FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
DOMANTAS BALČAITIS
1,4 – NAFTOCHINONO DARINIŲ POVEIKIO GLIOBLASTOMOS
LĄSTELĖSE ESANČIŲ MITOCHONDRIJŲ DEGUONIES
SUVARTOJIMUI TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė: Prof. dr. Daiva Majienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data:
1,4 – NAFTOCHINONO DARINIŲ POVEIKIO GLIOBLASTOMOS
LĄSTELĖSE ESANČIŲ MITOCHONDRIJŲ DEGUONIES
SUVARTOJIMUI TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Prof. dr. Daiva Majienė
Data Darbą atliko: Magistrantas Domantas Balčaitis Data Recenzentas ... Data KAUNAS, 2017
Padėka
Pirmiausia norėčiau padėkoti savo darbo vadovei, prof. dr. Daivai Majienei už pagalbą, patarimus bei kantrybę. Be darbo vadovės pagalbos, šis magistrinis darbas būtų beveik neįmanomas.
Turinys
Įvadas ... 10
Darbo tikslas ... 10
1. Literatūros apžvalga ... 12
1.1 Mitochondrijos ... 12
1.2. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksai ... 13
1.3. Mitochondrijų ROS gamyba ... 14
1.4. Mitochondrijos vėžinėse ląstelėse ... 16
1.5. Varburgo efektas ... 16 1.6. Glioblastomos ląstelės ... 17 1.7. Naftochinonai ... 19 1.8. Plumbaginas ... 20 1.9. Menadionas ... 21 1.10. Lavsonas ... 22 1.11. Juglonas ... 23 2. Metodai ir medžiagos ... 24
2.1. Naudotos medžiagos ir aparatūra ... 24
2.1.1. Naudotos medžiagos ... 24
2.1.2. Naudota aparatūra ... 25
2.2. Ląstelių kultivavimo metodas ... 25
2.3. Ląstelių tankio nustatymas ... 25
2.4. Mitochondrijų kvėpavimo greičio nustatymas ... 26
2.5. Statistinis duomenų apdorojimas ... 27
3. Darbo rezultatai ir aptarimas ... 28
3.1. Mitochondrijų esančių C6 ląstelėse tyrimas ... 28
3.2. Juglono poveikis C6 gliomos ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičiams ... 28
3.4. Plumbagino poveikis C6 gliomos ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičiams ... 32
3.5. Menadiono poveikis C6 gliomos ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičiams ... 34
Rezultatų aptarimas ... 36
Išvados ... 38
Praktinės rekomendacijos ... 39
Santrauka
1,4 –NAFTOCHINONO DARINIŲ POVEIKIO GLIOBLASTOMOS LĄSTELĖSE ESANČIŲ MITOCHONDRIJŲ DEGUONIES SUVARTOJIMUI TYRIMAS
D. Balčaičio magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė prof. dr. D. Majienė;
Lietuvos Sveikatos Mokslų Universiteto Farmacijos fakulteto Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra. – Kaunas
Raktiniai žodžiai: 1,4-naftochinonai, juglonas, lavsonas, menadionas, plumbaginas, C6 ląstelių kultūra. Tyrimo tikslas – ištirti ir palyginti įvairių koncentracijų 1,4-naftochinonų darinių (lavsono, plumbagino, menadiono, juglono) poveikį C6 ląstelėse esančių mitochondrijų kvėpavimo aktyvumui.
Metodai: Eksperimentams buvo naudojama C6 ląstelių kultūra. Ląstelių auginimas, paruošimas eksperimentams, ląstelių tankio skaičiavimas buvo atliekamas pagal ląstelių kultivavimo metodiką. Ląstelėse esančių mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo registruotas naudojant oksigrafinę sistemą Oxygraph-2k.
Tyrimo uždaviniai:
1. Ištirti ir palyginti įvairių lavsono koncentracijų poveikį C6 ląstelėse esančių mitochondrijų kvėpavimo greičiams.
2. Ištirti ir palyginti įvairių plumbagino koncentracijų poveikį C6 ląstelėse esančių mitochondrijų kvėpavimo greičiams.
3. Ištirti ir palyginti įvairių menadiono koncentracijų poveikį C6 ląstelėse esančių mitochondrijų kvėpavimo greičiams.
4. Ištirti ir palyginti įvairių juglono koncentracijų poveikį C6 ląstelėse esančių mitochondrijų kvėpavimo greičiams.
Tyrimų rezultatai:. Tiriant jugloną, nustatyta, jog 0,5-5,5 µM koncentracijos padidina substratais stimuliuotą mitochondrijų kvėpavimo greitį (VL). Didesnės juglono koncentracijos atskiria
mitochondrijų oksidacijos bei fosforilinimo procesus. Lavsonas, naudojamas 10-195 µM koncentracijomis, didina ir VL ir VADP, tačiau pilnai oksidacijos ir fosforilinimo procesų neatskiria.
Tiriant plumbaginą, nustatyta, jog 0,5-3,5 µM koncentracijos padidina substratais stimuliuotą mitochondrijų kvėpavimo greitį 119-223 %. 1 µM plumbagino koncentracija veikiant į VADP
maksimaliai atskiria fosforilinimą ir oksidaciją. Tiriant menadioną buvo nustatyta, kad 0,5-5,5 µM koncentracijos padidina substratais stimuliuotą mitochondrijų kvėpavimo greitį 31-150 %. Didesnės koncentaracijos menadiono visiškai atskiria oksidaciją bei fosforilinimą. Tuo tarpu veikiant į VADP, 2
Išvados: 1,4-naftochinonai (lavsonas, plumbaginas, menadionas, juglonas) priklausomai nuo koncentracijos veikia mitochondrijų kvėpavimo aktyvumą C6 ląstelėse. Silpniausiai kvėpavimo greitį įtakojo lavsonas, kadangi jis neturėjo didelės įtakos nei į VL, nei į VADP. Didžiausias poveikis į
Summary
THE INVESTIGATION OF DERIVATIVES OF 1,4-NAPHTHOQUINONE EFFECTS TO MITOCHONDRIAL OXYGEN CONSUMPTION IN GLIOBLASTOMA CELLS
D. Balčaičio master thesis/ Scientific supervisor prof. dr. D. Majienė
Lithuanian University of Health Sciences Pharmacy Faculty, Department of Drug Technology and Social Pharmacy.– Kaunas
Key words: 1,4-napthoquinones, juglone, lawsone, menadione, plumbagin, C6 cell culture.
The aim of research – to investigate and compare the effects of different concentrations of 1,4-naphthoquinones (lawsone, plumbagin, menadione, juglone) on rat glioblastoma cell culture and assess their mitochondrial oxygen consumption.
Methods: C6 cell culture was used for experiments. Cell breeding, preparation, density calculation was exexuted by the methods of cell cultivation. Mitochondrial respiration rate was registered using oxygraphic system Oxygraph-2k.
Goals of the study:
1. To investigate and compare the effect of different concentrations of lawsone on C6 cell culture and assess mitochondrial respiration rate.
2. To investigate and compare the effect of different concentrations of plumbagin on C6 cell culture and assess mitochondrial respiration rate.
3. To investigate and compare the effect of different concentrations of menadione on C6 cell culture and assess mitochondrial respiration rate.
4. To investigate and compare the effect of different concentrations of juglone on C6 cell culture and assess mitochondrial respiration rate.
Results: Our results have shown that 0,5-5,5 µM concentrations of juglone increases VL. Higher
concentrations of juglone separates oxidation and phosphorylation in mitochondria. Lawsone, used in 10-195 µM concentrations, increases both VL and VADP, but does not fully separate oxidation and
phosphorylation. Results have shown that concentrations between 0,5 to 3,5 µM of plumbagin increases VL by 119-223 %. 1 µM concentration of plumbagin, used in ox-phos capacity, fully separates the
processes in mitochondria. Concentrations of menadione (0,5-5,5 µM) increases VL by 31-150 %.
Higher concentrations fully separates oxidation and phosphorylation. 2 µM of menadione also separates the processes when used in ox-phos capacity.
Conclusions: 1,4-naphthoquinones (lawsone, plumbagin, menadione, juglone) have different approach to mitochondrial respiration rate and it all depends on concentrations. The weakest effect has lawsone because it does not have big effect on VL and ox-phos capacity. The biggest effect is made by plumbagin.
Santrumpos
ADP – adenozin 5‘ difosfatas ATP – adenozin 5‘ trifosfatas C6 – žiurkių ląstelių linija CoQ – kofermentas Q
DMN – 2,4-dimetoksi-2-metilnaftalenas DNR - deoksiribonukleorūgštis
FAD - flavinadenindinukleotidas
FADH2 – redukuotas flavinadenindinukleotidas
FMNH – redukuotas flavinmononukleotidas mtDNR – mitochondrinė deoksiribonukleorūgštis
NADH – redukuotas nikotinamido adenino dinukleotidas PDH – piruvato dehidrogenazė
ROS – reaktyviosios deguonies formos (angl. Reactive oxygen species) SDHB – sukcinato dehidrogenazės geležies-sieros kompleksas
SDHC – sukcinato dehidrogenazės kompleksas C SDHD – sukcinato dehidrogenazės kompleksas D VADP – oksidacinio fosforilinimo greitis mitochondrijose
VL – substratais stimuliuotas mitochondrijų kvėpavimo greitis
Įvadas
Viena iš pagrindinių visuomenės sveikatos problemų šiuo metu yra vėžinės ligos bei susirgimai, kurie užima pirmąsias vietas pasaulyje pagal mirčių skaičių. Šis skaičius pasaulyje vis didėja, todėl yra gana aktualu tirti junginius pasižyminčius citotoksiniu aktyvumu, išsiaiškinant jų savybes ir jas pritaikant efektyvesniems bei saugesniems gydymo būdams.
