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Membri della famiglia Flaviviridae

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Academic year: 2021

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(1)

FLAVIVIRUS

(WEST NILE VIRUS, VIRUS DELLE ENCEFALITI DA ZECCHE)

BUNYAVIRUS (

TOSCANAVIRUS

)

Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia A.A. 2013-2014 Corso Integrato di Malattie Infettive e Microbiologia Clinica Prof. O.E. Varnier – Dott.ssa Martini Isabella

Università degli Studi di Genova

(2)

Reovirus

Calicivirus Norovirus

(3)

FLAVIVIRUS

(4)

Membri della famiglia Flaviviridae

(5)

Genere include > 70 virus; molti Arbovirus. (= trasmessi agli uomini da artropodi vettori) → termine deriva da classificazione “datata”: arthropod-borne viruses.

Causano una varietà di patologie incluse encefaliti e febbri emorragiche.

I virus più importani dal punto di vista clinico sono:

Dengue Virus (DENV) West Nile virus (WNV)

Japanese encephalitis virus (JEV) Yellow Fever Virus

Tropismo per monociti e macrofagi, piccoli vasi (cellule R.E.) e cellule SNC, fegato etc.

Ampio spettro d’ospite: in grado di infettare, oltre all’uomo, mammiferi selvatici e domestici e non-mammiferi (topi, uccelli, rettili, pipistrelli).

Diffusione in Italia: WNV in vasta zona pianura padana (Veneto-Emilia-Lombardia): animali da allevamento infetti e sporadici casi umani; TBEV nelle regioni del nord-est.

Moltiplicano in colture cellulari di ≠ specie animali e nelle uova embrionate di pollo.

Con antisieri policlonali classificati i membri del genere Flavivirus in 8 complessi antigenici (sierogruppi), corrispondenti a caratteristiche biologiche/ epidemiologiche.

Flavivirus – Caratteristiche e classificazione

(6)

Famiglia: Flaviviridae Generi: Flavivirus, Pestivirus, Hepacitivirus

Dimensioni: virione sferico con diametro ~50 nm;

Pericapside: Involucro fosfolipidico in cui espresse la proteina di membrana M (membrane) e la glicoproteina E (envelope).

Proteina E media legame del virus e la fusione; ha attività

emagglutinante e induce produzione Ab neutralizzanti.

Proteina M è un piccolo frammento proteolitico ottenuto da precursore prM durante la maturazione virale.

Capside: a simmetria icosaedrica;

formato da proteina C (capsidica).

Genoma: RNA lineare a singolo filamento a polarità+(11 kb)

Morfologia – Genus Flavivirus

(7)

Morfologia

Forma immatura: trimeri di proteine E e prM; prM copre parte che protrude.

Maturazione virale: proteolisi di prM che diventa proteina M mentre proteine E subiscono progressivo riarrangiamento fino ad assumere una configurazione di dimeri “head-to-tail” giacenti parallelamente a doppio strato fosfolipidico.

(8)

Morfologia -Genoma

Genoma: RNA singolo filamento a polarità + (ssRNA+); 11 kb.

Contiene singola ORF (Open Reading Frame) codificante per una poliproteina e fiancheggiato da due NCR (NonCoding Regions) che hanno un ruolo nel processo di traduzione del genoma.

CAP all'estremo 5’, non ha poly-A al 3' dove invece presenta una struttura a loop.

Estremità 3’: 8 Non-Structural proteins (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, 2K, NS4B, NS5)

Estremità 5’: 3 structural proteins (Capsid, prM, Envelope)

(9)

1

2

3b 3a

Replicazione - ssRNA+

(10)

E’ stato dimostrato che diverse molecole della superficie cellulare interagiscono con i flavivirus ma ad oggi sono stati caratterizzati solo alcuni R.

