FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
EGLĖ VENCKUTĖ
1,4-NAFTOCHINONO DARINIŲ POVEIKIO EKSTRALĄSTELINIŲ
BEI VIDULĄSTELINIŲ ROS KONCENTRACIJAI
GLIOBLASTOMOS C6 LĄSTELĖSE TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė: Prof. dr. Daiva Majienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data:
1,4-NAFTOCHINONO DARINIŲ POVEIKIO EKSTRALĄSTELINIŲ
BEI VIDULĄSTELINIŲ ROS KONCENTRACIJAI
GLIOBLASTOMOS C6 LĄSTELĖSE TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Prof. dr. Daiva Majienė
Data Darbą atliko: Magistrantė Eglė Venckutė Data Recenzentas ... Data KAUNAS, 2017
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 SANTRUMPOS ... 6 ĮVADAS ... 7 DARBO TIKSLAS ... 7 DARBO UŽDAVINIAI ... 7 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 8 1.1. Chinonai ir jų dariniai ... 81.2. Naftochinonų biologinis veikimas ... 9
1.2.1. Menadionas ... 10
1.2.2. Juglonas ... 12
1.2.3. Plumbaginas ... 13
1.2.4. Lavsonas ... 15
1.3. ROS vaidmuo ląstelių apoptoziniuose mechanizmuose ... 16
1.4. Glioblastoma ... 16
2. TYRIMO METODIKA ... 17
2.1. Naudotos medžiagos ... 17
2.2. Naudota aparatūra ... 18
2.3. Vandenilio peroksido koncentracijos nustatymas fluorimetriniu metodu ... 18
2.4. Ląstelių auginimo metodika ... 19
2.5. Ląstelių tankio apskaičiavimas ... 19
2.6. Viduląstelinių ROS koncentracijos nustatymas fluorimetriniu metodu ... 19
2.7. Superoksido koncentracijos mitochondrijose nustatymas fluorescenciniu metodu ... 20
2.8. Statistinė duomenų analizė ... 21
3. REZULTATAI ... 21
3.1. 1,4-naftochinono darinių poveikis ekstraląstelinei vandenilio peroksido koncentracijai ... 21
3.2. 1,4-naftochinono darinių poveikis viduląstelinei ROS koncentracijai ... 24
3.3. 1,4-naftochinono darinių poveikis mitochondrijų superoksido koncentracijai ... 29
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 33
IŠVADOS ... 36
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 37
SANTRAUKA
1,4-NAFTOCHINONO DARINIŲ POVEIKIO EKSTRALĄSTELINIŲ BEI VIDULĄSTELINIŲ ROS KONCENTRACIJAI GLIOBLASTOMOS C6 LĄSTELĖSE TYRIMAS
E. Venckutės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė prof. dr. D. Majienė;
Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra. - Kaunas.
Raktiniai žodžiai: 1,4-naftochinonai, juglonas, plumbaginas, menadionas, lavsonas, antioksidantai,
prooksidantai, ROS, C6 ląstelių kultūra.
Tyrimo tikslas – ištirti ir palyginti 1,4-naftochinono darinių - menadiono, juglono, plumbagino,
lavsono – poveikį ekstraląstelinių bei viduląstelinių ROS koncentracijai glioblastomos C6 ląstelėse.
Metodai: Vandenilio peroksido koncentracija nustatyta fluorimetriniu metodu, naudojant AmplexRed
dažą; viduląstelinių ROS koncentracija nustatyta fluorimetriniu metodu, naudojant DCF-DA dažą; superoksido koncentracija įvertinta fluorescenciniu metodu, pritaikant MitoSox Red dažą.
Tyrimų uždaviniai:
1. Nustatyti ir palyginti tiriamų 1,4-naftochinono darinių skirtingų koncentracijų gebėjimą neutralizuoti ir generuoti vandenilio peroksidą .
2. Nustatyti ir palyginti 1,4-naftochinono darinių skirtingų koncentracijų poveikį viduląstelinių ROS koncentracijai.
3. Nustatyti ir palyginti 1,4-naftochinono darinių skirtingų koncentracijų poveikį mitochondrijų superoksido koncentracijai.