Multiforminė glioblastoma – tai viena iš labiausiai paplitusių navikų formų, kuri yra labai pavojinga bei yra greičiausiai progresuojanti. Multiforminė glioblastoma pasižymi agresyvia proliferacija, vaskuliarizacija, tačiau didžiausias dėmesys yra skiriamas imunosupresijai. Kadangi multiforminė glioblastoma yra atspari net radioterapijai ir chemoterapijai, yra bandoma sumažinti vėžinių ląstelių proliferaciją bei surasti naują gydymo būdą, kuris būtų saugus bei efektyvus.
Šiuo metu yra ieškoma priešvėžiniu aktyvumu pasižyminčių medžiagų. Vieni aktyviausių darinių, kurie pasižymi ne tik priešvėžiniu, bet ir antimikrobiniu, antigrybeliniu bei antivirusiniu poveikiu yra 1,4 – naftochinonai. Šie junginiai jau nuo seno buvo naudojami kitų šalių tradicinėje medicinoje ir jie yra natūraliai paplitę antriniai metabolitai, kurie randami augaluose.
Nustatyta, jog naftochinonai gali prisijungti prie DNR, slopinti replikaciją bei taipogi sąveikauti su membranų komponentais ir sukelti įvairias ląstelių pažaidas. Pagrindinis tiriamas naftochinonų poveikis yra tai, jog jie labai sąveikauja su mitochondrijų grandinės ląstelės komponentais ir keičia kvėpavimo grandinės aktyvumą.
LSMU Neuromokslų Institute jau eilę metų tiriamas 1,4 – naftochinono darinių (juglono, plumbagino, lavsono, menadiono) poveikis ir jau nustatyta, kad šie junginiai pasižymi ląstelių gyvybingumą mažinančiu poveikiu, bet dar nėra detaliai ištirtas jų veikimo mechanizmas. Šiame darbe siekiama tirti 1,4 – naftochinonų poveikį C6 glioblastomos ląstelėms ir nustatyti, ar jų gyvybingumą mažinantis efektas yra susijęs su deguonies suvartojimo ląstelėse pokyčiais.
Darbo tikslas
Ištirti ir palyginti įvairių koncentracijų 1,4-naftochinono darinių (lavsono, plumbagino, menadiono, juglono) poveikį C6 ląstelėse esančių mitochondrijų kvėpavimo aktyvumui.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti ir palyginti įvairių lavsono koncentracijų poveikį C6 ląstelėse esančių mitochondrijų kvėpavimo greičiams.
2. Ištirti ir palyginti įvairių plumbagino koncentracijų C6 ląstelėse esančių mitochondrijų kvėpavimo greičiams.
3. Ištirti ir palyginti įvairių menadiono koncentracijų poveikį C6 ląstelėse esančių mitochondrijų kvėpavimo greičiams.
4. Ištirti ir palyginti įvairių juglono koncentracijų poveikį C6 ląstelėse esančių mitochondrijų kvėpavimo greičiams.
1. Literatūros apžvalga
1.1 Mitochondrijos
Mitochondrijos yra apie 1 mm skersmens bei iki 6 mm ilgio organelės. Jos randamos visuose eukariotiniuose organizmuose ir jų skaičius priklauso nuo audinio. Tuose audiniuose, kurie atlieka didelės apkrovos aerobines funkcijas, bus didesnis mitochondrijų skaičius.[1]
Mitochondrijos yra sudarytos iš dviejų membranų, kur kiekviena – iš fosfolipidų dvisluoksnio. Membranos skiriasi savo forma bei savybėmis, todėl atlieka skirtingas biologines funckijas.[2]
1 pav. Mitochondrijos vidinė sandara
Mitochondrijos yra ląstelės gyvybės komponentas, kurio pagrindinė užduotis yra dalyvauti energijos metabolizme. Dalis energijos gautos iš substratų oksidacijos metu, yra paverčiama į ATP mitochondrijų ląstelėse. Šis procesas yra labai priklausomas nuo deguonies. Kuomet deguonies kiekis yra ribotas, glikolizės produktai yra tiesiogiai metabolizuojami citozolyje anaerobinio kvėpavimo, kuris yra mažiau efektyvus ir nepriklausomas.[3]
Mitochondrinė ATP gamyba yra vykdoma per elektronų transporto grandinę, kuri yra sudaryta iš keturių kvėpavimo grandinės kompleksų.[4] NADH ir FADH2, kurie susidaro glikolizės
metu, taip pat riebiųjų rūgščių oksidacija bei citrinos rūgšties ciklas yra procesai, kurių metu susidaro didelis kiekis energijos ir jie gali atiduoti elektronus elektronų transporto grandinei. Elektronai juda link tų komponentų, kurie turi teigiamą oksidacinį potencialą bei gali išlaisvinti energiją elektronų perdavimo stadijoje, kurios metu protonai yra pompuojami į tarpmembraninę erdvę.[4]
Kvėpavimo grandinės I, III bei IV kompleksai funkcionuoja kaip H+ pompos, kurios
tarpmemnraninę erdvę ir taip yra sukuriamas 150-180 mV potencialas. Protonų gradientas generuoja chemiostatinį potencialą, kuris dar gali būti vadinamas protonų varomąja jėga.[5]
Mitochondrijų kvėpavimo dažnis priklauso nuo potencialo, kuris yra išreiškiamas ATP/ADP santykiu. Jis susidaro vidinėje mitochondrijų membranoje ir yra reguliuojamas adenino nukleotido translokazės. Padidėjus ląstelės energijos poveikiui ir kai potencialas yra sumažėjęs bei yra laisvos ADP, kvėpavimo dažnis padidėja ir pradedama ATP sintezė.[6]
Polifenoliai yra gana plataus panaudojimo. Jie gali neutralizuoti laisvuosius radikalus, slopinti mitochondrijų kvėpavimo kompleksą I bei slopinti ROS susidarymą. Taipogi, polifenoliai pasižymi ir antivėžinėmis, antioksidacinėmis, antibakterinėmis bei priešuždegiminėmis savybėmis.[7] Kadangi, flavonoidai pasižymi antioksidacinėmis savybėmis, galima juos apibūdinti kaip biologiškai aktyvius junginius, kurie apsaugo ląsteles nuo oksidacinio streso. Šis poveikis yra svarbus, nes laisvieji radikalai bei lipidų peroksidacija yra vieni iš vėžio atsiradimo priežasčių. In vitro tyrimų metu, buvo tiriami flavonoidai (kvercetinas, hiperozidas, kvercitrinas, rutinas) ir stebimas jų poveikis oksidaciniam fosforilinimui mitochondrijose. Nustatyta, jog esant labai mažoms koncentracijoms (iki 1,1 ng/ml), flavonoidai neturi visiškai jokios įtakos VADP greičiui.[8] Nustayta, jog didžiausią poveikį mitochondrijų
oksidacijos ir fosforilinimo procesų atskyrimui turi kvercetinas, o mažiausią – kvercitrinas.[8]
Tiriant naftochinonų poveikį mitochondrijų kvėpavimui, buvo atlikti tyrimai, kurių metu nustatyta, jog juglonas generuoja ROS veikdamas į pirmąjį mitochondrijų kvėpavimo kompleksą C6 ląstelėse, tuo pačiu sužadindamas antivėžinius efektus. Taip pat nustatyta, jog juglonas sumažina deguonies sunaudojimą veikdamas į piruvato/malato bei glutamato/malato sukeltą mitochondrijų kvėpavimą.[9]
Kitų naftochinonų (lavsono, plumbagino bei menadiono) tyrimai, kurie būtų nukreipti į mitochondrijų kvėpavimo stimuliavimą ar ROS generaciją beveik nėra, todėl šis darbas naujas bei aktualus.
1.2. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksai
Kompleksas I
Pirmajame komplekse (NADH ubichinono oksidoreduktazė, NADH-CoQ reduktazė arba NADH dehidrogenazė) du elektronai yra pašalinami iš NADH ir perkeliami į ubichinoną. Redukuotas produktas, ubichinolis, laisvai difunduoja pro membranas ir pirmas kompleksas perneša keturis protonus. Pirmasis kompleksas yra viena iš pagrindinių vietų, kurioje susidaro superoksidai.[10]
NADH yra oksiduojmas iki NAD+, redukuojant flavin mononukleotidą į FMNH. FMNH tuomet yra oksiduojamas dvejais vieno elektrono žingsniais per semichinono tarpininką. Kiekvienas
elektronas transformuoja FMNH į Fe-S kompleksą, o Fe-S kompleksą į ubichinoną. Vykstant pirmajam žingsniui, elektronas sukuria laisvąjį radikalą semichinoną, kuris suformuoja ubichinoną. Vykstant šiam procesui, keturi protonai yra pernešami iš mitochondrijų matrikso į transmembraninę ertmę.[9]
NAD+ + 2e- + H+ → NADH; E0 = -0,315 V
Kompleksas II
Antrajame komplekse (sukcinato dehidrogenazė arba sukcinato-CoQ reduktazė) papildomi elektronai, gauti iš sukcinato bei perduoti per flavinadenindinukleotidą (FAD), yra pristatomi į ubichinoną. Antrasis kompleksas yra sudarytas iš keturių dalių: sukcinato dehidrogenazės, sukcinato dehidrogenazės geležies-sieros komplekso (SDHB), sukcinato dehidrogenazės komplekso C (SDHC) bei sukcinato dehidrogenazės komplekso D (SDHD). Kiti elektronų donorai (riebiosios rūgštys, glicerolio-3-fosfatas) taip pat duoda elektronus ubichinonui, kurie transportuojami per flavinadenindinukleotidą. Antrasis kompleksas yra labai panašus į pirmąjį, tačiau šiame komplekse, jokie protonai nėra transportuojami į tarpmembraninę ertmę.[10]
Kompleksas III
Trečiajame komplekse (citochromo bc kompleksas arba CoQH-citochromo c reduktazė) ubichinono ciklas padeda protonų gradientui absorbuoti/išlaisvinti protonus. Du elektronai yra pašalinami iš ubichinolio ir nuosekliai perduodami dvejoms citochromo c molekulėms, kurios yra elektronų transporteris tarpmembraninėje ertmėje. Kiti du elektronai redukuoja ubichinoną į chinolį.
