Laurea in Medicina e Chirurgia
Anno accademico 2013-2014
Biochimica/biologia molecolare clinica e diabete
Prof. Fabrizio Barbetti
Biochimica/biologia molecolare clinica del diabete: obiettivi della lezione
• Fornire la definizione di diabete
• Ripercorrere i meccanismi di controllo della glicemia
• Descrivere la classificazione eziologica
• Descrivere il supporto del laboratorio alla diagnosi del
diabete e degli stati intermedi di alterato metabolismo del glucosio
• Descrivere il supporto del lab. all’inquadramento su base eziologica
• Descrivere il supporto del lab. al monitoraggio della terapia
• Descrivere il supporto del lab. al monitoraggio delle complicanze acute del diabete
• Descrivere il supporto del laboratorio al monitoraggio della
complicanze croniche del diabete
Definizione di diabete mellito
• “Un gruppo di disordini metabolici eterogenei dal punto di vista clinico e genetico caratterizzati da
elevati livelli ematici di GLUCOSIO”
• Nella classificazione corrente si distinguono due tipi principali di diabete:
• il tipo 1 (T1D, distruzione immuno-mediata delle cellule pancreatiche).
• il tipo 2 (T2D, conbinazione di “insulino resistenza”
e deficit insulinico risultanti sia da fattori genetici che ambientali).
• T1D + T2D: >95% dei casi
Il controllo fisiologico dei livelli ematici del glucosio
• Il glucosio ematico è regolato entro limiti stretti.
• Il controllo fisiologico della glicemia è -tra l’altro- finalizzato al
mantenimento di livelli minimi di glucosio durante la fase di digiuno notturna.
1 H-C=O
2 H-C-OH
3 OH-C-H
4 H-C-OH
5 H-C-OH
6 CH
2OH
D-Glucosio
Gluconeogenesi Glicogenolisi
Isola pancreatica
Insulina Glucagone
Somatostatina
FEGATO MUSCOLO
SCHELETRICO TESSUTO ADIPOSO
Glucosio
+ +
+
+
70 mg/dl 120
Glicemia
Gluconeogenesi Glicogenolisi
Isola pancreatica
Insulina Glucagone
Somatostatina
FEGATO MUSCOLO
SCHELETRICO TESSUTO ADIPOSO
Glucosio
+ +
+
+
400 mg/dl 600
Glicemia
2+
La “soglia” renale
• I livelli plasmatici di glicemia raggiunti i quali si “satura” il meccanismo di riassorbimento del glucosio a livello del tubulo renale:
mediamente attorno a 180 mg/dl.
• Primo dosaggio
affidabile della glicemia su sangue intero:
Folin-Wu (1920).
Primi inibitori della
glicolisi: 1931.
I primordi della biochimica clinica:
il “dosaggio” (!?!) della glicosuria nella diagnosi di diabete
• Diagnosi rara nell’ ‘800: su circa 48.000 ricoveri al Massachussets General Hospital tra il 1824-1898, solo in 172 casi (0,004%) venne emessa diagnosi di diabete.
Metodo analitico: far assaggiare
al medico interno le urine del paziente.
Dosaggio della glicemia: raccolta e conservazione del campione
• Il dosaggio del glucosio in laboratorio è effettuato su siero o plasma (il sangue intero è utilizzato nell’autocontrollo domiciliare e fornisce valori più bassi del 12-15%).
• Poiché la glicolisi diminuisce la concetrazione di
glucosio ad un tasso del 5-7%/h a temperatura
ambiente, si aggiungono al prelievo inibitori della
glicolisi come il sodio fluoruro (NaF), in grado di
stabilizzare i livelli di glucosio per almeno 3
giorni a temperatura ambiente ed un
anticoagulante (ossalato di potassio).
Diabete tipo 2: rilevanza della diagnosi
• T2D= circa 90% di tutti i casi. Insorge tipicamente
> 50 anni di età ed ha una elevata morbidità e costo sociale.
• L’aumento della prevalenza di T2D correla con l’aumento dell’obesità.
• 30-35% degli individui con T2D sono asintomatici ed inconsapevoli della malattia.