Flaviviruses possono utilizzare R multipli in differenti tipi di cellule ed in differenti specie ospiti:

Es. sembra che WNV utilizzi la molecola DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin) quale Recettore per infettare cellule dendritiche (antigen presenting cells del sistema immunitario).

Altre proteine sono state identificate come R dei flavivirus: αvβ3 integrin, GRP78 (BiP) e CD14.

Glicosaminoglicani solfatati (es. heparan sulfate) hanno dimostrato di rivestire un ruolo importante nell’attacco iniziale dei Flavivirus alle cellule target.

LA REPLICAZIONE VIRALE

(11)

A. Interazione con R cellulari e endocitosi → endosoma → compartimento endocitico pre-lisosomale (pH 5.5)

B. Basso PH induce fusione virus con membrana vescicola → rilascio del genoma virale.

Replicazione

C. Genoma è utilizzato come mRNA per la sintesi proteica.

Un sola grossa poliproteina viene tradotta dal genoma del virione.

Poliproteina scissa da proteasi (dell’ospite e virali) in singole

proteine virali strutturali e non strutturali, compresa la RdRp.

Alcune proteine strutturali restano nel citoplasma (proteina C) altre inserite

nella membrana del R.E. (glicoproteina prM, E)

(12)

Replicazione

D. RdRp produce filamento (−) dal genoma e lo replica in tanti RNA+ genomici virali (processo avviene in associazione a membrana perinucleare)

Proteine strutturali, nel citoplasma, formano capside in cui viene inserito il genoma.

E. Capside (immaturo) lega E.R. e gemma all’interno (gemmazione intracellulare).

acquisendo prM e E→ trasporto attraverso E.R. al Golgi.

F. Dal Golgi → vescicole

contenenti particelle virali verso membrana cellulare.

In questa fase abbiamo maturazione

del virus con clivaggio di prM , ad opera della proteina del Golgi, furina.

Clivaggio in: pr (rilasciata) + M (envelope).

G. Rilascio del virus maturo

(13)

Infezione dell’uomo attraverso puntura di un artropode infetto (zanzara, zecca) che acquisisce l’infezione cibandosi del sangue di un vertebrato viremico.

Perpetuarsi della trasmissione dei flavivirus è dipendente dal ciclo di amplificazione virale insetto vettore – ospite vertebrato che funziona da «serbatoio» (reservoir).

West Nile Virus/Virus dell’encefalite di St. Louis (encefaliti trasmesse da zanzare):

ospiti intermedi sono gli uccelli selvatici.

Le zanzare risultano infettate per tutta la vita, che dura da poche settimane ad alcuni mesi, in assenza di malattia, mentre gli animali domestici e l’uomo, che risulta essere

l’ospite occasionale, manifestano i segni clinici di un’encefalite fatale.

Patogenesi

(14)

Nelle encefaliti trasmesse da zecche, il virus (TBEV) viene trasferito ai successivi stadi di sviluppo durante la muta (trasmissione tra stadi) e può anche passare di generazione in generazione attraverso la via transovarica: in questo caso l’artropode e insieme serbatoio e vettore.

Il virus trasmesso dalle zecche infetta diversi animali, selvatici o domestici (roditori, caprioli, ovini, caprini) che contribuiscono al mantenimento del ciclo di trasmissione dell’infezione.

Gli uccelli, molto probabilmente, contribuiscono a trasportare

passivamente zecche infette anche a notevole distanza durante le loro migrazioni.

Patogenesi

(15)

I virus si moltiplicano nelle cellule epiteliali del tratto digerente dell’artropode → infettano le ghiandole salivari, dove si moltiplicano attivamente: infezione persistente in assenza di malattia.

Quando vettore punge l’ospite, rigurgita la saliva contenente i virioni, che si replicano nei tessuti locali (monociti e macrofagi) e successivamente, nei linfonodi regionali → circolo sanguigno → viremia primaria → moltiplicazione massiva nelle cellule del sistema reticolo-endoteliale → viremia secondaria → infezione organi bersaglio a seconda del tropismo tissutale (cervello, fegato, cute, miocardio, muscolatura scheletrica).