QH2 + 2 citochromas c (FeIII) + 2 H+ → Q + 2 citochromas c (FeII) + 4 H+
Kuomet elektronų perdavimas yra sumažėjęs, trečiame komplekse gali trūkti elektronų molekuliniam deguoniui, todėl pradeda susidaryti superoksidai.[9]
Kompleksas IV
Ketvirtajame komplekse (citochromo c oksidazė) keturi elektronai yra pašalinami iš keturių citochromo c molekulių ir perduodami molekuliniam deguoniui, susidarant dviems vandens molekulėms. Tuo pat metu, aštuoni protonai yra pašalinami iš mitochondrijų matrikso, veikiant protonų gradientui. Citochromo c oksidazės aktyvumas yra inhibuojamas su cianidu.[10]
Bendroji elektronų transporto grandinės schema:
NADH+H+ → Kompleksas I → Kompleksas II (sukcinatas) → Komplekas III → Citochromas C → Komplekas IV
1.3. Mitochondrijų ROS gamyba
Reaktyvių deguonies formų gamyba žinduolių mitochondrijose yra svarbi, kadangi ROS yra grindžiama patologinių būklių susidarymu, kur labiausiai dominuoja oksidacinio streso atsiradimas.
Superoksido anijonas yra proksimalinis mitochondrijų ROS produktas, kuris susidaro tuomet, kai mitochondrija negamina ATP, todėl susidaro didelis protonų varomosios jėgos skirtumas.[9] Taip pat gali susidaryti ir tuomet, kai yra didelis NADH/NAD+ santykis mitochondrijų matrikse. Tose mitochondrijose, kurios nuolatos gamina ATP bei turi mažesnį protonų varomosios jėgos skirtumą bei NADH/NAD+ santykį, superoksido anijonų jose susidaro žymiai mažiau.[11]
2 pav. Mitochondrijų ROS gamybos schema [11]
ROS gamyba mitochondrijose sukelia oksidacinį stresą, kuris pažeidžia mitochondrijų proteinus, membranas bei DNR, sutrikdo ATP sintezės procesus bei daugybę metabolinių funkcijų tokių kaip trikarboksirūgšties ciklas, riebiųjų rūgščių oksidacija, urea ciklas, aminorūgščių metabolizmas, hemo sintezė bei FeS agregato sudarymas. Mitochondrijų oksidacinis pažeidimas taip pat gali sukelti tendenciją mitochondrijose išleisti baltymus į tarpmembraninę erdvę. Pavyzdžiui, citochromas C patekęs į citozolį dėl mitochondrijų išorinės membranos pralaidumo gali sukelti ląstelės apoptozės mechanizmą.[11]
1.4. Mitochondrijos vėžinėse ląstelėse
Vėžinės ląstelės aktyvina glikolizės procesus bei juose dalyvaujančius fermentus, taip pat įskaitant ir gliukozės transporterius.[12]
Vėžinės ląstelės kaupia defektus savo mitochondrijų genome. Šie defektai priveda prie sulėtėjusios mitochondrijų respiracijos bei ATP generacijos. [13][14] Dauguma atvejų, tokios mutacijos yra įgaunamos per arba po onkogenezės. Mitochondrijų DNR mutacijos išsiskiria į dvi klases. Pirmoji kategorija apima keletą mutacijų, kurios inhibuoja oksidacinį fosforilinimą, padidina reaktyvių deguonies formų gamybą bei skatina vėžinių ląstelių proliferaciją. Kita kategorija, kurioje yra pastebimos švelnesnės mutacijos, leidžia vėžinėms ląstelėms prisitaikyti prie naujos aplinkos, ypač, kai vėžys progresuoja ar yra metastazėje.[13]
Vėžinės ląstelės gali adaptuotis prie sumažėjusio deguonies kiekio. Tiesa, kelias, kuriuo ląstelės prisitaiko prie hipoksijos yra uždarant mitochondrinį kvėpavimą ir įjungiant glikolizės metabolizmą.[15][16]
Kai kuriais atvejais, mitochondrijų fermentai gali veikti kaip auglį supresuojantys baltymai, kuriuose mutacija yra netiesiogiai sukeliama aerobinės glikolizės.[15]
1.5. Varburgo efektas
Vėžinės ląstelės savo metabolizmu veikia augimą, išlikimą, proliferaciją bei ilgalaikią priežiūrą. Dažniausiais šio pakeisto metabolizmo bruožas yras tas, jog padidėja gliukozės gavimas bei gliukozės fermentacija į laktatą. Šis fenomenalus reiškinys vyksta net tuomet, kai mitochondrija yra visiškai nepažeista ir atlieka savo funkcijas. Šis procesas yra vadinamas Varburgo efektu. Varburgo efektas yra žinomas daugiau nei 90 metų, o per pastaruosius 10 metų yra išleista daugiau nei tūkstantis šia tema susijusių darbų. Tačiau, nors ir yra daugybė straipsnių, Varburgo efektas yra iki šiol tiksliai neištirtas.[17]
Varburgo efektas apibūdina sustiprėjusią gliukozės konvertaciją į laktatą vėžinėse ląstelėse, net ir tuomet kai yra pakankamas deguonies kiekis, kuris būtų naudojamas oksidaciniam fosforilinimui.[16] AKT onkogeno aktyvacija sukelia padidėjusią gliukozės transportaciją ir HK2 aktyvumą. MYC onkogenas aktyvuoja glikolitinius genus ir mitochondrijų biogenezę, kuris yra nepertraukiama didelio MYC kiekio, kuris gali sukelti ROS produkciją. Tuo pačiu ROS gali sukelti mtDNR mutacijas, taip pažeidžiant pačias mitochondrijas. p53 stimuliuoja kvėpavimą, aktyvinant kvėpavimo komponentų grandinę. HIF-1 aktyvuoja glikolitinius genus bei tiesiogiai veikia į PDK1 geną,
kuris inhibuoja PDH, kuris katalizuoja piruvato pavertimą į acetil-KoA. PDH inhibavimas su PDK1 pagalba, sumažina mitochondrijų funkcijas.[17]
3 pav. Varburgo efekto schema [17]
Daugumoje ląstelių didžioji dalis ROS yra bioproduktai vykstant mitochondrijų kvėpavimui. Apie 2 % molekulinio deguonies yra panaudoto kvėpavimo metu tra paverčiama į superoksido radikalą. Mitochondrijų elektronų transporto grandinę sudaro keletas redokso centrų, kurie galėtų praleisti elektronus į molekulinį deguonį, veikdami kaip pirminis šaltinis sudarant superoksido produktus daugelyje audinių. ROS oksiduoja ląstelinius proteinus, lipidus ir nukleino rūgštis ir tokiu būdu sukelia ląstelių disfunkciją arba mirtį.. Nesubalansuota ROS gamyba sukelia antioksidacinės gynybos sutrikimus ir pasireiškia kaip oksidacinis stresas.[18]
1.6. Glioblastomos ląstelės
Daugiaformė glioblastoma gali susidaryti smegenyse ar kilti iš astrocitomų bei oligodendrogliomų. Dažniausiai, glioblastomos atsiranda smegenų pusrutulyje, ypač kaktinėje ir smilkininėje skiltyse.[19]
4 pav. Glioblastomos magnetinio rezonanso nuotraukos [19]
Daugiaformės glioblastomos gydymas yra labai sudėtingas procesas, kuris iškelia unikalius gydymo iššūkius dėl šių požymių:
Auglio lokalizacijos smegenyse
Įgimtas pasipriešinimas spindulinei terapijai
Ribotos galimybės smegenų ląstelėms atsistatyti pačioms
Piktybinių ląstelių judėjimas į šalia esančius smegenų audinius
Sutrinka auglio kraujotakos tiekimas, kuris sumažina efektyvaus vaisto pristatymą
Ribotos atsakas į terapiją
Iškyla neurotoksiškumo pavojus tiesiogiai gydant gliomas
Simptomai gali kisti priklausant nuo auglio vietos, tačiau dažniausiai pasitaikantys yra šie:
Nuolatinis galvos skaumas
Padvigubėjęs ar neryškus vaizdas
Vėmimas
Apetito praradimas
Nuotaikos pasikeitimai
Mąstymo ir mokymosi galimybių sutrikimai
Traukulių pradžia
Kalbos sutrikimai Gydymas
Pagrindinis glioblastoma multiforme gydymas yra susijęs su operacija kartu atliekant spindulinę terapiją bei chemoterapiją. Operacijos tikslas yra pašalinti kiek galima didesnę auglio dalį, nepažeidžiant aplinkinių, sveikų smegenų audinių, kurie reikalingi neurologinėms funkcijoms atlikti.
Deja, glioblastomos ląstelės migruoja ir užkrečia kitus audinius, todėl pašalinti viso auglio neįmanoma.[19]
Po operacijos pradedama spindulinė terapija. Jos tikslas yra sunaikinti likusias auglio ląsteles, kurios infiltravosi į aplinkinius smegenų audinius. Kiekvienas toks gydymo etapas sunaikina ir sveikas, ir pažeistas ląsteles. Šis gydymas yra kartojamas nuo 10 iki 30 kartų, priklausomai nuo naviko tipo. Nors toks gydymas yra sudėtingas ir pavojingas, tačiau jis prailgina pacientų gyvenimo trukmę lyginant vien su operacija ar palaikomuoju gydymu.