Tyrimų rezultatai: Nustatytos H2O2 neutralizuojančios koncentracijos: plumbaginas – 1 μM, menadionas – 1-4 μM, lavsonas - 75-2000 μM; H2O2 generaciją didinančios koncentracijos: juglonas – 4-64 μM, plumbaginas – 12,5-18 μM, menadionas – 15-25 μM.
Nustatytos ROS koncentraciją glioblastomos C6 ląstelėse mažinančios koncentracijos: plumbaginas ̶ 1-3 μM, menadionas – 1-4 μM, lavsonas - 25-2000 μM; ROS kiekį didinančios koncentracijos: plumbaginas ̶ 8-18 μM, menadionas – 8-25 μM, juglonas - 4-64 μM.
Nustatytos mitochondrijų superoksido kiekį mažinančios koncentracijos: menadionas – 1-3 μM, lavsonas – 10-50 μM; superoksido kiekį didinančios koncentracijos: juglonas – 2-64 μM, plumbaginas ̶ 5-18 μM, menadionas – 7-25 μM, lavsonas – 1500-2000 μM.
Išvados: Juglonas pasižymi prooksidacinėmis savybėmis, menadionas bei plumbaginas gali veikti
kaip antioksidantai arba prooksidantai, priklausomai nuo koncentracijos, tuo tarpu lavsonas pasižymi stipriausiomis antioksidacinėmis savybėmis.
SUMMARY
THE INVESTIGATION OF 1,4 – NAPHTHOQUINONE DERIVATIVES EFFECT ON EXTRACELLULAR AND INTRACELLULAR ROS CONCENTRATION IN GLIOBLASTOMA C6 CELLS
E. Venckutė master thesis/ Scientific supervisor prof. dr. D. Majienė;
Lithuanian University of Health Sciences, Department of Pharmaceutical Technology and Social Pharmacy. – Kaunas.
Key words: 1,4 - naphthoquinones, juglone, plumbagin, menadione, lawsone, antioxidant, prooxidant,
ROS, C6 cell culture.
The aim of research – to investigate and compare the effect of 1,4-naphthoquinone derivates,
juglone, plumbagin, menadione, lawsone, on extracellular and intracellular ROS concentration in glioblastoma C6 cells.
Methods: Fluorometric assay using AmplexRed dye to evaluate the extracellular H2O2 concentration; and using DCF-DA dye to evaluate the intracellular ROS concentration; measurement of the mitochondrial superoxide concentration by using fluorescent method and specific dye MitoSox Red.
Tasks of the study:
1. To investigate and compare the effect of different concentrations of 1,4-naphthoquinone derivatives on neutralization and generation of H2O2.
2. To investigate and compare the effect of different concentrations of 1,4-naphthoquinone derivatives on intracellular ROS concentration.
3. To investigate and compare the effect of different concentrations of 1,4-naphthoquinone derivatives on mitochondrial superoxide concentration.
Results: Concentrations that have H2O2 neutralizing effect are: plumbagin - 1 μM, menadione - 1-4 μM, lawsone - 75-2000 μM; concentrations that have H2O2 concentration increasing effect are: juglone - 4-64 μM, plumbagin - 12,5-18 μM, menadione - 15-25 μM.
Concentrations that have ROS concentration decreasing effect in glioblastoma C6 cells are: plumbagin ̶ 1-3 μM, menadione – 1-4 μM, lawsone - 25-2000 μM. Concentrations that have ROS concentration increasing effect are: plumbagin ̶ 8-18 μM, menadione – 8-25 μM, juglone - 4-64 μM.
It was determined that 1-3 μM of menadione and 10-50 μM of lawsone have a mitochondrial superoxide concentration decreasing effect, while 2-64 μM of juglone, 5-18 μM of plumbagin, 7-25 μM of menadione and 1500-2000 μM of lawsone have a mitochondrial superoxide concentration increasing effect.