Virus induce necrosi cellulare che degenera in un’infiammazione e provoca febbre.

Patogenesi

(16)

Maggior parte delle infezioni decorre in modo asintomatico, dal momento che la risposta immunitaria umorale e cellulare e in grado di limitare il processo infettivo.

Occasionalmente l’infezione puo decorrere in una malattia sistemica grave.

Flavivirus piu comunemente responsabili di encefaliti sono:

West Nile Virus

Virus di St. Louis

Virus dell’encefalite giapponese

TBEV (Tick Borne Encephalitis Virus)

Patogenesi

capacità del virus di attraversare la barriera ematoencefalica

infiltrazione cellule mononucleate alle meningi, degenerazione neuronale

associata a fagocitosi

(17)

Risposta Immunitara

Aumento del titolo anticorpale è generalmente correlato ad un miglioramento del quadro sintomatologico.

Ab neutralizzanti sono sierotipo-specifici e persistono normalmente per molti anni dopo l’infezione.

Immunità cellulare e umorale alle reinfezioni è sierotipo-specifica e sembra

essere di lunga durata.

(18)

E possibile attuare una vaccino-profilassi nel caso del virus della febbre gialla.

Il vaccino e costituto dal ceppo attenuato 17D, coltivato in embrione di pollo

In grado di conferire un’immunita duratura in circa il 95% dei soggetti vaccinati, entro 10 giorni dall’inoculazione.

La vaccinazione è consigliata per i viaggiatori che si spostano in aree a elevata endemia.

Esiste la possibilità di effettuare una vaccino-profilassi contro la TBE.

Vaccino, da tempo in uso in molti Paesi dell’Europa centrale e settentrionale, utilizzato anche in Italia (dal 2006).

Ciclo vaccinale prevede la somministrazione di tre dosi (tempo 0, 1-3 mesi, 5-12 mesi) con richiami a cadenza triennale, per via intramuscolare → copertura del 96-100%.

Vaccinazione fortemente consigliata per le persone che, per motivi ludico-

ricreazionali (caccia, raccolta funghi, escursionismo) o lavorativi (guardie forestali), si recano in zone a rischio (nord-est Italia).

Vaccino profilassi

(19)

Sintomi clinici

Nella fase viremica (~ 3 gg dall’infezione): tecniche molecolari (PCR) o immunoenzimatiche (ELISA) per il rilevamento di Ag virali.

A ~ 1 settimana dall’infezione è possibile diagnosi sierologica mediante riscontro di Ab delle classi IgM o IgG con metodiche ELISA, inibizione dell’emoagglutinazione, neutralizzazione anticorpale.

ACCERTAMENTI MICROBIOLOGICI, DIAGNOSTICA

(20)

Isolamento possibile in adeguato substrato cellulare durante la fase acuta della malattia (fluido cerebrospinale, tessuti infetti, sangue).

Colture cellulari su varie linee: es. WNV può essere isolato su diverse linee cellulari di mammiferi ed in particolare su RK-13 (rabbit kidney), VERO (African green

monkey kidney), BHK (baby hamster Kidney), su cellule di zanzara, sulle quali non si evidenzia effetto citopatico, su uova embrionate di pollo.

Per virus potenzialmente responsabili di meningiti è possibile isolamento attraverso inoculazione intracerebrale in topi neonati → encefalite e morte.

Metodiche di complessa esecuzione e che necessitano di strutture laboratoristiche speciali: laboratorio livello di sicurezza biologica BSL3 o stabulario.

Utilizzate eventualmente nella prassi veterinaria delle zoonosi per isolamento ad es.

WNV da tessuto cerebrale per i cavalli (midollo spinale e cervello), cuore, cervello e intestino per i volatili e su pool di visceri (contenente cuore e cervello) per gli altri mammiferi.