Taikant chemoterapijos metodą, pacientams yra skiriami preparatai, kurie yra skirti sunaikinti vėžines ląsteles. Pagrindinis chemoterapijos procese naudojamas vaistas yra temozolamidas. Kaip ir kiekvienas vaistas, taip ir temozolamidas pasižymi šalutiniais poveikiais bei tikimybe susirgti pneumocistine pneumonija. Skiriant šį vaistą, gydytojas taip pat kartu privalo naudoti antimikrobinius vaistus, kad būtų sumažintas šalutinis poveikis. Tačiau prevencinis gydymas ne visada yra veiksmingas ir taikomas.[19]
1.7. Naftochinonai
Naftochinonai yra natūraliai paplitę antriniai metabolitai ir jie turi svarbų biologinį aktyvumą. Jie gali būti patinkami aktinomicetuose ( Streptomyces), grybuose ( Fusarium, Marasmius, Verticillium), kerpėse, dumbliuose bei augaluose. Vertingiausi naftochinonus kaupiantys augalai priklauso filogenetiškai nevienalyčioms augalų šeimoms tokioms kaip Avicenniaceae, Balsaminaceae, Bignoniaceae, Boraginaceae, Droseraceae, Ebenaceae, Juglandaceae, Nepenthaceae ir Plumbaginaceae.[20]
Monomerinių naftochinonų cheminė struktūra yra paremta bicikline sistema – naftaleno skeletas pakeistas C1 ir C4 ( 1,4-naftochinonai) arba C1 ir C2 ( 1,2-naftochinonai). Šie organiniai junginiai
yra labai reaktyvūs ir jie naudojami kaip natūralūs ar sintetiniai dažikliai, kurių spalvos svyruoja nuo geltonos iki tamsiai raudonos. Naftochinonai pasižymi daugeliu fiziologiniu poveikiu: svarbiausi naftochinonai yra vitamino K analogai – filokvinonas ir menadionas. Naftochinonai naudojami kaip antimikrobinės, antigrybelinės, antivirusinės medžiagos. Tradicinėje medicinoje, ypač Azijoje bei Pietų Amerikoje, augalai, kaupiantys naftochinonus, turi platų panaudojimą, ypač gydant įvairios kilmės vėžinius susirgimus.[21] Lawsonia inermis lapai, kaupiantys savyje lavsoną, nuo seno yra naudojami tradicinėje Afrikos bei Indijos medicinoje. Šio augalo lapų ekstraktas yra naudojamas gydyti poliomielitą ir tymus Yoruba gentyje, Nigerijoje. Kinijoje ir Japonijoje naftochinonai yra naudojami kaip kardiovaskulinė bei smegenų kraujotaką gerinanti medžiaga. Ajurvedinėje medicinoje yra
naudojamas plumbaginas, kuris yra labai efektyvus sergant tokiomis ligomis kaip leukoderma ar nuplikimas.[21]
Citotoksinis naftochinonų poveikis grindžiamas tuo, jog jie sugeba generuoti reaktyvias deguonies formas (ROS), kurios dalyvauja ląstelės procesuose ir ji tarnauja kaip signalinė molekulė apoptozės metu, ląstelei susinaikinant. Žvelgiant iš toksikologinės pusės, yra du pagrindiniai chinonų citotoksiniai mechanizmai.[21][22] Pirmiausia, chinonai praeina vieną elektrono redukcijos etapą, padedant mikrosominės NADPH citochromo P-450 reduktazės arba mitochondrinės NADH ubichinono oksidoreduktazės. Esant aerobinėms sąlygoms, semichinonų radikalas dalyvauja redokso cikle ir padeda sudaryti reaktyvias deguonies formas (ROS): superoksido anijoną ( O2-) ir vandenilio peroksidą ( H2O2).
Antra, chinonai yra potencialūs elektrofilai, galintys reaguoti su tiolo grupėmis baltymuose ir glutatione. Glutationo konjugatų susidarymas, kuris yra katalizuojamas glutationo transferazės izoformų, kuomet yra išeikvojamas visas glutationas, yra siejamas su menadiono sukeltu citotoksiškumu ir oksidaciniu stresu.[22]
1.8. Plumbaginas
5 pav. Struktūrinė plumbagino formulė
Plumbaginas ( 5-hidroksi-2-metil-1,4-naftochinonas, vitamino K3 analogas), yra gaunamas
iš Plumbaginaceae, Droseraceae, Ancestrocladaceae ir Dioncophyllaceae šeimų.
Pliumbaginas natūraliai yra geltonas pigmentas, o jo pagrindinis šaltinis yra augalas Plumbago zeylanica. Šis augalas yra nedidelis, o jo naudojama žaliava yra šaknys arba lapai. Jis labiausiai paplitęs pietrytinėje Azijos žemyno dalyje bei tropinėse Afrikos vietose. Šiuose kraštuose Plumbago zeylanica yra labai populiarus dėl didelio savo panaudojimo. Jis naudojamas esant odos ligoms, infekcijoms, dermatitui, aknei. Afrikos regionuose daugiausiai yra vartojamos šaknys, kadangi
jos pasižymi stipresniu poveikiu. Jis vartojamas net tokioms ligoms kaip gonorėjai, sifiliui, tuberkuliozei ar reumatiniam skausmui gydyti.[23]
Plumbaginas pasižymi antioksidaciniu, priešuždegiminiu priešvėžiniu, antibakteriniu ir antigrybeliniu poveikiu.[22] Yra ištirta, jog susidaro reaktyvios deguonies formos biologinėse sistemose. Šie dariniai turi savybę inhibuoti vaistų veikimo mechanizmą vaistams atspariose bakterijose, Pliumbaginas efektyviai dalyvauja apoptozėje ir sutrikdo ląstelių ciklą, kuris įvyksta dėl NF-κB inaktyvavimo.[23]
Buvo atlikti tyrimai, kurių metu nustatyta, jog plumbaginas pasižymi citotoksiškumu, slopina CXCR4 ekspresiją, kuris yra pagrindinis komponentas tiriant vežio metastazes.[24]
Taip pat buvo ištirta žmogaus krūties vėžio ląstelių linija MDA-MB-231SA ir nustatyta, jog plumbagino koncentracija, kuri siekia 2,5-20 µmol/L, inhibuoja ląstelių gyvybingumą, sugebėjimą išlikti fucnkcionuojančiomis bei sukelia apoptozę (IC50 yra 14,7 µmol/L). Plumbagino naudojimas
auglio didėjimą pavėlino 2-3 savaitėmis bei sumažino jo dydį 44-47 %. Taip pat, tuo pačiu tyrimu buvo nustatyta, jog plumbaginas mažina kaulų eroziją.[25]
Plumbaginas gana stipriai padidina intraląstelinę reaktyvių deguonies formų koncentraciją. Pastebėta, jog tiriant žmogaus krūties vėžio ląstelių MCF-7 liniją, plumbaginas stipriai sumažino PI5K-1B koncentraciją, taip inhibuodamas ląstelių gyvybingumą. Atliktas tyrimas nustatė, jog PI5K-PI5K-1B gali būtu naujas molekulinis taikinys plumbaginui, kuris vaidintų svarbų vaidmenį ROS generacijoje tiriant citotoksiškumą.[26]
1.9. Menadionas
6 pav. Struktūrinė menadiono formulė
Menadionas ( 2-metil-1,4-naftochinonas) yra vienas iš vitamino K analogų. Šiuo metu yra žinomi trys: filochinonas (vitaminas K1), menachinonas (vitaminas K2) bei menadionas (vitaminas K3).
Menadionas nėra priskiriamas prie natūralių vitamino K formų, kadangi jis yra sintetinis analogas ir gali būti vartojamas kaip maisto papildas.
Oksidacinis stresas yra svarbus veiksnys ligos atveju. Vieno elektrono redukcija sukuria vieną reaktyvią deguonies formą per redokso ciklą, o dviejų elektronų detoksifikacija ( NADPH chinono oksidoreduktazė) – nesukuria.[27] Menadiono sugebėjimas sukurti ROS ir ląstelių gyvybingumas buvo palygintas su necikliniu analogu ( 2,4-dimetoksi-2-metilnaftalenu (DMN)). Menadionas reaktyvių deguonies formų sudarymas yra susijęs su NADPH sumažėjimu. DMN nesudarė jokių reaktyvių deguonies formų, bet smarkiai padidino menadiono sukeliamus efektus, stiprindamas vieno elektrono redukcijos reakciją. Tuo metu DMN inhibavo NADPH chinono oksidoreduktazės detoksifikaciją. Menadionas sukėlė tų ląstelių apoptozę, kurios buvo paveiktos DMN, o pats DMN jokio poveikio neturėjo.[27]
In vivo bei in vitro tyrimai parodė, jog menadionas veikia sinergistiškai kartu su chemoterapiniais preparatais. Kombinuojant gydymą menadionu bei 5-fluoruracilu yra sustiprinamas poveikis prieš hepatomos ląsteles.[28] Taip pat panašus poveikis yra pastebimas ir su kitais chemoterapinias medikamentais: merkaptopurinu, citarabinu, hidroksiurea, VP-16, vinkristinu, doksorubicinu, mitoksantinu, mitomicinu C, aktinomicinu D.[29]
Taip pat buvo pastebėtas santykis tarp vitamino C bei vitamino K3, vartojant juos santykiu
100:1. Kombinuojant šiuos vitaminus, yra inhibuojama daugelis urologinių vėžio ląstelių linijų.[30] In vitro sinergistinis citotoksinis vitaminų C bei K3 efektyvumas yra labiau tikėtinas ir
pastebimas esant burnos gleivinės suragėjusioms karcinomoms ir žmogaus promielocitinei leukemijai lyginant su normaliomis ląstelėmis, tokiomis kaip fibroblastai.[31] Šių vitaminų citotoksinis veikimas yra charakterizuojamas kaip ląstelių mirtis, kuri morfologiškai yra atskirta nuo apoptozės ir nekrozės, ir yra vadinama autošize. Šio proceso metu, citoplazma yra išstumiama iš branduolio.[32]
1.10. Lavsonas
Lavsonas ( 2-hidroksi-1,4-naftochinonas) yra svarbiausia bei pagrindinė molekulė, kuri yra išskiriama iš Henna augalo.