Conclusions: Juglone acts as a prooxidant, menadione and plumbagin act as antioxidants or
prooxidants in the concentration depending manner while lawsone has shown the strongest antioxidant properties.
SANTRUMPOS
BHT – dibutilhidroksitoluenasDCF-DA – dažas 2,7-dichlorofluorescindiacetatas DMEM – ląstelių augimo terpė
DMSO – tirpiklis dimetilsulfoksidas
EC50 – pusė (50%) maksimalios efektyvios tiriamosios medžiagos koncentracijos FBS – fetalinis veršelio serumas
GSH – glutationas
GPx – glutationo peroksidazė Grx2 – glutaredoksinas-2
HBSS – buferinė sistema (angl. Hanks’ balanced salt solution) HPR – fermentas krienų peroksidazė
IC50 – inhibitoriaus koncentracija, sukelianti pusės (50 proc.) ląstelių biologinių ar biocheminių funkcijų netekimą (angl. inhibitory concentration)
MDR – transmembraninis daugiavaisčio atsparumo nešiklis (angl. multidrug resistance protein) NADH – redukuotas nikotinamido adenino dinukleotidas
NADPH – redukuotas nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas NF-κB – branduolio faktorius kappa B
NQO1 – NAD(P)H:chinono oksireduktazė-1
ROS – reaktyviosios deguonies formos (angl. reactive oxygen species) SOD – superoksido dismutazė
TNF-α – naviko nekrozės faktorius
Trx2/TrxR2/Prx – tioredoksino/tioredoksino reduktazės/peroksiredoksino reduktazės sistema μM – mikromolis/-iai
ĮVADAS
1,4-naftochinonai - plačiai gamtoje paplitę junginiai, aptinkami kaip antriniai augalų metabolitai Plumbaginace, Lythraceae, Juglandaceae ir kitų šeimų augalų rūšyse [7], dar vadinami augalų gynybiniais komponentais [13], taip pat sintezuojami bakterijų ar grybelių [26]. Nors liaudies medicinoje dėl savo gydomųjų savybių šie junginiai naudojami nuo seno [77, 70], tačiau moksliniai tyrimai, siekiant įvertinti jų biologinį poveikį, intensyviai atliekami tik pastaraisiais dešimtmečiais.
Šiuo metu yra žinoma, jog 1,4-naftochinonų atstovai pasižymi priešuždegiminiu [35], priešgrybeliniu [21], antibakteriniu [67], antiparazitiniu [41], priešvirusiniu [57], antioksidaciniu [84] poveikiais. Taip pat yra nustatytas jų priešvėžinis veikimas tyrimuose su įvairiomis ląstelių linijomis, tarp kurių yra odos, krūties, prostatos, kasos, plaučių [66], kepenų, šlapimo pūslės [52], taip pat ir glioblastomos vėžinės ląstalės [1], pasižyminčios dideliu atsparumu priešnavikiniams vaistams [59]. Tačiau mokslininkai dar nėra nustatę tikslaus 1,4-naftochinonų veikimo mechanizmo, o kaip pagrindinė jų biologinį poveikį nulemianti priežastis yra įvardijamas jų gebėjimas generuoti reaktyviąsias deguonies formas (ROS).
Remiantis literatūros duomenimis bei anksčiau LSMU universitete atliktais tyrimais, šiame darbe bus toliau nagrinėjamas keturių 1,4-naftochinono atstovų - menadiono, juglono, plumbagino, lavsono – poveikis, t.y. aktyvumas neutralizuojant ar generuojant H2O2 bei gebėjimas generuoti viduląstelines ROS žiurkių glioblastomos C6 ląstelių linijoje, siekiant sužinoti, ar citotoksinis šių junginių aktyvumas gali būti siejamas su ROS padidėjimų.
Šio darbo tikslas yra ištirti ir palyginti 1,4-naftochinono darinių - menadiono, juglono, plumbagino, lavsono – poveikį ekstraląstelinių bei viduląstelinių ROS koncentracijai glioblastomos C6 ląstelėse.
