Ingegneria dei Tessuti
Appunti del corso del Prof. Netti
2014/2015
1. Introduzione ... 6
1.1 Introduzione all’Ingegneria dei tessuti ... 6
1.1.1 Materiali utilizzati ... 7
1.2 Ingegneria dei tessuti ... 9
1.3 Classificazione e struttura dei tessuti ... 15
1.3.1 Matrice Extracellulare ... 17
2. Componenti dell’IT ... 20
2.1 Componenti: Cellule ... 20
2.2 Componenti: Scaffold ... 22
2.2.1 Scaffold Naturali ... 22
2.2.2 Scaffold Sintetici ... 24
2.2.3 Differenze Scaffold Naturali e Sintetici ... 25
2.2.4 Requisiti degli Scaffold ... 26
2.3 Componenti: il microambiente... 27
2.3.1 Costituzione della membrana cellulare ... 29
2.3.2 Reciprocità con materiale naturale e sintetico ... 34
2.3.3 Reciprocità dinamica cellula matrice ... 35
2.3.4 Diversi approcci all’IT ... 39
3. Interazione cellula-materiale ... 50
3.1 Riconoscimento ... 50
3.2 Processo di adesione ... 53
3.2.1 Molecole della ECM ... 59
3.2.2Risposta Cellulare ... 61
3.2.3 Recettori di adesione ... 64
3.2.3 Proteine delle placche di adesione ... 70
3.2.4 Adesione Cellulare ... 75
3.2.5 Superfici Adesive ... 78
4. La cellula ... 82
4.1 Cellule impiegate nell’IT ... 83
4.1.1 La cellula Eucariotica... 85
4.1.2 Tipi di cellule e le loro dimensioni ... 86
4.2 La cellula e le sue funzioni ... 90
4.3 Cellule utilizzate per rigenerare un tessuto ... 92
4.3.1 Recupero, espansione e coltura cellulare ... 93
4.3.2 Cellule staminali ... 102
5. I Materiali ... 123
5.1 Funzioni del materiale ... 123
5.1.1 Salt leaching e solid freeform ... 127
5.2 Materiali Impiegati ... 128
5.3 Proprietà e caratteristiche degli Scaffold ... 131
5.4 Progettazione di Scaffold polimerici ... 134
5.5 Tecnologie per la formazione di Scaffold ... 135
5.5.1 Solvent Casting/Particulate Leaching ... 138
5.5.2 Gas Foaming ... 141
5.5.3 Fiber Bonding ... 147
5.5.4 Elettrospinning ... 150
5.5.5 Phase Separation ... 155
5.5.6 Rapid Prototyping ... 161
5.6 Gel Polimerici in IT ... 182
5.6.1 Sintesi di Hydrogel... 184
5.6.2 Gel fisici e chimici ... 185
5.6.3 Forze di Selling ... 190
5.6.4 Sistemi interpenetrati ... 192
5.6.5 Cinetiche di Swelling ... 195
5.6.6 Proprietà meccaniche ... 199
5.6.7 Perché hydrogel in IT ... 201
5.6.8 Classificazione degli Hydrogel ... 206
5.6.9 Meccanismi di reticolazione ... 206
5.6.10 Equilibrio dei gel ... 209
5.6.11 Meccanica dei gel... 212
6. Rigenerazione dei tessuti in vitro ... 221
6.1 Rigenerazione dei tessuti in vitro ... 221
6.1.1 Rigenerazione e riparo ... 222
6.1.2 Self-assembly ... 224
6.1.3 Collagene ... 225
6.2 Processo di rigenerazione ... 230
6.2.1 I processi ... 232
6.2.2 I materiali ... 233
6.2.3 Accoppiamento cellula matrice ... 240
6.3 Potenza del segnale ... 248
6.3.1 Orientazione fibre ... 256
6.3.2 Costruzione tessuti complessi in vitro ... 259
7. Vascolarizzazione e Protesi vascolari ... 267
7.1 I vasi sanguigni ... 267
7.1.1 Funzione ... 268
7.1.2 Struttura ... 269
7.1.3 Classificazione vasi e proprietà... 270
7.2 Protesi vascolari ... 276
7.2.1 Patologie collegate a protesi sintetiche ... 278
7.2.2 Vascolarizzazione ... 282
8.Tessuto Osseo ... 289
8.1 Introduzione ... 289
8.2 Meccanismi di riparo ... 291
8.2.1 Innesti ossei ... 293
8.2.2 Proprietà Scaffold per la rigenerazione del tessuto osseo ... 294
9. Condizioni del Microambiente... 304
9.1 Introduzione ... 304
9.2 Trasporto ... 307
10. Bioreattori ... 314
10.1 Introduzione ... 314
10.2 Schemi di bireattori ... 317
10.3 Progettazione del processo ... 318
10.3.1 Parametri che influenzano il processo ... 319
10.3.2 Crescita, consumo, trasporto ... 324