Lavsonas yra raudonai oranžiniai dažai, kurie yra gaunami iš Lawsonia inermis Linn., Lythraceae augalų lapų arba iš Henna augalo. Henna yra aukštas krūmas arba mažas medis, kuris gali išaugti iki 7 metrų aukščio. Henna augalas yra sutinkamas šiaurinėje Afrikos dalyje, vakarinėje bei pietinėje Azijos dalyje bei šiaurinėje Australijos žemyno dalyje ir tropinėse zonose. Produktyviausi Henna augalai aptinkami, kai oro temperatūra yra tarp 35-45ºC. Iš Henna augalo yra išskiriami lavsono tipo dažai, kurie nuo seno yra naudojami plaukų, nagų dažymui bei tatuiruitėms. Kaip kosmetiką, lavsono dažai yra naudojami daugiau nei 5000 metų.[33]
Šis naftochinonas yra labai panašus analogas kaip ir plumbaginas bei juglonas.[33]
Per pastaruosius kelis dešimtmečius buvo išsiaiškinta daugybė lavsono biologinių savybių: antikomplementarumo, dihidroorotato dehidrogenazės inhibitoriaus aktyvumas, makrofagus stimuliuojantis, antimikrobinis, hepatoprotektinis, citotoksinis, antipiretinis, analgezinis, priešuždegiminis aktyvumas.[34]
1.11. Juglonas
8 pav. Struktūrinė juglono formulė
Juglonas (5-hidroksi-1,4-naftochinonas) yra aromatinis junginys, kuris yra randamas Juglandaceae šeimos augaluose tokiuose kaip Juglans regia, Juglans nigra, Juglans cineraria bei Carya olivivaeformis, Pterocarya caucarica ir Pterocarya stemoptera. Juglans regia (Graikinis riešutmedis) yra 20-30 metrų aukščio medis. Šis augalas yra labiausiai paplitęs centrinėje Azijos dalyje (Kazachstane,
Uzbeskistane, Nepale, Butane, Indijoje). Juglonas yra randamas beveik visose augalo dalyse: lapuose, šaknyse, stiebe, šakose bei vaisiuose.
Juglonas yra naudojamas kaip natūralus dažas vilnos pramonėje ir plaukų dažų gamyboje. Medicinoškai juglonas pasižymi įvairiapusiu poveikiu. Dažniausiai yra pastebimas antibakterinis bei antihelmintinis poveikiai.[35][36]
Naujesni tyrimai taip pat rodo, jog juglonas pasižymi ir antivėžiniu poveikiu. Jis veikia plaučių, virškinimo sistemos bei šalinimo sistemos auglius.[37][38][39] Veikdamas juglonas sukelia ląstelių mirtį, sumažina vėžinių ląstelių augimą bei sulėtina gliomos ląstelių migraciją.
Kituose tyrimuose taip pat buvo pastebėta, jog juglonas padidina ROS intraląstelinę koncentraciją.[40][41] Pirmieji trys kvėpavimo kompleksai yra pagrindiniai šaltiniai ROS susidarymui. Inhibuojant ar pažeidžiant šiuos kompleksus, galima labai stipriai padidinti ROS susidarymo galimybę.[42] Naujausiuose tyrimuose yra daroma prielaida, jog naftochinonai sąveikauja su elektronų transporto grandine, taip veikdami kvėpavimą ir reguliuodami ROS susidarymą.[43]
2. Metodai ir medžiagos
2.1. Naudotos medžiagos ir aparatūra
2.1.1. Naudotos medžiagos
1. Ląstelių auginimo terpė (DMEM) (Sigma-Aldrich) 2. Fetalinis veršelio serumas (FBS) (Sigma-Aldrich) 3. Fosfatinis druskos buferis (PBS) (Sigma-Aldrich)
4. Sudėtinis antibiotikų tirpalas (Penicilino – streptomicino tirpalas) (Sigma-Aldrich) 5. Triptano mėlio dažų tirpalas (0,4%) (Sigma-Aldrich)
6. C2H5OH – etanolis (UAB ,,Stumbras“)
7. 2-hidroksi-1,4-naftochinonas – lavsonas (Sigma-Aldrich) 8. 2-metil-1,4-naftochinonas – menadionas (Sigma-Aldrich)
9. 5-hidroksi-2-metil-1,4-naftochinonas – plumbaginas (Sigma-Aldrich) 10. 5-hidroksi-1,4-naftalendionas – juglonas (Sigma-Aldrich)
2.1.2. Naudota aparatūra
1. Fluorescencinis mikroskopas OLYMPUS IX71S1F-3
2. Laboratorinės analizinės svarstyklės (0,0001 tikslumo) HF-1200 GD, A&D Company 3. Oksimetrinė sistema Oxygraph 2k (OROBOROS Instruments)
4. Centrifuga Eppendorf Centrifuge 5810R 5. Laminaras (Herasafe KS, Thermo Scientific)
2.2. Ląstelių kultivavimo metodas
Tyrimui buvo naudojama C6 ląstelių kultūra išgauta iš žiurkės smegenų auglio
Glioblastoma multiforme. Ląstelėms augti buvo naudojama auginimo terpė DMEM (Dulbecco’s
Modified Eagle’s medium; Sigma Aldrich, D5796) su gliutamatu. Į terpę dedame FBS (fetalinio veršelio serumo, Sigma Aldrich) ir antibiotiko Penicilino/Streptomicino tirpalo (10000 IU/ml – 10000 μg/ml) (Sigma, P0781), tam kad nesidaugintų mikroorganizmai. Ląstelės buvo laikomos termostate, 37°C temperatūroje, 5 proc. CO2.
Ląstelių atskyrimui buvo naudojamas 0,25% tripsino/EDTA tirpalas (Sigma, T4049). Tripsinas - tai fermentas suardantis tarpląstelines jungtis, uždėjus jo ant auginimo flakone esančių ląstelių ir keletą minučių palikus veikti, ląsteles galime atskirti nuo auginimo flakonų. Atšokusios ląstelės buvocentrifuguojamos 5 minutes 1500 apsisukimų per minute greičiu.
2.3. Ląstelių tankio nustatymas
Ląstelių skaičiavimui yra naudojamas hemocitometras ir triptano mėlio dažų tirpalas (0,4%) (Sigma Aldrich). 20 μl triptano mėlio dažų tirpalo sumaišoma su 20 μl ląstelių suspensijos ir įvedama ant hemocitometro kameros po dengiamuoju stikleliu ir stebima pro šviesinį mikroskopą bei skaičiuojamas ląstelių skaičius keturiuose langeliuose. Mėlynai nusidažiusios ląstelės nėra skaičiuojamos, nes dėl ląstelių membranos pažaidos triptano mėlis praeina pro membraną ir jas nudažo, tai reiškia jog šios ląstelės yra negyvos.
9 pav. Hemocitometro kamera. Ši kamera yra padalinta į devynis kvadratus 1.0 mm x 1.0 mm, kurie yra atskirti vienas nuo kito trigubomis linijomis. Kiekvienas kvadratas yra 1 mm² ploto
Ląstelių skaičius 1 mililitre apskaičiuojamas pagal formulę: n = (a+b+c+d)*4*2*5000, kur:
n – ląstelių skaičius 1 ml;
a, b, c, d – ląstelių skaičius langeliuose; 5000 = c – konstanta;
2 – skiedimų skaičius.
2.4. Mitochondrijų kvėpavimo greičio nustatymas
Mitochondrijų kvėpavimo grečio nustatymui yra naudojamas prietaisas Oxygraph 2K (OROBOROS).
Oksigrafo kiuvetės yra pripildomos kvėpavimo matavimo terpe, kuri yra sudaryta iš 0,5 mM EGTA, 3 mM MgCl2, 60 mM kalio laktobionato, 20 mM taurino, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES,
110 mM sacharozės. Kvėpavimo matavimai yra atliekami 37 ºC temperatūroje. Kvėpavimo matavimo terpė yra pripildoma substratais: glutamatu bei malatu. Tada yra naudojamas ADP. Tuomet jau yra naudojami atitinkami naftochinonai ir stebima, kaip kinta ląstelių kvėpavimo greitis. Mitochondijų kvėpavimo greitis yra išreiškiamas pmol O/s-1/mg-1 mitochondrijų baltymo.
Buvo atlikti tyrimai tik su ląstelių auginimo terpe, substratais bei naftochinonais, norint įsitikinti, jog naftochinonai nereaguoja su terpės komponentais ir neturi įtakos O2 kiekio kitimo
kiuvetėje.
11 pav. Tipinė poliarografinė kreivė, demonstruojanti kvėpavimo terpės bei substratų poveikį
2.5. Statistinis duomenų apdorojimas
Eksperimentiniai duomenys apdoroti ,,Microsoft Excel 2013“ paketu. Rezultatai pateikiami kaip ± standartinė paklaida. Skirtumas tarp reikšmių, kai p<0,05 buvo priimtas kaip statistiškai reikšmingas. Range [h:min]: 0:30 0:30 0:25 0:20 0:15 0:10 0:05 0:00 O 2 C o n c e n tr a ti o n (A ) [n m o l/ m l] 250 200 150 100 50 0 O2 S lo p e u n c o rr . ( A ) [p m o l/ (s *m l) ] 160 120 80 40 0 01 02 03
3. Darbo rezultatai ir aptarimas
3.1. Mitochondrijų esančių C6 ląstelėse tyrimas
12 pav. Tipinė poliarografinė kreivė, demonstruojanti C6 ląstelėse esančių mitochondrijų kvėpavimą
Remiantis pateikta mitochondrijų kvėpavimo greičio kreive, pradinis mitochondrijų kvėpavimo greitis (VL) buvo matuojamas į terpę pridedant substratų (glutamato, malato bei sukcinato)
bei digitonino, kuris skirtas ląstelės membranos pralaidumui padidinti. Oksidacinio fosforilinimo greitis mitochondrijose (VADP) buvo matuotas pridėjus ADP. Išorinės mitochondrijų membranos intaktiškumui
įvertinti pridedamas citochromas C.