DARBO TIKSLAS
Ištirti ir palyginti 1,4-naftochinono darinių - menadiono, juglono, plumbagino, lavsono – poveikį ekstraląstelinių bei viduląstelinių ROS koncentracijai glioblastomos C6 ląstelėse.
DARBO UŽDAVINIAI
1. Nustatyti ir palyginti tiriamų 1,4-naftochinono darinių skirtingų koncentracijų gebėjimą neutralizuoti ir generuoti vandenilio peroksidą.
2. Nustatyti ir palyginti 1,4-naftochinono darinių skirtingų koncentracijų poveikį viduląstelinių ROS koncentracijai.
3. Nustatyti ir palyginti 1,4-naftochinono darinių skirtingų koncentracijų poveikį mitochondrijų superoksido koncentracijai.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Chinonai ir jų dariniai
Chinonai – plačiai paplitę junginiai, randami augaluose, grybeliuose ir bakterijose [58]. Struktūriškai apima pigmentus, antibiotikus, vitaminą K, kofermentus [17]. Yra žinoma, kad chinonų dariniai pasižymi antioksidaciniu, priešuždegiminiu, antibakteriniu, priešvėžiniu, priešgrybeliniu poveikiu [66]. Šios grupės atstovai jau nemažai metų naudojami medicinoje, o kai kurie junginiai yra potencialūs vaistai: tuberkuliozei gydyti naudojami rifamicino grupės antibiotikai [71], chemoterapijai yra pritaikomi antrachinonai dokso- ir daunorubicinas, mitomicinai [66], lapacholis, α- ir β- lapachonai kai kurių tyrimų metu parodė stipresni poveiki už jau naudojamus vaistus tripanosomozei gydyti – benznidazolą ir nitrofuraną [74].
1,4-naftochinonai (1 pav.) - tai gerai žinomi chinonų grupės atstovai, plačiai gamtoje paplitę junginiai, aptinkami Plumbaginace, Lythraceae, Juglandaceae, Droseraceae, Ebenceae ir kitų šeimų augalų rūšyse [7, 66]. 1,4-naftochinono farmakoforas yra gerai žinomas dėl savo svarbos tokių vaistų kaip streptonigrinas, aktinomicinas, mitomicinas priešvėžiniam poveikiui [82]. Todėl ir šiuo metu atliekama daug tyrimų su naftochinonų dariniais, kaip potencialiai aktyviomis molekulėmis.
1 pav. 1,4-naftochinonai. 1 – 1,4-naftochinonas; 2 – juglonas; 3 – lavsonas; 4 – menadionas; 5 – plumbaginas 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1
1.2. Naftochinonų biologinis veikimas
Šiuo metu tikslus naftochinonų veikimo mechanizmas nėra žinomas, tyrimai bandant jį išsiaiškinti vis dar atliekami. Kaip pagrindinis naftochinonų biologinį aktyvumą nulemiantis veiksnys yra įvardijamas jų gebėjimas redukuotis biologinėse sistemose iki semichinonų [30]. Naftochinono molekulei redukavusis, vyksta reakcijos produkto oksidacija bei susidaro ROS [42] (2 pav.), kurioms priskiriamas superoksido anijonas (O2.−), vandenilio peroksidas (H2O2), hidroksilo radikalas (.OH), vienatomis deguonis (O) [53]. Ląstelėse superoksido anijonas dalyvauja disproporcionavimo reakcijoje, kurios metu išsiskiria vandenilio peroksidas bei vanduo. Tuomet superoksido anijonas gali reaguoti su vandenilio peroksidu, dalyvaujant geležies, vario jonams, ir susidaro dar pavojingesni hidroksilo ir vienatomio deguonies radikalai. Ląstelės viduląstelinei ir ekstraląstelinei antioksidacinei sistemai nepajėgiant neutralizuoti sugeneruotų ROS, pažeidžiama DNR, baltymai, dėl vykstančios lipidų peroksidacijos pažeidžiamos ląstelės membranos [30].
