Laurea in Medicina e Chirurgia

Laurea in Medicina e Chirurgia

Anno accademico 2011-2012

Biochimica/biologia molecolare clinica e diabete

Prof. Fabrizio Barbetti

Il diabete mellito

• Definizione e tipi di diabete mellito.

• Cenni sul controllo fisiologico dei livelli ematici del glucosio.

• Ia biochimica clinica nella diagnosi del diabete mellito.

• Il diabete monogenico e la sua diagnostica

• La biochimica clinica nel controllo metabolico e nella valutazione delle complicanze

Definizione di diabete mellito

• “Un gruppo di disordini metabolici eterogenei dal punto di vista clinico e genetico caratterizzati da

elevati livelli ematici di GLUCOSIO”

• Nella classificazione corrente si distinguono due tipi principali di diabete:

• il tipo 1 (T1D, distruzione immuno-mediata delle cellule pancreatiche).

• il tipo 2 (T2D, conbinazione di “insulino resistenza”

e deficit insulinico risultanti sia da fattori genetici che ambientali).

• T1D + T2D: >95% dei casi

Il controllo fisiologico dei livelli ematici del glucosio

• Il glucosio ematico è regolato entro limiti stretti.

• Il controllo fisiologico della glicemia è -tra l’altro- finalizzato al

mantenimento di livelli minimi di glucosio durante la fase di digiuno notturna.

1 H-C=O

2 H-C-OH 3 OH-C-H 4 H-C-OH 5 H-C-OH 6 CH₂OH D-Glucosio

Gluconeogenesi Glicogenolisi

Isola pancreatica







Insulina Glucagone

Somatostatina

Glucosio

+ +

+

+

70 mg/dl 120

Glicemia

Gluconeogenesi Glicogenolisi

Isola pancreatica







Insulina Glucagone

Somatostatina

FEGATO MUSCOLO

SCHELETRICO TESSUTO ADIPOSO

Glucosio

+ +

+

+

400 mg/dl 600

Glicemia

2+

La “soglia” renale

• I livelli plasmatici di glicemia raggiunti i quali si “satura” il meccanismo di riassorbimento del glucosio a livello del tubulo renale:

mediamente attorno a 180 mg/dl.

• Primo dosaggio

affidabile della glicemia su sangue intero:

Folin-Wu (1920).

Primi inibitori della glicolisi: 1931.

I primordi della biochimica clinica:

il “dosaggio” (!?!) della glicosuria nella diagnosi di diabete

• Diagnosi rara nell’ ‘800: su circa 48.000 ricoveri al Massachussets General Hospital tra il 1824-1898, solo in 172 casi (0,004%) venne emessa diagnosi di diabete.

Metodo analitico: far assaggiare

al medico interno le urine del paziente.

Dosaggio della glicemia: raccolta e conservazione del campione

• Il dosaggio del glucosio in laboratorio è effettuato su siero o plasma (il sangue intero è utilizzato nell’autocontrollo domiciliare e fornisce valori più bassi del 12-15%).

• Poiché la glicolisi diminuisce la concetrazione di glucosio ad un tasso del 5-7%/h a temperatura ambiente, si aggiungono al prelievo inibitori della glicolisi come il sodio fluoruro (NaF), in grado di stabilizzare i livelli di glucosio per almeno 3 giorni a temperatura ambiente ed un anticoagulante (ossalato di potassio).

Diabete tipo 2: rilevanza della diagnosi

• T2D= circa 90% di tutti i casi. Insorge tipicamente

> 50 anni di età ed ha una elevata morbidità e costo sociale.

• L’aumento della prevalenza di T2D correla con l’aumento dell’obesità.

• 30-35% degli individui con T2D sono asintomatici ed inconsapevoli della malattia.

• L’iperglicemia asintomatica può precedere di molti anni (fino a 10) l’esordio clinico e correla con il

rischio cardiovascolare.

• Una significativa percentuale di pazienti con T2D (ca.

20% negli USA) presenta retinopatia diabetica alla diagnosi.

Le complicanze alla diagnosi come indicatore di malattia

silente: la retinopatia

• La retinopatia diabetica può essere presente alla diagnosi e correla con gli anni di malattia.

Estrapolando i dati è evidente che il diabete tipo 2 può essere presente almeno 6.5 anni prima dei sintomi clinici (e oltre !).

Diabetes ():

“passare attraverso”

• 1964: il WHO

stabilisce/propone i

primi criteri diagnostici mediante il carico orale di “tolleranza”

GLUCOSIO (OGTT).

• In Giappone:

“Shoukachi” ovvero malattia della sete.