Pridėjus digitonino, kvėpavimo greitis padidėjo iki 32,6, t.y 65,48%. Pridėjus ADP (VADP),
greitis padidėja iki 57,8, kvėpavimo kontrolė šiame tyrime yra 1,77. Sekančiame etape buvo naudojamas citochromas C. Jam veikiant mitochondrijų kvėpavimo greitis lyginant su praeitu etapu padidėjo nežymiai, nuo 57,8 iki 60,4, t.y. 4,55%. Paskutiniame etape buvo naudojamas dinitrofenolis, kuris atskiria kvėpavimą bei fosforilinimą, padarydamas pralaidžią vidinę mitochondrijų membraną protonams. Išmatuotas greitis yra 85,1, t.y. 40,83 %.
3.2. Juglono poveikis C6 gliomos ląstelių mitochondrijų kvėpavimo
greičiams
Tiriant juglono įtaką mitochondrijų kvėpavimo greičiams, pradžioje buvo stebimas jo veikimas į VL (13 pav.). Range [h:min]: 0:30 0:30 0:25 0:20 0:15 0:10 0:05 0:00 O 2 C o n c e n tr a ti o n (A ) [n m o l/ m l] 250 200 150 100 50 0 O2 S lo p e u n c o rr . ( A ) [p m o l/ (s *m l) ] 160 120 80 40 0
13 pav. Tipinė poliarografinė kreivė, demonstruojanti juglono poveikį į mitochondrijų substratais stimuliuotą kvėpavimo greitį
Išmatuotas VL yra 36,2, terpėje esant substratams glutamatui, malatui ir sukcinatui.
Pridėjus 0,5 µM juglono, kvėpavimo greitis padidėja 57,72 % palyginus su substratais stimuliuotu mitochondrijų kvėpavimo greičiu. Pridėjus dar 0,5 µM juglono, kvėpavimo greitis lyginant su VL
padidėja 75,83 %. Toliau pridedant 1 µM juglono, kvėpavimo greitis mitochondrijose didėja iki 73,4 t.y. jis padidėja 102,89 % lyginant su VL. Ir pasiekiamas greitis, kuris būdingas su dinitrofenoliu
stimuliuotam kvėpavimo greičiui. Tolimesni juglono priedai mitochondrijų kvėpavimo greitį didina nežymiai: pridėjus dar 1 µM juglono, kvėpavimo greitis padidėjo iki 103,29 %. Dar pridėjus 2,5 µM juglono, kvėpavimo greitis padidėja iki 105,8 % lyginant su VL.
Sekančiuose eksperimentuose tyrėme juglono poveikį mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo aktyvumui. Tipinėje mitochondrijų kvėpavimo greičio kreivėje (14 pav.), matome, jog išmatuotas VL – 25,4. ADP stimuliuotas kvėpavimo greitis padidėjo iki 56,7. Kvėpavimo kontrolė –
2,23.
14 pav. Tipinė poliarografinė kreivė, demonstruojanti juglono poveikį į mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo greitį
Tolimesniais priedais buvo siekta ištirti kaip skirtingos juglono koncentracijos veikia ADP stimuliuojamą mitochondrijų kvėpavimo greitį. Iš pradžių buvo įdėta 1 µM juglono. Kvėpavimo greitis padidėjo iki 65,2. t.y. 15,02 %. Toliau vertinant juglono įtaką kvėpavimui, buvo didinama jo koncentracija. Pridėjus 1 µM bei dar 5 µM juglono, kvėpavimo greitis nebekito. Tyrime panaudotos
Range [h:min]: 0:30 0:30 0:25 0:20 0:15 0:10 0:05 O 2 C o n c e n tr a ti o n (B ) [n m o l/ m l] 250 200 150 100 50 0 O2 S lo p e u n c o rr . ( B ) [p m o l/ (s *m l) ] 160 120 80 40 0
last dig jugl 1-1 jugl 1-1 jugl 1-2 jugl 1-2 jugl 1-5
Range [h:min]: 0:30 0:30 0:25 0:20 0:15 0:10 0:05 O 2 C o n c e n tr a ti o n (A ) [n m o l/ m l] 250 200 150 100 50 0 O2 S lo p e u n c o rr . ( A ) [p m o l/ (s *m l) ] 160 120 80 40 0
juglono koncentracijos (1-7 µM) maksimaliam mitochondrijų kvėpavimo greičiui reikšmingos įtakos neturėjo.
1 lentelė. Juglono poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiams
Bendras naftochinono kiekis (juglono) µM Substratais stimuliuotas mitochondrijų kvėpavimo greitis (pmol/(s*ml)) Greičio padidėjimas lyginant su substratais stimuliuotu mitochondrijų kvėpavimo greičiu ADP stimuliuotas mitochondrijų kvėpavimo greitis (pmol/(s*ml)) Greičio padidėjimas lyginant su ADP stimuliuotu mitochondrijų kvėpavimo greičiu 0,5 57,1 ± 4,8* 57,72 % 1 63,9 ± 4,0* 75,83 % 65,2 ± 3,3 15,02 % 2 73,4 ± 6,2* 102,89 % 58,6 ± 5,3 1,03 % 3 73,6 ± 5,8* 103,29 % 5,5 74,5 ±4,1* 105,8 % 7 58,9 ± 4,5 1,04 % *p<0,05
3.3. Lavosno poveikis C6 gliomos ląstelių mitochondrijų kvėpavimo
greičiams
Tiriant lavsono įtaką mitochondrijų kvėpavimo greičiams, pradžioje buvo stebimas jo veikimas į VL (15 pav.).
15 pav. Tipinė poliarografinė kreivė, demonstruojanti lavsono poveikį į mitochondrijų substratais stimuliuotą kvėpavimo greitį
Range [h:min]: 0:30 0:30 0:25 0:20 0:15 0:10 0:05 0:00 O 2 C o n c e n tr a ti o n (B ) [n m o l/ m l] 250 200 150 100 50 0 O2 S lo p e u n c o rr . ( B ) [p m o l/ (s *m l) ] 160 120 80 40 0
Pridėjus digitonino, ląstelių kvėpavimo greitis padidėja iki 32,7 t.y. 39,17 %. Pridėjus 10 µM lavsono, mitochondrijų kvėpavimo greitis padidėjo 14 %, lyginant su substratais stimuliuotu mitochondrijų kvėpavimo greičiu. Toliau tiriant lavsono įtaką buvo pridedama dar 10 µM lavsono, greitis padidėjo 34,20 % lyginant su substratais stimuliuotu mitochondrijų kvėpavimo greičiu. Pridėjus dar 25 µM lavsono, jis padidėja 63,94 %. Pridėjus dar 50 µM lavsono, kvėpavimo greitis dar didėja, iki 59,5. Šis lavsono pridėjimas greitį padidino 82,06 % lyginant su substratais stimuliuotu mitochondrijų kvėpavimo greičiu. Pridėjus dar 100 µM lavsono, kvėpavimo greitis padidėjo iki 61,3 t.y 87,41 %. Tyrime panaudotos lavsono koncentracijos maksimalaus atskirto mitochondrijų kvėpavimo greičio nepasiekė.
Sekančiuose eksperimentuose buvo tiriama lavsono įtaką į VADP (16 pav.).
16 pav. Tipinė poliarografinė kreivė, demonstruojanti lavsono poveikį į mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo greitį
Substratais stimuliuotas mitochondrijų kvėpavimo greitis šiuo atveju buvo 36,1. Pridėjus ADP, išmatuotas oksidacinio fosforilinimo greitis - 59,6; kvėpavimo koeficientas - 1,65. Tolimesniais priedais buvo tiriamas naftochinono – lavsono poveikis . Pridėjus 10 µM lavsono, kvėpavimo greitis padidėjo iki 63,1 ir tai yra 5,83 % didesnis greitis, palyginus su greičiu stimuliuojant ADP. Pridėjus dar 10 µM lavsono, kvėpavimas padidėjo nežymiai (9,07 %). Pridėjus dar 25 µM lavsono, greitis padidėjo 14,06 % . Tolimesni lavsono priedai (50 µM, 100 µM), kvėpavimo greičiui įtakos neturėjo.
Rezultatai rodo, kad tyrimuose panaudotos lavsono koncentracijos (10-95 µM) reikšmingo poveikio maksimaliam mitochondrijų kvėpavimo greičiui netutėjo.
2 lentelė. Lavsono poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiams
Bendras naftochinono kiekis (lavsono) µM Substratais stimuliuotas mitochondrijų Greičio padidėjimas lyginant su substratais ADP stimuliuotas mitochondrijų kvėpavimo Greičio padidėjimas lyginant su ADP Range [h:min]: 0:30 0:30 0:25 0:20 0:15 0:10 0:05 0:00 O 2 C o n c e n tr a ti o n (A ) [n m o l/ m l] 250 200 150 100 50 0 O2 S lo p e u n c o rr . ( A ) [p m o l/ (s *m l) ] 160 120 80 40 0
kvėpavimo greitis (pmol/(s*ml)) stimuliuotu mitochondrijų kvėpavimo greičiu greitis (pmol/(s*ml)) stimuliuotu mitochondrijų kvėpavimo greičiu 10 37,3 ± 5,2 14 % 63,1 ± 5,2 5,83 % 20 43,9 ± 4,7* 34,20 % 65,4 ± 3,9 9,07 % 45 53,6 ± 3,9* 63,94 % 68,1 ± 4,5 14,06 % 95 59,5 ± 4,3* 82,06 % 65,9 ± 5,3 10,51 % 195 61,3 ± 5,7* 87,41 % *p<0,05
3.4. Plumbagino poveikis C6 gliomos ląstelių mitochondrijų kvėpavimo
greičiams
Šiuose tyrimuose buvo vertinamas plumbagino poveikis substratis stimuliuotams mitochondrijų kvėpavimo greičiui VL (17 pav.).