ACCERTAMENTI MICROBIOLOGICI, DIAGNOSTICA

(21)

La diagnosi in casi di malattia neurologica acuta costituisce una problematica aperta: numerosi sono i virus potenzialmente responsabili di meningiti o

meningoencefaliti (Herpes, Coxackie, Phlebovirus, Flavivirus etc.) e in alcuni casi impossibile fare diagnosi differenziale → problema della cross-reattività dei test sierologici per la diagnosi dei virus trasmessi da artropodi quali i Flavivirus

(es. per TBEV (Encefalite da zecche) reazioni crociate con altri flavivirus, quali virus della febbre gialla, febbre Dengue, encefalite giapponese, nonché con i virus strettamente imparentati, Powassan, Louping ill, febbre emorragica di Omsk, Kyasanur Forest Disease e Alkhurma)

DIAGNOSI DIFFERENZIALE con PCR da fluido cerebrospinale, sangue (tecniche colturali difficilmente impiegate)

ACCERTAMENTI MICROBIOLOGICI, DIAGNOSTICA

(22)

A causa dell’assoluta aspecificità dei sintomi clinici, la diagnosi di infezione da WNV viene effettuata esclusivamente attraverso test di laboratorio

Elisa o Immunofluorescenza effettuati su siero e dove indicato, su fluido cerebrospinale, per la ricerca di Ab IgM-IgG.

IgM possono persistere per periodi anche molto lunghi (fino a un anno), pertanto la positività ai test può indicare anche un’infezione pregressa.

I campioni raccolti entro 8 giorni dall’insorgenza dei sintomi potrebbero risultare negativi, pertanto è consigliabile ripetere a distanza di tempo il test di laboratorio prima di escludere la malattia.

In alternativa (o in parallelo): diagnosi con PCR su campioni di siero e CSF.

L’isolamento virale è riservato a strutture laboratoristiche specialistiche.

DIAGNOSTICA- West Nile Virus

(23)

BUNYAVIRUS

(24)

Membri della famiglia Bunyavirus

1

2 3

4

(25)

Nome da Bunyamwera (Uganda) dove, dalle zanzare, è stato isolato il primo virus.

La maggior parte sono arbovirus (arthropod-borne viruses) essendo prevalentemente diffusi tramite artropodi (zanzare, zecche, flebotomi).

Fanno eccezione gli hantavirus - robovirus (rodent borne virus) – che infettano solo i mammiferi e sono diffusi tramite le urine e le feci di roditori.

Caratteristiche strutturali/biochimiche e analisi filogenetica hanno consentito suddivisione in 4 generi principali di interesse medico, suddivisi in 35 sierogruppi con oltre 330 tipi e sottotipi.

Phlebovirus comprendono circa 37 specie, raggruppate in 9 sierotipi

Virioni sono sensibili al trattamento con detergenti, formaldeide e calore.

Moltiplicano in colture cellulari di ≠ specie animali (vertebrati e invertebrati). In particolare in un’ampia varietà di linee cellulari d’origine renale, incluse le cellule Vero e in cellule macrofagiche di topo, dove sono in grado di produrre un evidente effetto citopatico (altrimenti infezione evidenziata con immunofluorescenza).

Bunyavirus – Caratteristiche e classificazione

(26)

Infettano uomo e vertebrati in genere (esiste anche 5° genere Bunyavirus delle piante).

Tropismo per endotelio vascolare, SNC, fegato, rene, polmoni.

Diffusione in Italia: Toscana Virus isolato per la prima volta nel 1971 all’Argentario (Grosseto).

Successivamente riscontrato in Piemonte, Emilia Romagna, Marche, Umbria, Lazio, Campania, Sardegna.

(sieroprevalenza 22% nell’Italia Centrale).