• Primi del ‘900: test di “tolleranza” al RISO

Carico orale di glucosio (OGTT): modalità.

• OGTT “standard”: 75 g di glucosio

(disciolto) per os e prelievi al tempo 0’

ed ogni 30’ per 2 ore.

• Da effettuarsi solo se la glicemia a digiuno NON abbia già valore diagnostico.

• Casi speciali.

• Screening del diabete gestazionale: minitest (50 g), prelievi a 0’ e 60’. Se >140 mg/dl a 60’, OGTT con 100 g.

• Bambini < 40 Kg:

1.75g per Kg di peso corporeo.

Diabete mellito: criteri

diagnostici ADA* e WHO §

• Criteri ADA*/WHO§

• Sintomi classici di diabete e un valore di glicemia venosa plasmatica

“casuale” =/> a 200 mg/dl (*, §).

• Glicemia a digiuno >126 mg/dl (per 2 volte) (*, §).

• Glicemia =/>200 mg/dl al tempo 120’ dell’OGTT (§, [*]).

• Categorie a rischio:

• IGT (alterata tolleranza al glucosio): coloro che

hanno una glicemia plasmatica a 120’

dell’OGTT >140 e <200 mg/dl (§, [*]).

• IFG (alterata glicemia a digiuno): coloro che hanno una glicemia a digiuno

>100** e <126 mg/dl (*).

** RIVISTO NEL 2003 (precedente >110)

Criterio di scelta della glicemia a digiuno diagnostica di diabete da

parte degli esperti ADA

• Il valore di 126 mg/dl è stato scelto come

“equivalente” in

termini di sensibilità e specificità al valore di 200 mg/dl a 120’

dell’OGTT.

Uso o non uso dell’OGTT nella diagnosi di diabete: conseguenze pratiche

bassa= <2

<50 anni magri

elevata= ca. 30

>50 anni obesi Incidenza

7.6 casi/1000/anno Incidenza/10 aa.

IFG/NGT

>110<126/<140 X 11

Incidenza/10 aa.

NFG/IGT

<110/>140<200 X 4

Incidenza/10 aa.

IFG/IGT

>110<126 + >140<200 X 20

Studio di BRUNICO (follow-up a 10 a.)

40-79 anni= 919->837

Prevalenza FPG+OGTT (WHO) =7.2%

Prevalenza solo FPG (ADA) = 5.5%

Cambiamento di prevalenza: non solo un problema metodologico

• Boston, 1946. Campione:

circa 70.000 persone.

• USA 2000 (stima WHO):

17.700.000

• Messico 2000 (stima WHO): 2.179.000

• Italia 2000 (stima WHO):

4.252.000

• Prevalenza diabete: 0.52

%

• USA 2030 (stima WHO:

30.3120.000

• Messico 2030 (stima WHO): 6.130.000

• Italia 2030 (stima WHO):

Il diabete tipo 1

• Il T1D è una malattia autoimmune organo specifica caratterizzata dalla distruzione delle cellule beta pancreatiche mediata dai linfociti T.

• Esordisce tra l’infanzia e la pubertà, ma nessuna età è risparmiata.

• L’esordio clinico è spesso brusco, con forte dimagramento, poliuria, iperglicemia elevata accompagnata da chetosi.

Gli autoanticorpi circolanti confermano la diagnosi clinica

• Islet Cell Antibodies (ICA)

• Glutamic Acid Decarboxylase Antib. (GADA)

• Insulinoma-associated protein 2 Antib. (IA-2A)

• Insulin autoantibodies (IAA)

• ZnT8 autoantibodies (ZnT8A)

Ruolo degli autoanticorpi per la predizione del T1D

• Il dosaggio degli autoanticorpi nei

parenti di primo grado di soggetti con T1D combinato con la valutazione delle

secrezione insulinica è un valido predittore di insorgenza di T1D.

• Circa il 3-5% dei

pazienti clinicamente T1D sono negativi al dosaggio degli

autoanticorpi.

Elevata percentuale di malattia celiaca nei pazienti con T1D

• 6.8-8.3 % dei

pazienti con T1D hanno la malattia celiaca, confermata con biopsia

intestinale.

• Di questi, circa il 70% sono

sintomatici.