Žinoma, jog žinduolių ląstelėse naftochinonų redukcijoje turėtų būti naudojamas redukuotas nikotinamido adenino dinukleotidas (NADH) ar redukuotas nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas (NADPH), dalyvaujant tam tikriems fermentams. Šis procesas gali vykti dviem būdais: paprastosios vieno elektrono redukcijos, dalyvaujant, pavyzdžiui, citochromo P450 reduktazei [72] arba vykstant dviejų elektronų redukcijai, dalyvaujant NAD(P)H:chinono oksireduktazei-1 (NQO1) [24]. Įvykus naftochinonų redukcijai, jie toliau gali dalyvauti II fazės metabolizme ir būti šalinami, tačiau po I fazės redukcijos reakcijų naftochinonai išlieka nestabilūs, dėl ko vyksta ROS generacija [65].
2 pav. 1,4-Naftochinono redukcija ir produktų oksidacija
Taip pat naftochinonai gali dalyvauti reakcijose su nukleofilais. Šiuo atveju svarbus nukleofilas yra glutationas (GSH) – svarbi ląstelės antioksidacinės sistemos dalis [32]. Tačiau tai, ar reakcija su nukleofilu įvyksta, gali priklausyti nuo molekulės pakaitų. 1,4-naftochinonų atveju, C-2 padėtyje esantis pakaitas gali daryti įtaką nukleofilo prisijungimui C-3 padėtyje: metilo grupė – reakcijai netrukdo, hidroksi grupė – reakciją apsunkina [44, 22]. Tačiau kaip ir redukcijos reakcijų eigoje, naftochinonų jungimosi su nukleofilais reakcijų metu gali susidaryti aktyvūs deguonies
e- e-
O2 O2
junginiai, inicijuojantys grandinines reakcijas [45]. Tokiu būdu sukeliamas oksidacinis stresas, nes pažeidžiama ląstelės redoksi homeostazė [60].
Šiuo metu jau yra surinkta nemažai duomenų, kaip naftochinonų gebėjimas redukuotis ir dalyvauti reakcijose su nukleofilais paveikia ląstelių fermentines, signalines sistemas. Tyrimo su HaCaT keratocitų linija metu nustatytas ryšys tarp glutationo atsargų išeikvojimo ir superoksido koncentracijos didinimo bei ErbB receptorių šeimos tirozino kinazės stimuliavimo, dėl ko blokuojamos proteino tirozino fosfatazės, kurios yra svarbios ląstelių augimui, proliferacijai, diferenciacijai [44]. Taip pat yra duomenų apie 1,4-naftochinono menadiono geba sutrikdyti tarpląstelinį komunikavimą [46]. Tyrimuose su žmogaus ūminės mieloidinės leukemijos ląstelėmis KBM-5 metu nustatyta, jog plumbaginas geba slopinti nuo branduolio faktoriaus kappa B (NF-κB) priklausančių baltymų, dalyvaujančių ląstelės proliferacijoje ir prieš-apoptoziniuose mechanizmuose, ekspresiją [75].
Tačiau yra duomenų, rodančių, kad kai kurie naftochinonai gali turėti ir teigiamą poveikį ląstelėms. Junginiai, pasižymintis elektrofilinėmis savybėmis, didina NQO1 ekspresiją ląstelėse [81, 91]. Taip pat kai kurie naftochinonai stimuliuoja nuo Nrf2 transkripcijos faktoriaus priklausančią genų ekspresiją, kuri sukelia baltymų, dalyvaujančių glutationo ar NQO1 biosintezėje, kiekio padidėjimą bei antioksidacinės ląstelės sistemos pajėgumo didėjimą. Tyrimų metu įrodyta, jog mažomis plumbagino dozėmis paveiktų C. elegans gyvenimo trukmė ilgėjo [33, 78].
Yra žinoma ir apie antioksidacinį naftochinonų poveikį. Yra duomenų apie jų gebėjimą neutralizuoti hidroksilo bei superoksido radikalus in vitro, taip pat rodyta, kad šis poveikis yra stipresnis nei kai kurių sintetinių antioksidantų [49, 83].