Bunyavirus – Caratteristiche e classificazione

(27)

Famiglia: Bunyavirus Generi: Bunyavirus, Nairovirus, Phlebovirus, Hantavirus

Dimensioni: virione sferico con diametro ~ 80-120 nm;

Pericapside: involucro fosfolipidico, espresse 2 glicoproteine virus specifiche (G1/G2)

Formano proiezioni superficiali

Bersaglio Ab neutralizzanti

Capacità emoagglutinanti

Responsabili dello spettro d’ospite e del tropismo di tessuto (legame con cellula ospite e fusione)

Non contiene proteine di matrice

Nucleocapside elicoidale

3 segmenti di RNA a singola elica

2 proteine: proteina nucleocapsidica (N) RNA-polimerasi (L).

Morfologia – Bunyavirus

(28)

Morfologia - Genoma

RNA singolo filamento polarità negativa (ssRNA-), 11-12 kb totali, segmentato in 3 parti.

Segmento L (grande): codifica per la proteina L (RNA polimerasi-RNA dipendente).

Segmento M (medio): codifica per le proteine superficiali G1 e G2.

Segmento S (piccolo): codifica per la proteina nucleocapsidica N.

(29)

Replicazione – ssRNA-

(30)

1. Interazione G1 con R cellulari e endocitosi R mediata→ endosoma 2. Endosoma a compartimento

endocitico pre-lisosomale (pH 5.5) Basso PH induce fusione virus con membrana vescicola →

rilascio del genoma virale nel citoplasma (uncoating).

Replicazione

3. RNA genomico è trascritto in mRNA dalla polimerasi virale (RdRp).

4. Traduzione degli mRNA e sintesi delle proteine virali:

glicoproteine (G1 e G2) glicosilate nel Golgi ed espresse in membrana Golgi/membrana citoplasmatica.

(31)

Replicazione

5. Replicazione citoplasmatica dell’RNA genomico (ssRNA-) attraverso la produzione di un intermedio di RNA

complementare a polarità positiva ssRNA+ (cRNA).

Assemblaggio della proteina N virale con genoma virale

neoformato (ssRNA+) → nucleocapside

→ trasporto al Golgi

→ trasporto a membrana citoplasmatica

2 Vie

(32)

Replicazione

6.Formazione particelle virali mature

(nucleocapside + proteine dell’envelope)

→ gemmazione intracellulare nel Golgi.

Successiva fuoriuscita dal Golgi di

vescicole intracitoplasmatiche, contenenti virione maturo, che, si fondono con

membrana cellulare (esocitosi) rilasciando all’esterno il virus (7).

In alternativa: liberazione dei virioni tramite lisi cellulare

→ in alcuni casi il nucleocapside è

trasportato nei pressi della membrana plasmatica → rilascio del virus (7) per gemmazione attraverso membrana

cellulare con acquisizione dell’envelope.

(33)

Bunyavirus, con l’eccezione degli hantavirus, si replicano negli artropodi.

Persistenza in natura è legata alla possibilità di instaurare un ciclo artropode vettore (zanzara, zecca o flebotomo) – ospite vertebrato [generalmente un piccolo mammifero (roditori), ma anche uccelli] che diventa quindi il serbatoio del virus.

Nell’artropode: infezione persistente in assenza di malattia.

Alcuni bunyavirus (es. virus della febbre da flebotomi, presente in Italia, tipo napoletano o tipo siciliano), sono trasmessi per via transovarica: in questo caso l’artropode e insieme serbatoio e vettore.

Nel ciclo naturale l’uomo si ammala quando è punto da un artropode infetto, ma il sangue umano raramente può infettare l’artropode, cosicché l’uomo rappresenta l’ospite terminale.

Patogenesi

(34)

Virus moltiplicano in

cellule epiteliali

del tratto digerente dell’artropode → infettano

ghiandole salivari

e moltiplicano.

Quando vettore punge l’ospite, rigurgita la saliva contenente i virioni → saliva infetta penetra nei capillari e nei vasi linfatici.