• IgA antiendomisio (EmA) o anti-TG2

• (sensib.>90%, spec.>95%

• Se IgA tot. <5 g/L->

IgG antigliadina (AGA)

GENETICA del T1D e T2D

• Entrambe malattie poligeniche (nessun andamento di tipo mendeliano)

• Geni maggiori del T1D:

1) HLA; 2) VNTR del gene INS

• Geni maggiori del T2D:

polimorfismi del gene TCF7L2, moltissimi altri

^{Glic.= 132}

Età= 31 anni

“Scoperta”= 24 aa Terap.=Dieta

= Normale

La famiglia “GCK/MODY 2”

Glicemia= 118 Glicemia= 130

^{Glic.= 143}

Età= 65 anni

“Scoperta” = 39 aa Terapia=Dieta Complicanze=NO

Le mutazioni GCK/MODY 2 (1)

• Il gene della glucochinasi (GCK) è uno dei sette geni noti che causano un sottotipo monogenico di diabete mellito denominato MODY (Maturity Onset Diabetes of the

Young).

• Il MODY si definisce come una condizione

autosomica dominante in cui il diabete -non di tipo 1- insorge prima dei 25 anni di età.

CANALE DEL Ca++

DI CLASSE L

CANALE DEL K+ ATP-SENSIBILE

GK (alta Km)

INSULINA

K+

(DEPOLAR.)

Ca++

GLUCOSIO (+)

ATP/ADP

(+)

Ca++

(+)

RECETTORE DELL'INSULINA

GK (alta Km) (+)

CELLULA BETA EPATOCITA

2 2

Le mutazioni GCK/MODY 2 (2)

• Le mutazioni della glucochinasi sono

relativamente frequenti quando ricercate in una casistica pediatrica.

• L’iperglicemia è modesta e NON progredisce nel tempo.

• La diagnosi molecolare derime i dubbi nei

famigliari del bambino portatore ed è utile per l’indirizzo terapeutico e della valutazione

delle complicanze.

Il diabete tipo 1: un esempio clinico .

• Bambino di 14 anni con recente perdita di peso, poliuria, polidipsia, alito acetonico

• Glicemia a digiuno: 318 mg/dl

• Chetoni nelle urine: presenti (Ketostix ++

+, semiquantitativo= 80-100 mg/dl)

• Diagnosi clinica: diabete tipo 1.

• E’ una diagnosi corretta ?

Il dosaggio degli autoanticorpi nel sospetto clinico di T1D in soggetti ad elevata

familiarità

• ICA

• Decarbossilasi

dell’acido glutamico (GAD₆₅)

• Islet antigen 2 (IA-2)

• Insulina (IAA)

= Diabete mellito ad esordio precoce (<40 anni)

= Sospetto T1D Ab - probabile

MODY3/HNF 1

Ab + T1D

Mutazioni MODY 3/HNF-1: possibili meccanismi di iperglicemia

• Topo HNF-1 -/-.

Ridotta espressione genica nella cellula  di:

• 1) Ins-1 (ma non Ins-2)

• 2) Glut 2, GK

• 3) Ipf-1/Pdx-1

• 4) NeuroD, HNF-4

Efficacia delle solfaniluree nei paz.

MODY 3

• Deterioramento della HbA1c->

10.3% dopo cambio per metformina

• Perdita di peso - 5.3kg

• Ripristinata

Glibenclamide 5mg

• HbA1c 5.3%

4 5 6 7 8 9 10 11

8 8.5 9

9.5 10 10.5 11 11.5 12 12.5 13 13.5 Years from Diagnosis

SU stopped M started

SU started M stopped

HbA1c

%

Pearson et al. Diab Med 2000

Casi sporadici con insorgenza nei primi 6 mesi di vita:diagnosi ?

• Neonato che alla terza giornata di vita esordisce con glicemia 400 mg/dl,

chetoacidosi

• Peso alla nascita: 2.400 g

• Familiarità per diabete: nessuna

K_IR6.2

SUR1

K⁺

Glucose ATP/ADP

Ca²⁺

[Ca²⁺]_i

VDCC

K_ATP independent or augmentation pathway

- prolonged 2^nd phase insulin release

K_ATP channels and insulin secretion regulation

pulsatile

insulin release

_

+ +

K_ATP channel activity

+

K_ATP dependent or triggering pathway

produce 1^st phase insulin release

KCOs

sulphonylureas

Ca_v2.3

Insulin weaning and transfer to SU in patients with KCNJ11 mutation

MUT Age at

“switch” Dose

mg/kg/d HbA1c TX: Ins

HbA1c TX: SU

Dur. TX SU

C-peptide nmol/L

R50P ^{10a, 6m} 0.57 7.2 6.3 10m 0.23

V59M 17m 0.5 9.8 5.2 7m 0.2

V59M 28m 0.39 9.2 5.8 14m 0.3

V59M ^{9a, 1m} 0.18 8.0 5.4 12m 0.39

R201C 22m 0.32 7.3 6.7 12m 0.12

R201H 6m 0.47 6.4 5.4 2m 0.2*

R201H 7m 0.37 7.9 4.9 4m 0.2

R201H 23m 0.16 7.1 5.5 1m 0.7*

V59M ^9a 0.55 7.7 5.8 6m 0.06

K170R ^{8a, 6m} 0.61 8.4 7.4 14m 0.21

Casi sporadici e non con insorgenza nei primi 6 mesi di vita:diagnosi ?