Dėl šių antioksidacinių/prooksidacinių savybių bei sukeliamo biologinio poveikio, įvairūs naftochinonų atstovai išlieka mokslininkams įdomūs junginiai, dažnai naudojami tyrimuose su įvairiomis vėžinių ląstelių linijomis.
1.2.1 Menadionas
Cheminis šio junginio pavadinimas yra 2-metil-1,4-naftochinonas (1 pav.). Šis junginys dar gerai žinomas kaip vitamino K vitameras, kuris būtinas kraujo krešėjimui, svarbus baltymų, dalyvaujančių protrombino virsme į trombiną, karboksilinimui [29]. Visos vitamino K formos yra 2-metil-1,4-naftochinono dariniai: filochinonas arba vit. K1 yra augaluose sintezuojama vitamino forma, menachinonas arba vit. K2 – sintezuojamas bakterijų, bei menadionas (2-metil-1,4-naftochinonas) arba vit. K3 – sintetinis junginys. Be jau seniai atrasto poveikio kraujo krešėjimui, šiuo metu taip pat yra žinoma apie šio vitamino dalyvavimą procesuose, susijusiuose su kaulų kalcifikacija, endokrininės sistemos veikla, viduląstelinių signalų perdavimu bei poveikiu nervų sistemai, uždegiminiams
procesams [26], taip pat yra tyrimų, rodančių menadiono antiparazitinį [41], priešvėžinį poveikį prieš kepenų, krūties, kraujo, šlapimo pūslės, burnos vėžio ląstelių linijas [52].
Šiuo metu, dėl savo įvairaus biologinio poveikio, menadionas yra gana plačiai tiriamas junginys, siekiama geriau suprasti jo veikimo mechanizmą, kuris dažniausiai siejamas su menadiono gebėjimu sukelti oksidacinį stresą. Tyrimo su viščiuko embriono kardiomiocitais metu prooksidacinės menadiono savybės įrodytos pritaikius fluorescuojantį reagentą - baltymą, jautrų redoksi reakcijoms (RoGFP). Normaliomis sąlygomis šio junginio vidutinė oksidacija ląstelėje siekia 20-30 %, o paveikus 25 μmol koncentracijos menadionu po 15 min. oksiduoto RoGFP kiekis pasiekė 74 %. To paties tyrimo metu taip pat nustatyta, jog 25 μM koncentracijos menadionas po 6 h nužudė beveik 60 % ląstelių, o 20 μM – beveik 45 % ląstelių [55]. Tyrimo su kiaušidžių karcinomos ląstelių linija metu buvo nustatyta, jog 7,5 μM koncentracijos menadionas, po 24 h inkubacijos, daugiau negu dvigubai didina ROS kiekį ląstelėje, lyginant su kontrole, bei 50 % mažina ląstelių gyvybingumą. Taip pat nustatyta, jog 2,5-15 μM koncentracijos menadionas taip pat reikšmingai sumažino glutationo atsargas ląstelėje, be šių poveikių buvo nustatytas ir ląstelių migraciją bei adheziją stabdantis efektas [43]. Kito tyrimo metu, pritaikant D. rerio embriono modelį, buvo nustatytas reikšmingas endogeninių ROS padidėjimas po to, kai embrionai 60 min. buvo veikiami 3 μM koncentracijos menadioniu, kas taip pat sukėlė laikiną ar ilgalaikį vystymosi sutrikimą [10]. Menadiono ROS generaciją skatinantis, glutationo atsargas išeikvojantis bei citotoksinis poveikis buvo nustatytas ir tyrimuose su žmogaus keratinocitų linija HaCaT, kurių metu naudotos 5-50 μM menadiono koncentracijos [44].
Taip pat yra tirtas menadiono veikimas prieš C. Albicans: 400-500 μM menadionas turėjo reikšmingą priešgrybelinį veikimą, o 500 μM menadionas derinyje su 200 arba 400 μM betametazono visiškai sustabdė grybelio augimą. Taip pat buvo išmatuotas ir viduląstelinių ROS kiekis grybelyje – 1,5 mM menadionas po 2 h daugiau negu dvigubai didino jų kiekį ląstelėse, o 200 bei 400 μM betametazonas ROS kiekį didino nereikšmingai. Menadiono ir betametazono derinys pristatytas kaip galimas naujas grybelio sukeltos infekcijos terapijos būdas [36].