• L’iperglicemia asintomatica può precedere di molti anni (fino a 10) l’esordio clinico e correla con il
rischio cardiovascolare.
• Una significativa percentuale di pazienti con T2D (ca.
20% negli USA) presenta retinopatia diabetica alla
diagnosi .
Le lesioni della retinopatia diabetica sono uniche
La severità delle lesioni aumenta nel tempo
Le complicanze alla diagnosi come indicatore di malattia
silente: la retinopatia
• La retinopatia diabetica può essere presente alla diagnosi e correla con gli anni di malattia.
Estrapolando i dati è
evidente che il diabete
tipo 2 può essere
presente almeno 6.5
anni prima dei sintomi
clinici (e oltre !).
Diabete mellito: criteri
diagnostici ADA* e WHO §
• Criteri ADA*/WHO§
• Sintomi classici di diabete e un valore di glicemia venosa plasmatica
“casuale” =/> a 200 mg/dl (*, §).
• Glicemia a digiuno >126 mg/dl (per 2 volte) (*, §).
• Glicemia =/>200 mg/dl al tempo 120’ dell’OGTT (§, [*]).
• Categorie a rischio:
• IGT (alterata tolleranza al glucosio): coloro che
hanno una glicemia plasmatica a 120’
dell’OGTT >140 e <200 mg/dl (§, [*]).
• IFG (alterata glicemia a digiuno): coloro che hanno una glicemia a digiuno
>100** e <126 mg/dl (*).
** RIVISTO NEL 2003 (precedente >110)
Diabetes ():
“passare attraverso”
• 1964: il WHO
stabilisce/propone i
primi criteri diagnostici mediante il carico orale di “tolleranza” al
GLUCOSIO (OGTT).
• In Giappone:
“Shoukachi” ovvero malattia della sete.
• Primi del ‘900: test
di “tolleranza” al
RISO
Carico orale di glucosio (OGTT): modalità.
• OGTT “standard”: 75 g di glucosio
(disciolto) per os e prelievi al tempo 0’
ed ogni 30’ per 2 ore.
• Da effettuarsi solo se la glicemia a digiuno NON abbia già valore diagnostico.
• Casi speciali.
• Bambini < 40 Kg:
1.75g per Kg di peso
corporeo.
Il “caso speciale” per definizione:
il diabete gestazionale
• Screening del diabete gestazionale (USA)
“two steps”:
a)“minitest” (50 g), prelievi a 0’ e 60’.
b)se >140 mg/dl a 60’, OGTT con 100 g x 3 h.
• Screening “single step”:
• OGTT con 75 g
Problematiche del diabete in gravidanza
• Fetali
• 1° trimestre: malformazioni (aumento in %)
• 3° trimestre: macrosomia
• Nascita: IPOcalcemia, IPOmagnesemia, IPOglicemia
• Materne (pazienti con diabete tipo 1)
• Retinopatia ? -> Forse
• Nefropatia ? -> probabilmente NO
Criterio di scelta della glicemia a digiuno diagnostica di diabete da
parte degli esperti ADA
• Il valore di 126 mg/dl è stato scelto come
“equivalente” in
termini di sensibilità e specificità al valore di 200 mg/dl a 120’
dell’OGTT.
Uso o non uso dell’OGTT nella diagnosi
di diabete: conseguenze pratiche
Cambiamento di prevalenza: non solo un problema metodologico
• Boston, 1946. Campione:
circa 70.000 persone.
• USA 2000 (stima WHO):
17.700.000
• Messico 2000 (stima WHO): 2.179.000
• Italia 2000 (stima WHO):
4.252.000
• Prevalenza diabete: 0.52
%
• USA 2030 (stima WHO:
30.3120.000
• Messico 2030 (stima WHO): 6.130.000
• Italia 2030 (stima WHO):
5.374.000
Il diabete tipo 1
• Il T1D è una malattia autoimmune organo specifica caratterizzata dalla distruzione delle cellule beta pancreatiche mediata dai linfociti T.
• Esordisce tra l’infanzia e la pubertà, ma nessuna età è risparmiata.
• L’esordio clinico è spesso brusco, con forte
dimagramento, poliuria, iperglicemia elevata
accompagnata da chetosi.