17 pav. Tipinė poliarografinė kreivė, demonstruojanti plumbagino poveikį į mitochondrijų substratais stimuliuotą kvėpavimo greitį
Šiame tyrime išmatuotas substratais stimuliuotas mitochondrijų kvėpavimo greitis yra 25,3. Pridėjus 0,5 µM plumbagino greitis iškart pakyla ir palyginus šį greitį su substratais stimuliuotu mitochondrijų kvėpavimo greičiu, jis padidėja – 129,18 %. Toliau yra didinam plumbagino koncentraciją. Pridėjus dar 0,5 µM plumbagino, kvėpavimo greitis padidėja 7,91 %, palyginus su praeitu etapu, o palyginus su greičiu po substratais stimuliuoto mitochondrijų kvėpavimo greičio – 147,32 %. Pridėjus dar 2,5 µM plumbagino, greitis padidėja iki 84,5 bei palyginus greitį su greičiu po substratais stimuliuoto mitochondrijų kvėpavimo greičio, jis padidėja 223,48 %.
Sekančiuose eksperimentuose buvo tiriama plumbagino įtaką į VADP (18 pav.).
Range [h:min]: 0:30 0:30 0:25 0:20 0:15 0:10 0:05 0:00 O 2 C o n c e n tr a ti o n (A ) [n m o l/ m l] 250 200 150 100 50 0 O2 S lo p e u n c o rr . ( A ) [p m o l/ (s *m l) ] 160 120 80 40 0 last dig pl0.1-1 pl0.1-1 pl0.1-5 149.847 81.222
18 pav. Tipinė poliarografinė kreivė, demonstruojanti plumbagino poveikį į mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo greitį
VL šiame tyrime buvo 26,8. Pridėjus ADP, mitochondrijų kvėpavimas pakyla iki 58,0,
kvėpavimo kontrolė – 2,16. Toliau tiriant plumbagino įtaką ADP stimuliuotam mitochondrijų kvėpavimo greičiui, buvo įdėta 1 µM plumbagino, kuris kvėpavimo greitį padidino iki 86,0 ir buvo pasiektas maksimaliai atskirto mitochondrijų kvėpavimo greitis. Palyginus šį greitį su greičiu po ADP panaudojimo, jis padidėjo 48,27%. Pridėjus dar 1 µM bei dar 5 µM plumbagino, kvėpavimas nebebuvo stimuliuojamas.
3 lentelė. Plumbagino poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiams
Bendras naftochinono kiekis (plumbagino) µM Substratais stimuliuotas mitochondrijų kvėpavimo greitis (pmol/(s*ml)) Greičio padidėjimas lyginant su substratais stimuliuotu mitochondrijų kvėpavimo greičiu ADP stimuliuotas mitochondrijų kvėpavimo greitis (pmol/(s*ml)) Greičio padidėjimas lyginant su ADP stimuliuotu mitochondrijų kvėpavimo greičiu 0,5 58,1 ± 5,5* 129,18 % 1 62,7 ± 3,9* 147,32 % 86,0 ± 3,7* 48,27 % 2 83,5 ± 4,7* 43,94 % 3,5 84,5 ± 4,7* 223,48 % 7 77,9 ± 5,3* 34,28 % *p<0,05 Range [h:min]: 0:30 0:30 0:25 0:20 0:15 0:10 0:05 O 2 C o n c e n tr a ti o n (B ) [n m o l/ m l] 250 200 150 100 50 0 O2 S lo p e u n c o rr . ( B ) [p m o l/ (s *m l) ] 160 120 80 40 0 dig adp pl 2 pl 2 pl 10
3.5. Menadiono poveikis C6 gliomos ląstelių mitochondrijų kvėpavimo
greičiams
Tiriant menadiono įtaką mitochondrijų kvėpavimo greičiams, buvo stebimas jo veikimas į mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo greitį bei į VL.
Pradžioje buvo stebimas menadiono poveikis į VL (19pav.).
19 pav. Tipinė poliarografinė kreivė, demonstruojanti menadiono poveikį į mitochondrijų substratais stimuliuotą kvėpavimo greitį
VL šiame tyrime buvo 33,0. Pridėjus 0,5 µM menadiono, kvėpavimas pakyla 34,22 % palyginus su substratais stimuliuotu mitochondrijų kvėpavimo greičiu. Pridėjus dar 0,5 µM menadiono, mitochondrijų kvėpavimas padidėja ir palyginus su pradiniu greičiu, kvėpavimas suintensyvėja 58,16 %. Pridėjus dar 1 µM menadiono, kvėpavimo greitis pakyla. Palyginus su substratais stimuliuotu mitochondrijų kvėpavimo greičiu – 87,31 %. Tolimesnis menadiono priedas maksimaliai atskiria mitochondrijų kvėpavimą nuo fosforilinimo, išmatuotas kvėpavimo aktyvumas 82,7.
Šiame grafike (20 pav.) buvo stebimas menadiono veikimas į mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo greitį.
20 pav. Tipinė poliarografinė kreivė, demonstruojanti menadiono poveikį į mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo greitį
VL šiame tyrime buvo 37,7. Pridėjus ADP, kvėpavimas padidėja iki 66,3, o kvėpavimo koeficientas yra lygus 1,76. Po šio etapo yra dedamas naftochinonas ir stebima jo įtaka. Pridėjus 0,5 µM menadiono, mitochondrijų kvėpavimo greitis padidėja 13,35 % palyginus su greičiu po ADP. Po to yra
Range [h:min]: 0:30 0:30 0:25 0:20 0:15 0:10 0:05 0:00 O 2 C o n c e n tr a ti o n (B ) [n m o l/ m l] 250 200 150 100 50 0 O2 S lo p e u n c o rr . ( B ) [p m o l/ (s *m l) ] 160 120 80 40 0 01 02 03 04 05 06 07 08
last dig adp menad 2 menad 2 menad 4 menad 4 menad 10
Range [h:min]: 0:30 0:30 0:25 0:20 0:15 0:10 0:05 0:00 O 2 C o n c e n tr a ti o n (A ) [n m o l/ m l] 250 200 150 100 50 0 O2 S lo p e u n c o rr . ( A ) [p m o l/ (s *m l) ] 160 120 80 40 0
dedama dar 0,5 µM menadiono, o mitochondrijų kvėpavimo greitis padidėja 19,63 %. Pridėjus dar 1 µM menadiono, kvėpavimo greitis kyla ir palyginus su ADP greičiu, jis padidėja 36,76 %. Pridėjus dar didesnius menadiono kiekius, mitochondrijų kvėpavimo greitis nebekyla, nes pasiektas maksimaliai nuo fosforilinimo atskirtas mitochondrijų kvėpavimo greitis.
4 lentelė. Menadiono poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiams
Bendras naftochinono kiekis (menadiono) µM Substratais stimuliuotas mitochondrijų kvėpavimo greitis (pmol/(s*ml)) Greičio padidėjimas lyginant su substratais stimuliuotu mitochondrijų kvėpavimo greičiu ADP stimuliuotas mitochondrijų kvėpavimo greitis (pmol/(s*ml)) Greičio padidėjimas lyginant su ADP stimuliuotu mitochondrijų kvėpavimo greičiu 0,5 44,2 ± 3,1* 34,22 % 75,1 ± 7,2 13,35 % 1 52,1 ± 2,8* 58,16 % 79,3 ± 6,8 * 19,63 % 2 61,8 ± 5,7* 87,31 % 90,7 ± 8,4* 36,76 % 5,5 82,7 ± 6,4* 150,81 % *p<0,05
Rezultatų aptarimas
Paskutiniais metais sveikatos sistemoje vis didesnis dėmesys yra kreipiamas į natūralius preparatus, pagamintus iš vaistinės augalinės žaliavos bei į juose įeinančius biologiškai aktyvius junginius ir jų veikimo mechanizmus.
Mitochondrijų pagrindinė funkcija žinduolių ląstelėse yra energijos gamyba, kuri vyksta oksidacinio fosforilinimo metu. Oksidacinis fosforilinimas – tai eilė cheminių reakcijų, kurių metu vyksta įvairių substratų oksidacija ir atsipalaiduoja energija, kuri transformuojama į ATP. Yra žinoma, kad įvairūs struktūriniai ir funkciniai pakitimai bei įvairios į ląstelę patenkančios medžiagos gali daryti įtaką ATP gamybai ir sutrikdyti ląstelių aprūpinimą energija. Jau yra atlikta nemažai mokslinių tyrimų, kuriuose tyrinėtas polifenolinių junginių, dažniausiai flavonoidų, poveikis mitochondrijoms, tačiau kitų junginių grupių, pavyzdžiui, naftochinonų, poveikis energijos gamybai yra netirtas arba tyrimų kiekis nepakankamas.
Nuo seno tradicinėje medicinoje yra naudojami naftochinonai, kurie turi platų panaudojimą bei pasižymi plačiu fiziologiniu poveikiu: antimikrobiniu, antigrybeliniu, antivirusiniu bei antivėžiniu.
