

(25)

~24bp TATA

BRE Inr DPE

TFIIH TFIID TFIIA

TFIIB

TFIIF

RNAP II

TFIIE

TFIIH

Fosforila una delle subunita’ della polimerasi dando l’avvio alla trascrizione

(26)

— REGOLATORI GENE SPECIFICI

Transcribed region SI LEGANO A SEQUENZE REGOLATORIE

(27)

Regolatori gene specifici

• hanno una struttura modulare

• contengono un dominio che lega il DNA

• contengono uno o piu’ domini di attivazione trascrizionale

• qualche volta contengono uno o piu’ domini di repressione

• qualche volta contengono un dominio di dimerizzazione

(28)

(29)

(30)

(31)

(32)

(MADS box)

(33)

N H

H O C

Donatore Accettore

(34)

A D A M A A D M A D A D A A

A A A D A A A A D A

(35)

Transcribed region Regolatori gene specifici

1) Contengono un dominio che lega il DNA 2) E un dominio di attivazione trascrizionale

(36)

Gli Attivatori come influenzano la

trascrizione di un gene distante molte migliaia di nucleotidi?

DNA loop

(37)

Enhancers- stimolano la trascrizione

1. Attivatori si legano ad un sito specifico 2. Il DNA si ripiega

(38)

Enhancers- stimolano la trascrizione

Attivatori si legano ad un sito

specifico

Il DNA si ripiega

Si forma il complesso nel promotore

(39)

Enhancers- stimolano la trascrizione

Attivatori si legano ad un sito specifico

Il DNA si ripiega

Si forma il complesso nel promotore

Si lega la RNA polimerasi

Inizio della trascrizione

(40)

Controllo combinatoriale

dell’espressione genica

(41)

Con poche proteine

regolatorie si possono

controllare un elevato numero di geni

Diverse

combinazioni producono fenotipi differenti

(42)

Heterodimerization of DNA binding proteins can alter their sequence specificity

(43)

Enhancer e Repressori

gene promotore

enhancer

repressore 10-50,000 bp

repressore previene il legame dell’enhancer

RNAP

enhancer

interagiscono con RNAPtrascrizione

(44)

Recettori nucleari

Fattori di trascrizione regolati da molecole idrofobiche

• Cambio dell’attivita’

• Cambio della localizzazione cellulare

(45)

Recettori nucleari

TBP TAFTAF TAF

TAF

RNA pol II Il legame del ligando causa cambiamenti conformazionali

(46)

Nuclear Receptors

GR ^hsp90^hsp90 GR

Legame dell’ormone

Dissociazione da hsp90 dimerizzazione

GR GR

Migrazione nel nucleo

GR GR

Legame al DNA

(47)

Regolazione mediante fosforilazione

• Ormoni attivano una chinasi

• La chinasi fosforila un fattore di trascrizione

• Il fattore e’

attivato

(48)

Cascata delle chinasi

GF si lega al recettore - protein tyrosine kinase

Il recettore dimerizza

Il complesso fosforila MEKK – (MAP kinase kinase kinase)

MEKK fosforila SEK – una MAP kinase kinase

SEK fosforila JNK – una MAP kinase

MEKK

P MEKK

P SEKSEK P

JNK JNK

P

(49)

Cascata delle chinasi

JNK attivata migra nel nucleo e fosforila il fattore di trascrizione C-JUN

C-JUN dimerizza with C-FOS per formare AP-1

AP-1 attiva la trascrizione legandosi a –

TGA(C/G)TCA- e interagendo con I fattori di trascrizione generali

JNK P

nucleo

C-JUNC-JUN

P

RNA pol II

C-FOS P

(50)

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(51)

Metilazione del DNA

• La citosina puo’ essere metilata:

• La metilazione del DNA e’ coinvolta nell’inattivazione del

• Risulta in una maggiore condensazione della cromatina

(52)

Trascrizione e struttura della cromatina

• Il DNA nella cromatina condensata non e’

accessibile

• La cromatina condensata (eterocromatina) e’ trascrizionalmente silente

• La condensazione della cromatina dipende ANCHE dalla acetilazione degli istoni

(53)

Acetilazione degli Istoni

• E’ una modificazione post-traduzionale

• Gruppi acetilici (CH₃COO^–) legati covalentemente a aminoacidi basici Neutralizzano le cariche positive

• Eliminano le interazioni ioniche con il DNA

• Diminuiscono la condensazione

• Associati con una attiva trascrizione

(54)

– Acetilazione/Deacetilazione

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(55)

Attivatori: acetilazione degli Istoni

• Alcuni attivatori attirano delle acetilasi

• Il macchinario di trascrizione puo’ accedere al DNA meno condensato

(56)

Alcune Istone Acetilasi (HAT)

• p300/CBP

• TAF II 250

• Ambedue sono dei co-attivatori

• SAGA e’ a ponte tra un Fattore di Trascrizione e la TBP

(57)

Repressori: deacetilazione degli Istoni

• Alcuni repressori attirano delle deacetilasi

• Prevengono l’accesso del macchinario di trascrizione al DNA

(58)

– Acetilazione/Deacetilazione

(59)

SWI/SNF in Lievito

SWI/SNF sono regolatori positivi del gene HO

(accoppiamento) e del gene SUC2 (utilizzo del saccarosio).