Taip pat skelbiama ir apie galimą menadiono naudojimą derinyje su vit. C, kuris šiuo atveju veiktų kaip menadioną redukuojantis junginys. Tai patvirtinta tyrimai su žmogaus gliomos DBTRG.05MG ląstelių linija bei krūties vėžio MCF7 ląstelėmis, kurių metu buvo nustatyta, jog menadiono ir vit. C derinys veikia geriau negu abi medžiagos atskirai – reikalingos 2,5-5 kartus mažesnės koncentracijos [86, 8].
Nors vyrauja informacija apie menadiono prooksidacines savybes, galima aptikti tyrimų, kurie rodo, jog menadionas gali veikti ir kaip antioksidantas. Yra duomenų, rodančių, jog menadionas
in vitro gebėjo surišti 23 % hidroksilo radikalų (tai buvo nustatyta matuojant susidariusio
malondialdehido kiekį), ir 30 % viduląstelinių superoksido radikalų (nustatyta, atliekant nitro mėlynojo tetrazolo kiekio nustatymą), esant ≥ 120 μmol koncentracijai [49]. Taip pat galima rasti
duomenų, jog 7,4 μmol koncentracijos redukuotas menadionas yra panašaus stiprumo antioksidantas kaip 7 μmol α-tokoferolis, matuojant antioksidacinį poveikį tirpaluose ir membranų modeliuose [27].
1.2.2 Juglonas
Juglonas (5-hidroksi-1,4-naftochinonas) yra natūralus 1,4-naftochinonų grupės atstovas (1 pav.), aptinkamas riešutmedinių (lot. Juglandaceae) šeimos augalų (pvz. Juglands mandshurica,
Junglans nigra, Junglans regia, Junglans cinerea, Juglans nigra) šaknyse, lapuose, riešutų
kevaluose, medienoje ir žievėje [38]. Taip pat yra duomenų apie juglono išskyrimą iš Proteacea,
Caesalpiniaceae, Fabaceae šeimų augalų, tačiau daugiausia juglono kaupia juodasis riešutmedis (lot. Juglans nigra), Juglandaceae šeimos atstovas [79].
Jau prieš daugelį šimtų metų žmonės pastebėjo riešutmedžio neigiamą poveikį aplinkui augantiems augalams. Tradicinėje medicinoje riešutmedis buvo naudojamas atsikratyti parazitų, grybelio, žaizdų ir įvairių odos lygų gydymui [79]. Indų, graikų ir arabų kultūrose jis buvo pritaikomas vėžio gydymui [77]. Galima rasti duomenų apie riešutmedžio ekstrakto sutraukiantį, keratolitinį, taip pat diuretinį bei laisvinantį [79], antimikrobinį [15], antihemoraginį [20], hipoglikeminį [64], priešvirusinį [57] poveikius.