Šiame darbe buvo tirtas naftochinonų (juglono, menadiono, plumbagino ir lavsono) poveikis mitochondrijų funkcijoms. Gauti rezultatai parodė, jog visi ištirti naftochinonai veikia mitochondrijų kvėpavimą bei jį stimuliuoja. Iš atliktų tyrimų galima teigti, jog lavsono oksidacijos bei fosforilinimo procesų atskyrimas yra mažesnis palyginus su kitais tirtais naftochinonais. Yra manoma, jog nedidelis oksidacijos bei fosforilinimo procesų atskyrimas yra naudingas ląstelei, apsaugant mitochondrijas nuo žalingo poveikio.[44] Yra žinoma, jog oksidacijos bei fosforilinimo procesų atskyrikliai sumažina membraninį potencialą ir vandenilio peroksido susidarymą mitochondrijose.[44] Caldeira da Silva kartu su kitais mokslininkais ištyrė, jog nedideli skyriklio kiekiai padidina kvėpavimo greitį, sumažina ROS gamybą. [45]
Yra žinoma, kad padidėjus vidinės mitochondrijų membranos pralaidumui, sumažėja membraninis potencialas ir lėtėja ATP-sintazės aktyvumas. Taip veikia klasikiniai skyrikliai (dinitrofenolis) arba medžiagos, kurios gali veikti kaip protonoforai, t.y. stimuliuoja mitochondrijų kvėpavimą antrojoje metabolinėje būsenoje ir stabdo ATP sintezę. Taigi didelis mitochondrijų oksidacijos bei fosforilinimo procesų atskyrimas turi neigiamą poveikį ląstelei. Tokiu poveikiu pasižymi plumbaginas, kuris tiek substratais stimuliuotą mitochondrijų kvėpavimo greitį, tiek oksidacinio fosforilinimo greitį didina panaudojus pačias mažiausias koncentracijas, o panaudojus 3,5 µM ir didesnes koncentacijas maksimaliai atskiria mitochondrijų oksidacijos bei fosforilinimo procesus. Šiek tiek silpnesniu atskiriančiu poveikiu pasižymi juglonas bei menadionas.
B. Eldhose ir kiti atliko tyrimus bei stebėjo plumbagino proapoptozinį ir citotoksinį poveikį žmogaus storosios žarnos vėžio HCT116 ląstelėse. Jie nustatė, jog plumbaginas sumažina HCT116 ląstelių gyvybingumą bei generuoja ROS susidarymą, taip sukeldamas apoptozę.[46]
S. Fiorito ir kiti nustatė, jog plumbagino bei juglono dariniai šoninėse grandinėse, turintys esterio ar eterio grupes, yra stipriau veikiantys ląstelių inhibavimą nei natūralūs jų dariniai. Taip pat yra nustatyta, jog juglonas bei plumbaginas veikia citostatiškai U373 ląstelių.[47]
J. Wu bei kiti mokslininkai ištyrė, jog juglonas gali inhibuoti ląstelių proliferaciją, sumažindamas jų gyvybingumą bei sukeldamas apoptozę. Taip pat nustatyta, jog juglonas generuoja ROS gamybą. Juglonas taipogi gali supresuoti auglio augimą in vivo bei padidinti U87 ląstelių išgyvenamumą lyginant su kontroliniais tyrimais.[48]
Taip pat yra ištirta, jog menadionas pasižymi stipresniu poveikiu nei vitaminas K2 bei gali
inhibuoti vėžinių ląstelių augimą. Yra manoma, jog ateityje menadionas gali būti naudojamas kaip naujas antivėžinis preparatas.[49]
Išvados
1. Tirtasis juglonas, jo koncentracijoms esant 0,5-5,5 µM, substratais stimuliuotą mitochondrijų, esančių C6 ląstelėse, kvėpavimo greitį didina 57-105 %, o 5,5 µM ir didesnės juglono koncentracijos mitochondrijų oksidacijos ir fosforilinimo procesus atskiria maksimaliai.
2. Lavsonas, naudojamas 10-195 µM koncentacijomis, didina substratais stimuliuotą mitochondrijų kvėpavimą bei oksidacinio fosforilinimo greitį, tačiau oksidacijos bei fosforilinimo procesų pilnai neatskiria.
3. Plumbaginas, naudojamas 0,5-3,5 µM koncentracijomis, didina substratais stimuliuotą mitochondrijų kvėpavimo greitį 129-223 %. Didesnės plumbagino koncentracijos atskiria mitochondrijų oksidacijos ir fosforilinimo procesus. 1 µM ir didesnės koncentracijos pilnai atskiria mitochondrijų procesus, veikiant į VADP ir padidina mitochondrijų kvėpavimo greitį 48
%.
4. Menadionas, naudojamas 0,5-5,5 µM koncentracijomis, didina substratais stimuliuotą mitochondrijų kvėpavimo greitį 34-150 %, o didesnės koncentracijos visiškai atskiria mitochondrijų oksidacijos ir fosforilinimo procesus. Veikiant į VADP, maksimalus mitochondrijų
Praktinės rekomendacijos
Tolimesniuose tyrimuose būtų naudinga iki galo išsiaiškinti 1,4-naftochinonų veikimo mechanizmus. Reikėtų tęsti ne tik ištirtų naftochinonų (lavosno, plumbagino, menadiono, juglono) tyrimus, bet ir ieškoti ir ištirti naujus 1,4-naftochinonus, atsižvelgiant į jų savybes.
Literatūros sąrašas
1. Fontanesi, F. Mitochondria: structure and role in respiration. In eLS (2001). Jogn Wiley & Sons, Ltd; 2001. 1-13
2. Didžiulytė A. Kvercetino ir jo glikozidų poveikis žiurkės inkstų mitochondrijų kvėpavimui. Diss. Lithuanian University of Health Sciences, 2014
3. Chao T, Wang H, Ho P-C. Mitochondrial control and guidance of cellular activities of T cells. Front Immunol. 2017;8:473.
4. Sirey TM, Ponting CP. Insights into the post-transcriptional regulation of the mitochondrial electron transport chain. Biochem Soc Trans. 2016 Oct 15;44(5):1491-8
5. Althoff T, Mills DJ, Popot J-L, Kühlbrandt W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I, III, IV. EMBO J. 2011 Nov 16;30(22): 4652–4664
6. Bratic I, Trifunovic A. Mitochondrial energy metabolism and ageing. Biochim Biophys Acta BBA – Bioenerg. 2010 Jun 1;1797(7):961-7
7. Weston LA, Mathesius U. Flavonoids: their structure, biosynthesis and role in the rhizosphere, including allelopathy. J Chem Ecol. 2013 feb 1;39(2):283-97
8. Trumbeckaite S, Bernatoniene J, Majiene D, Jakstas V, Savickas A, Toleikis A. The effect of flavonoids on rat heart mitochondrial function. Biomed Pharmacother. 2006 Jun;60)5):245-8 9. Sidlauskas K, Sidlauskiene R, Li N, Liobikas J. 5-Hydroxy-1,4-naphthalenedione exerts
anticancer effects on glioma cells through interaction with the mitochondrial electron transport chain. Neurosci Lett. 2017 Feb 3;639:207-214
10. Rubio-Osornio M, Orozco-Ibarra M, Diaz-Ruiz A, Brambila E, Boll M-C, Monroy-Noyola A, et al. Copper sulfate pretreatment prevents mitochondrial electron transport chain damage and apoptosis against MPP+-induced neurotoxicity. Chem Biol Interact. 2017 Jun 1;271:1-8 11. Murphy MP. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 2009 Jan
1;417(1):1-13
12. Pelicano H, Martin DS, Xu R-H, Huang P. Glycolysis inhibition for anticancer treatment Oncogene. 2006;25(34):4633-46
13. Brandon M, Baldi P, Wallace DC. Mitochondrial mutations in cancer Oncogene. 2006;25(34):4647-62
14. Chatterjee A, Mambo E, Sidransky D. Mitochondrial DNA mutations in human cancer. Oncogene. 2006;25(34):4663-74
15. King A, Selak MA, Gottlieb E. Succinate dehydrogenase and fumarate hydratase: linking mitochondrial dysfunction and cancer. Oncogene. 2006;25(34):4675-82
16. Robey RB, Hay N., Mitochondrial hexokinases, novel mediators of the antiapoptotic effects of growth factors and Akt. Oncogene. 2006;25(34):4683-96
17. Kim J, Dang CV. Cancer's molecular sweet tooth and the Warburg effect. Cancer Res. 2006 Sep 15;66(18):8927-30
18. Gogvadze V, Zhivotovsky B, Orrenius S. The Warburg effect and mitochondrial stability in cancer cells. Mol Aspects Med. 2010 Feb;31(1):60-74
19. Meadows AA of NS 5550 MD-R. The American Association of Neurological Surgeons [Prieiga per internetą]. [cituojama pagal 2015 m. gruodžio 14 d.]. Gauta: https://www.aans.org
20. Vaverkova V, Vrana O, Adam V, Pekarek T, Jampilek J, Babula P. The study of
naphthoquinones and their complexes with DNA by using Raman spectroscopy and surface enhanced Raman spectroscopy: new insight into interactions of DNA with plant secondary metabolites. BioMed Res Int. 2014 Jun 22;2014:e461393
21. Babula P, Adam V, Havel L, Kizek R. Noteworthy secondary metabolites naphthoquinones - their occurrence, pharmacological properties and analysis. Current Pharmaceutical
Analysis. 2009 Feb 1;5(1):47-68
22. Castro FAV, Mariani D, Panek AD, Eleutherio ECA, Pereira MD. Cytotoxicity mechanism of two naphthoquinones (menadione and plumbagin) in Saccharomyces cerevisiae. PLOS ONE. 2008 Dec 22;3(12):e3999
23. Jamal MS, Parveen S, Beg MA, Suhail M, Chaudhary AGA, Damanhouri GA, et al. Anticancer compound plumbagin and its molecular targets: a structural insight into the inhibitory mechanisms using computational approaches. PLOS ONE. 2014 Feb 27;9(2):e87309
24. Manu KA, Shanmugam MK, Rajendran P, Li F, Ramachandran L, Hay HS, et al. Plumbagin inhibits invasion and migration of breast and gastric cancer cells by downregulating the expression of chemokine receptor CXCR4. Mol Cancer. 2011;10:107
25. Yan W, Wang T, Fan Q, Du L, Xu J, Zhai Z, et al. Plumbagin attenuates cancer cell growth and osteoclast formation in the bone microenvironment of mice. Acta Pharmacol Sin. 2014 Jan;35(1):124-34
26. Lee J-H, Yeon J-H, Kim H, Roh W, Chae J, Park H-O, et al. The natural anticancer agent plumbagin induces potent cytotoxicity in MCF-7 human breast cancer cells by inhibiting a PI-5 kinase for ROS generation. PLOS ONE. 2012 Sep 13;7(9):e45023