10.4 Classificazione dei bioreattori ... 334
10.4.1 Bioreattori a stimoli idrodinamici: SPINNER FLASK ... 336
10.4.2 Bioreattori a stimoli idrodinamici: ROTATING WALL ... 337
10.4.3. Bioreattori a stimoli idrodinamici A PERFUSIONE DIRETTA ... 338
10.5 Tecniche di seeding ... 343
10.6 Inserimento di un Bioreattore in un processo di coltura in vitro ... 345
10.6.1 Ingegnerizzazione della cartilagine articolare in diversi tipi di colture idro-dinamiche ... 345
10.7 IT: Strategie di ottimizzazione ... 352
10.7.1 Progettazione di processo ... 354
10.7.2 Ingegnerizzazione della cartilagine ... 358
10.7.3 Massimizzazione del trasporto di massa in bireattori a stimolazione meccanica ... 359
11.Metabolismo cellulare : effetti del microambiente sulla rigenerazione dei tessuti ... 376
11.1 Premessa ... 376
11.2 Metabolismo ... 379
12. Tessuto nervoso... 400
12.1 Introduzione ... 400
12.2 Esempi di danno e riparo ... 403
12.3 Riparo Contact Guidance ... 405
12.4 Altre strategie di riparo ... 407
Chiarimenti... 409
Riepilogo sul processo di degradazione per idrolisi ... 409
1. Introduzione
1.1 Introduzione all’Ingegneria dei tessuti
L'ingegneria dei tessuti studia la possibilità di rigenerare un tessuto, ricostruire un tessuto in vivo o in vitro dopo essere impiantato in vivo in modo da sopperire una mancanza del tessuto stesso qualora esso non ci sia per motivi congeniti o non ci sia per danni e ad esempio per delle ferite o delle ustioni.
Mentre Madre Natura riesce a costruire organi partendo da cellule specializzate, l’uomo per replicare la natura tenta di adoperare una serie di supporti.
Se per esempio si prende come target la realizzazione di una cornea in laboratorio, o un pezzo di pelle in laboratorio, non è sufficiente prelevare le cellule della cornea o della pelle e queste spontaneamente costruiranno il tessuto di dove sono originate. Se devo scegliere delle cellule, sarà meglio scegliere la fonte cellulare più specifica per quell’organo. Infatti così come in vivo le cellule vivono in una matrice, nel tessuto, per cui si deve creare qualcosa in laboratorio che sia simile a quella reale di provenienza. Così come le cellule non si nutrono di aria, ma sono immerse in fluidi liquidi, nutrienti, macromolecole, ormoni e vitamine etc. si deve anche sostenere la coltura cellulare con l’apposito sostentamento di nutrienti, quali fattori di crescita, ormoni, sali etc..
Le componenti fondamentali dell'IT sono cellule, materiali o scaffold sui quali far crescere il nuovo tessuto e il controllo del micro-ambiente, cioè fornire i segnali e i fattori fondamentali affinché le cellule possano effettivamente rigenerare il tessuto:
Cellule Materiali
Condizioni Di Processo
Ingegneria dei Tessuti
Infatti per imitare la natura è richiesto che innanzitutto si abbiano basi di biologia, in particolar modo degli organi e dei tessuti, si sviluppi metodi per il controllo dei processi biologici e di strategie necessarie sia per sostituire tessuti viventi sia per il loro riparo e rigenerazione.
Le cellule
I materiali
microambiente
Queste sono tre entità che sono fortemente collegate tra loro che devono essere ottimizzare per realizzare il tessuto di interesse.
Una parte del corso sarà volta alle fonti cellulari, e alle cellule in generale, il loro funzionamento e una classificazione. Si farà una divisione tra cellule differenziate e non, ovvero le cellule staminali.
Queste sono cellule indifferenziate dalle quali si può creare, potenzialmente, qualsiasi tipo cellulare.