Gli autoanticorpi circolanti confermano la diagnosi clinica
• Islet Cell Antibodies (ICA)
• Glutamic Acid Decarboxylase Antib. (GADA)
• Insulinoma-associated protein 2 Antib. (IA-2A)
• Insulin autoantibodies (IAA)
• ZnT8 autoantibodies (ZnT8A)
Ruolo degli autoanticorpi per la predizione del T1D
• Il dosaggio degli autoanticorpi nei
parenti di primo grado di soggetti con T1D combinato con la valutazione delle
secrezione insulinica è un valido predittore di insorgenza di T1D.
• Circa il 3-5% dei
pazienti clinicamente T1D sono negativi al dosaggio degli
autoanticorpi.
Elevata percentuale di malattia celiaca nei pazienti con T1D
• 6.8-8.3 % dei
pazienti con T1D hanno la malattia celiaca, confermata con biopsia
intestinale.
• Di questi, circa il 70% sono
sintomatici.
• IgA antiendomisio (EmA) o anti-TG2
• (sensib.>90%, spec.>95%
• Se IgA tot. <5 g/L->
IgG antigliadina
(AGA)
GENETICA del T1D e T2D
• Entrambe malattie poligeniche (nessun andamento di tipo mendeliano)
• Geni maggiori del T1D:
1) HLA; 2) VNTR del gene INS
• Geni maggiori del T2D:
polimorfismi del gene
TCF7L2, moltissimi altri
Glic.= 132
Età= 31 anni
“Scoperta”= 24 aa Terap.=Dieta
= Normale
= mutazione GCK
La famiglia “GCK/MODY 2”
Glicemia= 118 Età= 6 anni
Glicemia= 130 Età= 3 anni
Glic.= 143
Età= 65 anni
“Scoperta” = 39 aa
Terapia=Dieta
Complicanze=NO
Le mutazioni GCK/MODY 2 (1)
• Il gene della glucochinasi (GCK) è uno dei sette geni noti che causano un sottotipo monogenico di diabete mellito denominato MODY (Maturity Onset Diabetes of the
Young).
• Il MODY si definisce come una condizione
autosomica dominante in cui il diabete -non di
tipo 1- insorge prima dei 25 anni di età.
2 2
Le mutazioni GCK/MODY 2 (2)
• Le mutazioni della glucochinasi sono
relativamente frequenti quando ricercate in una casistica pediatrica.
• L’iperglicemia è modesta e NON progredisce nel tempo.
• La diagnosi molecolare derime i dubbi nei
famigliari del bambino portatore ed è utile per l’indirizzo terapeutico e della valutazione
delle complicanze.
Il diabete tipo 1: un esempio clinico .
• Bambino di 14 anni con recente perdita di peso, poliuria, polidipsia, alito acetonico
• Glicemia a digiuno: 318 mg/dl
• Chetoni nelle urine: presenti (Ketostix ++
+, semiquantitativo= 80-100 mg/dl)
• Diagnosi clinica: diabete tipo 1.
• E’ una diagnosi corretta ?
Il dosaggio degli autoanticorpi nel sospetto clinico di T1D in soggetti ad elevata
familiarità
• ICA
• Decarbossilasi
dell’acido glutamico (GAD 65 )
• Islet antigen 2 (IA-2)
• Insulina (IAA)
= Diabete mellito ad esordio precoce (<40 anni)
= Sospetto T1D Ab - probabile
MODY3/HNF 1
Ab + T1D
Mutazioni MODY 3/HNF-1: possibili meccanismi di iperglicemia
• Topo HNF-1 -/-.
Ridotta espressione genica nella cellula di:
• 1) Ins-1 (ma non Ins-2)
• 2) Glut 2, GK
• 3) Ipf-1/Pdx-1
• 4) NeuroD, HNF-4
Efficacia delle solfaniluree nei paz.
MODY 3
• Deterioramento della HbA1c->
10.3% dopo cambio per metformina
• Perdita di peso - 5.3kg
• Ripristinata
Glibenclamide 5mg
• HbA1c 5.3%
4 5 6 7 8 9 10 11
Years from Diagnosis SU stopped
M started
SU started M stopped
H b A 1 c %
Pearson et al. Diab Med 2000
Casi sporadici con insorgenza nei primi 6 mesi di vita:diagnosi ?