Queste proteine catalizzano il rimodellamento ATP-dipendente del DNA

(60)

Macchinari di Rimodellamento

• Tutti contengono subunita’ simili a swi- 2/snf

• NTP-binding proteins

(61)

(62)

(63)

Regolazione dell’Espressione Genica

Puo’ essere regolata in una delle seguenti sei fasi:

DNA RNA

transcript

mRNA mRNA

inactive mRNA

protein

inactive protein

NUCLEUS CYTOSOL

trascrizione Maturazione trasporto traduzione degradazione

controllo dell’attivita’

(64)

Lo Splicing puo’ produrre anticorpi solubili o legati alla membrana dallo stesso gene

• Lo splicing alternativo puo’

produrre due tipi di anticorpo diversi con la stessa

specificita’

• Quando attivati dall’antigene i linfociti B cominciano a

produrre anticorpi solubili

• Le forme secrete mancano degli esoni 7 e 8 che

codificano per domini idrofobici

(65)

L’RNA Editing altera le sequenze dei pre-

mRNA

Figure 11-39

(66)

• mRNA editing

La deaminasi e’ presente solo nell’intestino

Nel fegato

(67)

Metodi per studiare

l’espressione dei geni

• Northern blot

• Trascrittasi Inversa -PCR (RT- PCR)

• Ibridazione In situ

• Trascrizione In vitro

• DNA Microarray

(68)

Purificazione dell’RNA

• Procedura

– Lisi delle cellule con un reagente che dissocia le nucleoproteine e inibisce la RNAsi

– Rimozione delle proteine

– Precipitazione specifica dell’RNA

(69)

Northern blot

• Per determinare la dimensione e la quantita’ di specifici mRNA

• Studi sull’espressione genica

(70)

Northern blot

– Elettroforesi dell’RNA in gel contenente formaldeide per mantenere l’RNA in forma completamente lineare

– Trasferimento dell’RNA su una membrana

– Ibridazione con una sonda marcata

(71)

100V 0,2A

+ -

generatore di corrente gel di agarosio

scatola elettroforetica tampone elettroforetico

es. TAE (4mM Tris-acetato, 1mM EDTA, pH 8.0)

(72)

Gel Elettroforesi-

Separa le molecole in base alla dimensione

(73)

Trasferimento su supporto solido

(74)

Trasferimento dal gel alla membrana

(75)

gel

membrana

Dopo il trasferimento

(76)

Preparare la sonda per il Northern Blot

(77)

Ibridazione

• La sonda marcata e’ aggiunta ad una

soluzione contenente il supporto solido che lega l’RNA da analizzare

(78)

Lavaggio

• Rimozione della sonda non legata al supporto solido

(79)

Rivelazione degli ibridi

• Esposizione di un film se la sonda e’

marcata radioattivamente

• Se la sonda e’ marcata con un enzima si procede alla reazione enzimatica che

produce colore direttamente sul supporto solido

(80)

(81)

Northern blot

• La rivelazione avviene usando:

– DNA marcato con radioattivo(³²P)

– DNA marcato con un enzima

che catalizza una reazione che produce luce o colore

(82)

Fig. 5. Northern blot analysis of E. lagascae total RNA from leaves (L), germinating seeds (Se), roots (Ro) and stems (St). The blot was

hybridized with probes for ElLTP1 (top panel) and ElLTP2 (middle panel).

The bottom panel shows ethidium bromide staining of the gel before

Northern blot

(83)

Svantaggi del Northern Blot

• Richiede grandi quantita’ di RNA

• E’ un processo lungo e laborioso

(84)

Ibridazione dell’RNA in situ

Rivelazione di mRNA direttamente su tessuti messi su vetrini da microscopio

Preparation of RNA probe with in vitro transcription

T7/T3 or SP6 promoter

(85)

Fig. 7. RNA in situ hybridization with antisense (a-c) and sense (d) RNA probes for ElLTP1.

E. lagascae seedlings were collected 7 days after sowing. co Cotyledon, en endosperm,

RNA in situ hybridization

Colour substrate:

nitro blue tetrazolium (NBT) + 5-bromo-4-

chloro-3-indolyl phosphate (BCIP)

(86)

• Il livello di RNA presente nella cellula non

necessariamente riflette direttamente i livelli di trascrizione del gene

• Per poter asserire che un gene viene attivato TRASCRIZIONALMENTE occorre poterne visualizzare l’attivita’

(87)

Il saggio di “run-on” (o della catena nascente di RNA)

permette di determinare il livello di trascrizione di un gene

1) Purificare i nuclei 2) + NTP, ³²P GTP

3) Trascrizione: la catena nascente e’ radioattiva

4) Estrazione dell’RNA

5) Ibridazione a cDNA immobilizzato su filtro

(88)

Sintesi differenziale di 12 geni codificanti mRNA epato-specifici

analizzata tramite run-on

(89)

Northern blotting

Probe labeling

pBS-SemaIII

dATP dTTP dGTP

RNA isolation dCTP

AAAAAA

Gel electophoresis

Blotting

Hybridization

Autoradiography

(90)

reverse Northern blotting

Up-regulation of transcripts

* *

labeled (specific) probe target

Northern

* *

specific probes

labeled target

reverse Northern