Una cellula differenziata non ha questa capacità (ad esempio una cellula muscolare fa parte solo del tessuto muscolare) e non la può essere utilizzare per fare un’altra cosa, a meno che non si introducano concetti di ingegneria genetica.
Come abbiamo già detto, le cellule per crescere si devono attaccare qualche cosa (sono poche le cellule che non sono ancorate a qualcosa, ad esempio i globuli rossi e bianchi, che sono sempre in flusso e sono caratterizzate dal fatto di stare sempre in flusso e non essere ancorate). Oltre queste e qualche altro tipo cellulare, le altre sono ferme in un posto, come le cellule dell’epidermide, che sono ferme ed attaccate su una membrana basale che separa l’epidermide dal derma. Il derma è formato da matrice extracellulare, tipicamente collagene, e dalle cellule del derma, i fibroblasti che sono bloccati nella matrice, queste cellule vivono se sono ancorate.
1.1.1 Materiali utilizzati
Se si prende una cellula del derma e la si tiene in sospensione in un liquido questa muore anche se si forniscono tutti i nutrienti possibili. Se questa cellula non attecchisce al substrato muore. E’ quindi necessaria una struttura di supporto, ovvero di materiali. Questi materiali possono essere di due tipi:
Materiali naturali
Materiali sintetici
Il concetto è quello di copiare la natura. Vado a vedere la natura come fa, quali sono i materiali e i building blocks, ovvero i tasselli per realizzare i tessuti. Sostanzialmente si tratta di biopolimeri, macromolecole organiche, o il collagene (si ricorda che il 70/75% delle proteine strutturate appartengono alla famiglia del collagene). Queste sono proteine che vengono estratte da fonti animali ed sono perfettamente tollerate dalle cellule e dall’organismo, e quindi perché non usare questo materiale per costruire dei supporti per ospitare le cellule. Questo biopolimero è anche usato nella chirurgia, come filler. Ad esempio quando si asportano grandi masse di tumore si usano paste di collagene come filler, per “tappare il buco”. In più è di origine animale, e non presenta rigetto.
Questo perché il collagene è una proteina molto conservata tra i vertebrati e le sequenze amminoacidiche che codificano per il collagene sono molto simili.
Altre bioproteine naturali usate sono la fibrina, il componente principale dei coaguli di sangue che servono a formare quella che è comunemente chiamata “crosta” per “tappare” le ferite. È una gelatina vera e propri, ed ha una consistenza tipo marmellata ed è perfettamente tollerata dall’organismo. In più, in alcuni casi produce e stimola la produzione di matrice extracellulare.
Infatti la fibrina serve da tappo per le ferite e stimola la ricrescita del epidermide sottostante. Questi sono biopolimeri naturali già presenti nel nostro corpo.
Un altro esempio è l’acido ialuronico, molto usato in chirurgia estetica. Questo non è una proteina ma un polisaccaride.
Esistono poi tutta una parte di materiali che non sono presenti all’interno dell’organismo ma che possono essere utilizzati come gli alginati (struttura gelatinosa, estratto dalle alghe), come l’acido retinico, l’agarosio, che sono zuccheri. Questi sono simili a quelli presenti in vivo e sono ben tollerati dalle cellule e dai tessuti.
Passiamo ai materiali sintetici. Questi sono quelli non naturali, prodotti per sintesi chimica e sono materiali che non si trovano né nel nostro organismo che in natura.
Un esempio di materiale sintetico che può essere usato con un tessuto, che non crei infiammazioni, rigetto o necrosi può essere il materiale che costituisce le lentine a contatto. Queste sono fatte di materiali sintetici ben tollerate dall’organismo. Queste sono degli idrogeli, ovvero delle gelatine piene di acqua, infatti vengono conservate in una soluzione. Il nome corretto è polossimetilagrilato.
Gli hydrogel sono usati per fare le cartilagini.
Vi sono anche altri tipi di materiali, come l’acciaio A316L per la protesi d’anca, il titanio e leghe del titanio.
Bisogna però precisare quale tipo di materiali di cui abbiamo bisogno per l’ingegneria dei tessuti.