• Neonato che alla terza giornata di vita esordisce con glicemia 400 mg/dl,
chetoacidosi
• Peso alla nascita: 2.400 g
• Familiarità per diabete: nessuna
K
IR6.2
SUR1
K
+Glucose ATP/ADP
Ca
2+[Ca
2+]
iVDCC
K
ATPindependent or augmentation pathway
- prolonged 2
ndphase insulin release
K
ATPchannels and insulin secretion regulation
pulsatile
insulin release
_
+ +
K
ATPchannel activity
+
K
ATPdependent or triggering pathway
produce 1
stphase insulin release
KCOs
sulphonylureas
Ca
v2.3
Insulin weaning and transfer to SU in patients with KCNJ11 mutation
MUT Age at
“switch” Dose
mg/kg/d HbA1c TX: Ins
HbA1c TX: SU
Dur. TX SU
C-peptide nmol/L
R50P 10a, 6m 0.57 7.2 6.3 10m 0.23
V59M 17m 0.5 9.8 5.2 7m 0.2
V59M 28m 0.39 9.2 5.8 14m 0.3
V59M 9a, 1m 0.18 8.0 5.4 12m 0.39
R201C 22m 0.32 7.3 6.7 12m 0.12
R201H 6m 0.47 6.4 5.4 2m 0.2*
R201H 7m 0.37 7.9 4.9 4m 0.2
R201H 23m 0.16 7.1 5.5 1m 0.7*
V59M 9a 0.55 7.7 5.8 6m 0.06
K170R 8a, 6m 0.61 8.4 7.4 14m 0.21
mean 7.9 5.9
Tonini,…Barbetti, Diabetologia 2006
Casi PNDM da Mutazioni K ATP nella casistica italiana (Ottobre 2012)
• KCNJ11/Kir6.2= 26
• ABCC8/SUR1= 6
• Svezzati da insulina= 30 (93%) (di cui 3
adulti)
Casi sporadici e non con insorgenza nei primi 6 mesi di vita:diagnosi ?
• Neonato che al terzo mese di vita esordisce con glicemia 500 mg/dl, chetoacidosi
• Peso alla nascita: 3.100 g
• Familiarità per diabete: un genitore con
diabete diagnosticato entro i primi due anni
di vita
M A L W M R L L P L W L A L L A L G
P D P
A A
F V E N
H L C G S H L E A L Y L V C G E R G
F F Y T P K T
E R A
E D
L E V G Q
V E
L G G
G P
G A
G S
N C
Y N
L Q
R
E
Q C C T S I L Y Q
G R K Q
P L A L
L S
E G C A
V
I
V
S L E
1 2
3
45
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
23
24
25 26 27 28 29 30
C O O H
N H
2s=s s=s
s=s
Signal peptide
B -c ha in
C-peptide A-chain
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
54 3
2
1
Insulin precursor
C
PC-2
F V
EHN
L A E L
H S G C
L Y L V C G E R
GF F Y T P K T
N C Y N
R
R
E
Q
C C T S I L Y Q
G R K
P G G
AG
SL Q P
C V
I
V
S L E
1 2
43
5
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
2324 25 26 27 28 29 30
C O O H
s=s s=s
s=s
M A L W M R L L P
LW L A L L A
LG
P D P A A A
N H
2Peptide
segnale
C at en a B
G G
Q L A
L L
S E G
E A E D L E V G Q V E L
Peptide C
Catena A
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
54 3
2
1 Pre
PC-2
PC-1/3
(pro) Insulina
Days from birth
0 50 100 150 200 250 300 350
C-peptide (ng/ml)
0 2 4 6 8
10 nd-PS/1 (R65C)
0,3 ng/ml
nd-PS/1: valori di C-peptide a 70, 90, 150 e
350 giorni dopo la scoperta dell’iperglicemia
Insulina, IGF1 ed i loro recettori
Taniguchi et al. Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 85–96 (February 2006) | doi:10.1038/nrm1837