• Neonato che al terzo mese di vita esordisce con glicemia 500 mg/dl, chetoacidosi

• Peso alla nascita: 3.100 g

• Familiarità per diabete: un genitore con

diabete diagnosticato entro i primi due anni

di vita

M A L W M R L L P _L W L A L L A L G

P D P

A A

F V E N

H L C G S H L E A L Y L V C G E R _G

FFYTPKT

E R A

E D

L E V G Q

V E

L G G

G P

G A

G S

N C

Y N

L Q

R

E

Q C C T S I L Y Q

G R K Q

P L A L

L S

E G C A

V

I

V

S L E

1 2

3 4

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

23

24252627282930

COOH

NH2

s=s s=s

s=s

Signal peptide

B-chain

A-chain

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

5

43

2

1

Insulin precursor

P LH

PC-2

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WT (PRO)INSULIN

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R65C (PRO)INSULIN

Days from birth

0 50 100 150 200 250 300 350

C-peptide (ng/ml)

0 2 4 6 8

10 nd-PS/1 (R65C)

0,3 ng/ml

nd-PS/1: C-peptide values 70, 90, 150 and

350 days after discovery of hyperglycemia

Gli “old-days” della biochimica clinica nel controllo metabolico: la “soglia” renale

• I livelli plasmatici di glicemia raggiunti i quali si

“satura” il meccanismo di riassorbimento del glucosio a livello del tubulo renale: mediamente attorno a 180 mg/dl.

Rilevanza della HbA

come marcatore di rischio delle complicanze

microvascolari

• DCCT (T1D):

-35% del rischio di progressione della retinopatia diabetica ad ogni decremento del 10% (ad es. da 8 a 7.2%) della HbA_1c

• UKPDS (T2D):

-35% di rischio di progressione delle complicanze

microvascolari ogni decremento di 1

punto percentuale (ad es. da 9 a 8%) della HbA_1c

“Biotecnologia di ritorno”: l’uso della HbA1c a fini diagnostici (2009)

• HbA1c> 6.5%=diabete

• Vantaggi: modeste variazioni intraassay, nessuna necessità di digiuno, stabile a RT

• Svantaggi: risultati spuri in caso di condizioni

che influenzano la vita media dei globuli rossi.

La nefropatia diabetica

• Insorge nel 35-45% dei casi con T1D

• Insorge nel 20-35% dei casi con T2D

• 1^a causa di insufficienza renale e trattamento dialitico.

• Insorge solitamente dopo 15-20 anni di malattia, ma può essere più precoce.

• Se accertata nelle sue prime fasi, può regredire

• Marcatore precoce la “microalbuminuria”

Il ruolo della biochimica clinica nella valutazione della nefropatia diabetica.

1) L’aumento di escrezione urinaria di albumina (UAE) è un marcatore di alterazione microvascolare.

2) Una UAE aumentata è -a volte- presente nei pazienti con diabete tipo 2 alla diagnosi.

3) UAE > 20 g/min è un fattore di rischio di sviluppare una nefropatia diabetica clinicamente evidente.

4) UAE nei soggetti con diabete tipo 2 è un predittore

indipendente di aterosclerosi e mortalità cardiovascolare.

Microalbuminuria: definizione

• Valori compresi tra 30 e 300 mg/24 ore

• La terminologia NON si riferisce ad una isoforma particolare di albumina, ma al fatto che i livelli di UAE non sono rilevabili dai comuni metodi colorimetrici con “stick” (in grado di misurare concentrazioni >200 mg/L), pur essendo i valori al di sopra della norma (<30 mg/24 ore).

Microalbuminuria: quando, come.

• Nei soggetti con T1D a partire da 5 anni dalla

insorgenza della malattia. Controlli successivi con cadenza annuale.

• Nei soggetti con T2D alla diagnosi e successivamente con cadenza annuale.

• Metodi quantitativi:

• Dosaggio radioimmunologico. Sensibile e preciso.

• ELISA (“sandwich”).

Microalbuminuria: problemi

• La UAE aumenta con:

- l’esercizio fisico

- l’ipertensione arteriosa - la posizione eretta

- l’iperglicemia

- -> necessità di standardizzare la raccolta del campione.