Nel termine ingegneria dei tessuti se io voglio realizzare un tessuto, un organo da impiantare, andremo a prendere il metallo? No! Perché è un materiale permanente, di fatti non rigenera l’anca ma la sostituisce, è una protesi. Si cerca invece di scegliere dei materiali che nel tempo si degradano e lasciano spazio al tessuto di neo produzione. Prendo il materiale e coltivo le cellule all’interno, le cellule producono le loro proteine e il materiale di supporto nel tempo si degrada. Nella migliore delle ipotesi avremo alla fine un tessuto integralmente costruito dalle cellule stesse.
Il materiale di supporto in ingegneria dei tessuti ha un nome ben preciso ed è Scaffold, dall’inglese è proprio l’impalcatura che si mette fuori i palazzi. Questi devono essere biodegradabili e bioassorbibili. La degradazione dello scaffold deve matchare con la velocità con cui le cellule producono tessuto. Non deve degradare troppo in fretta altrimenti non creo tessuto e neanche troppo lentamente altrimenti non lascio lo spazio al tessuto.
Quindi la velocità di degradazione deve essere simile alla velocità di produzione di tessuto.
Altri materiali utilizzabili possono essere i ceramici e l’idrossiapatite. I ceramici come i metalli possono avere un problema di riassorbimento. Inoltre ricordiamo che i contenitori ceramici sono quelli che sono inattaccabili da solventi acidi, basici e altro. Ma ci sono dei particolari ceramici che servono alle cellule per costruire un tessuto. Tuttavia ci sono dei particolari ceramici che sono perfettamente riconosciuti dalle cellule e servono per costruire il tessuto di provenienza come l’osso, che infatti ha una frazione minerale non indifferente, ed infatti, l’osso è un materiale ceramico a tutti gli effetti. L’idrossipatatite è invece un composto di calcio, fosforo ed altri materiali.
Quindi non tutti i ceramici sono utilizzabili. Esistono invece dei biovetri, ovvero vetri a base di silicio che sono degradati dalle cellule e sostituiti da una matrice mineralizzata.
Esistono anche i materiali polimerici. Alcuni possono e altri non possono essere utilizzati. I materiali polimerici altro non sono che i materiali plastici.
Moltissimi materiali polimerici sono utilizzati in clinica tutti i giorni, come i punti di sutura in nylon, oppure per le protesi vascolari e palloni intraortici, e hanno la stessa composizione chimica delle bottigliette di plastica. Questi sono materiali che di per loro non hanno una tossicità particolare, rigetto o infiammazione acuta o cronica, ma non tutti i materiali polimerici sono biodegradabili.
Questa cosa non si può prevedere, ma dipende dalla chimica di costituzione del polimero, ovvero come è fatto dal punto di vista della struttura molecolare. Il PET usato per le bottigline di plastica, è anche usato anche per le protesi vascolari, ma non è biodegradabile, è quindi è usato per fare protesi stabili ma non per l’ingegneria dei tessuti.
Vi ho parlato prima dei punti di sutura, e sapete che ce ne sono di biodegradabili. Perché allora non utilizzare questo materiale in ingegneria dei tessuti? Infatti l’acido polilattico (PLLA) è ampiamente utilizzato. L’acido poliglicolico (PGA) e il prolattone (PCL) è un altro polimero sintetico biodegradabile.
Le cellule vanno coltivate all’interno dei materiali, non si può realizzare un tessuto partendo da cellule su una superficie piana. Lo scaffold deve diventare quella struttura tridimensionale. Se voglio costruire un particolare tessuto, devo prevedere che lo scaffold deve avere una geometria, una forma comparabile con il tessuto che voglio costruire. Se per esempio si vuole costruire uno scaffold per costruire osso in vitro, questo deve avere proprietà simili a quelle dell’osso naturale, e deve avere delle caratteristiche morfologiche e funzionali simili all’osso. Inoltre la geometria dello scaffold deve essere paragonabile a quella dell’osso. Se voglio, quindi realizzare un pezzo di femore, andrò a fare uno scaffold cilindrico, cavo all’interno, come il femore, con le dimensioni paragonabili alla parte corticale dell’osso.
1.2 Ingegneria dei tessuti
La base di tutta questa tecnologia (dato che non è definibile come una scienza) è finalizzata alla sostituzione di organi, ci sono cinque approcci praticabili.
Cinque approcci per la sostituzione di Organi
□ Trapianto
□ Autografting
□ Impianto permanente
□ Ingegneria dei tessuti (Sintesi in vitro) Rigenerazione guidata (sintesi in vivo)