Endotelio vascolare della cute e i linfonodi regionali rappresentano quindi il sito primario di replicazione del virus → circolo sanguigno →

viremia

Al termine della viremia, con comparsa Ab, ospite va incontro a guarigione.

Infezione è generalmente

asintomatica, a meno che non sia stato infettato uno

specifico organo (endotelio vascolare, fegato, encefalo, reni, polmoni)→

nell’uomo manifestazioni patologiche caratteristiche del virus infettante.

Patogenesi

(35)

Il danno è prevalentemente attribuibile alla diretta invasione dei tessuti da parte del virus, piuttosto che a una reazione infiammatoria mediata dall’ospite.

La

risposta iniziale

all’infezione da bunyavirus consiste nella produzione di

interferone

(IFN).

La scomparsa del virus nel sangue si accompagna alla comparsa di

anticorpi.

IFN, unitamente all’immunità umorale, svolge un ruolo protettivo sull’andamento dell’infezione.

Patogenesi

(36)

Virus della valle del Rift (Phlebovirus), sono stati allestiti vaccini per uso umano preparati con virus inattivati con formalina.

Questi vaccini non sono ancora ottimali, poiché sono necessari diversi richiami per ottenere un’adeguata risposta anticorpale.

Per la febbre emorragica con sindrome renale (Hantavirus) sono stati utilizzati diversi tipi di vaccini inattivati nei confronti dei virus Hantaan e Seoul e numerosi vaccini

ricombinanti sono attualmente allo studio.

In assenza di vaccini efficaci in commercio, la prevenzione verso l’infezione da bunyavirus (esclusi gli hantavirus) consiste nell’evitare il contatto tra l’uomo e l’artropode vettore (repellenti, insetticidi, vestiti protettivi, zanzariere, tende).

Per quanto riguarda la prevenzione dell’infezione da hantavirus deve essere effettuata principalmente con il controllo dei roditori.

Vaccino profilassi

(37)

Diagnosi sierologica mediante riscontro di Ab delle classi IgM o IgG con metodiche ELISA e immunofluorescenza indiretta (test inibizione dell’emoagglutinazione e fissazione complemento ormai poco impiegati).

Presenza IgM nei sieri di pazienti in fase acuta deve essere confermta da IgG in prelievo effettuato dopo circa 2 settimane.

Nella fase viremica possibile applicare tecniche immunoenzimatiche (ELISA) per il rilevamento di Ag virali o indagini molecolari (RT-PCR) per l’amplificazione di sequenze specifiche.

Nel caso di virus neurotropi: DIAGNOSI DIFFERENZIALE con PCR da fluido cerebrospinale (CSF).

Disponibilità di colture cellulari permissive per isolamento ma applicazione in strutture laboratoristiche specialistiche.

Per alcuni virus particolarmente pericolosi si rende indispensabile la disponibilità di un laboratorio autorizzato al trattamento di agenti infettanti di classe 3 (es. Febbre della Valle del Rift) e 4 (Virus della febbre emorragica di Crimea/Congo).

ACCERTAMENTI MICROBIOLOGICI, DIAGNOSTICA

(38)

*USUV= Usutu virus, famiglia Flaviviridae, genere

Flavivirus, trasmesso da zanzare). Incluso nel gruppo del Japanese encephalitis virus (JEV) ed è strettamente correlato a WNV.

*

Centro Riferimento Regionale Emergenze Microbiologiche

(39)

FLAVUVIRUS

(WEST NILE VIRUS, VIRUS DELLE ENCEFALITI DA ZECCHE)

BUNYAVIRUS (

TOSCANAVIRUS

)

Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia A.A. 2013-2014 Corso Integrato di Malattie Infettive e Microbiologia Clinica Prof. O.E. Varnier – Dott.ssa Martini Isabella

Università degli Studi di Genova

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