Dėl plataus riešutmedžio ekstraktų biologinio poveikio, juglonas buvo ir vis dar yra plačiai tyrinėjamas junginys, tiriamas jo poveikis įvairioms vėžinių ląstelių linijoms, galimi veikimo mechanizmai. Tyrimo su žmogaus leukemijos HL-60 ląstelių linija metu buvo nustatyta, jog ląstelių proliferaciją stabdanti koncentracija yra ~ IC50 8 μM; 2 μM, 4 μM ir 8 μM koncentracijos juglonas, po 24 h inkubacijos viduląstelinių ROS kiekį didino atitinkamai 2,4; 3,5; 8,4 kartus, lyginant su kontrole, taip pat nustatyta, jog šios koncentracijos reikšmingai sumažino ląstelių glutationo atsargas, o tuo tarpu antioksidanto N-acetilcisteino pridėjimas panaikino juglono ląstelių žūtį sukeliantį poveikį, kas įrodo prooksidacinių juglono savybių svarbą jo veikimo prieš vėžines ląsteles mechanizmui. Taip pat nustatytas baltymų, proteinkinazės B ir mTOR, sumažėjimas ląstelėse, paveiktose juglono, kurie svarbūs ląstelės gynybiniams mechanizmams [90]. Tyrimų su pelių melanomos B16F1 ląstelių linija metu nustatytos IC50 koncentracijos: paveikus ląsteles juglonu 1 h – 9,9 μM; paveikus 1 h ir inkubavus 24 h – 7,74 μM; paveikus 24 h – 7,46 μM; paveikus 48 h – 6,92 μM. Taip pat buvo nustatyta, jog ląsteles 1 h paveikus 2,5; 5; 7,5 ir 10 μM koncentracijų juglonu ROS koncentracijos atitinkamai išaugo 2,54; 4,71; 8,32; 10,12 karto, lyginant su kontrole, bei nustatytas juglono ląstelės glutationo atsargas mažinantis efektas [3]. Tyrimų su žmogaus krūties vėžio MCF-7 ląstelėmis metu buvo nustatyta, jog IC50 po 24 h yra 11,99 μM, taip pat juglonas reikšmingai didino viduląstelinių ROS kiekį, mažino mitochondrijų membranų potencialą ir didino viduląstelinių Ca2+ kiekį, sukėlė citochromo C atpalaidavimą į citoplazmą, mažino antiapoptoziškai veikiančio baltymo Bcl-2 ekspresiją ir sukėlė
kaspazės-3 aktyvinimą [39]. Tyrimuose su žmogaus šlapino pūslės T24 ląstelių linija buvo nustatyta, jog kaip ir menadiono atveju, juglono EC50 po 24 h sumažėja nuo 28,5 μM iki 6,3 μM, jeigu kartu naudojama 1mM askorbo r., taip pat 4 kartus padidėja juglono viduląstelinių ROS koncentraciją didinantis poveikis bei efektyviau išeikvojamos glutationo atsargos, tačiau šio tyrimo metu nebuvo nustatytas kaspazės-3 aktyvinimas, kaip pastebėjo kiti tyrėjai (Ji YB ir kt., 2011), bei buvo pakartotas anksčiau mokslininkų gautas rezultatas (Xu HL ir kt., 2012 ), jog N-acetilcisteinas apsaugo ląsteles nuo juglono poveikio. Tyrimą atlikę mokslininkai (Kviecinski MR. ir kt., 2012) linkę matyti, jog ląstelių mirtis yra susijusi su ląstelių nekroze, o juglono sukeliamas oksidacinis stresas yra būtina veikimo mechanizmo dalis [50]. Yra atlikti tyrimai ir su gimdos kaklelio vėžio HeLa ląstelių linija, kurių metu buvo nustatyta, jog juglono koncentracijos, pradedant nuo 12,5 μM, reikšmingai stabdo ląstelių proliferaciją. Šio tyrimo metu, buvo nustatytas Bcl-2 ekspresiją mažinantis poveikis, kaspazės-3 aktyvumo padidėjimas, taip pat nustatytas apoptoziniuose mechanizmuose dalyvaujančio baltymo Bax kiekio padidėjimas [94].
1.2.3. Plumbaginas
Plumbaginas (5-hidroksi-2-metil-1,4-naftochinonas) tai dar vienas natūralus 1,4-naftochinonų atstovas (1 pav.), augalų metabolitas, aptinkamas Plumbagenaeace, Droseraceae, Ebenceae šeimoms priklausančiuose augaluose, kuris yra gerai žinomas dėl savo plataus biologinio poveikio [66]. Yra žinoma apie antioksidacinį [84], priešuždegiminį [35], antibakterinį [67, 12], priešgrybelinį [21] plumbagino poveikius, taip pat galima rasti duomenų apie priešvėžinį aktyvumą tyrimuose su žmogaus krūties, prostatos, kiaušidžių, kasos, plaučių, odos, kepenų vėžinėmis ląstelėmis [66]. Taip pat plumbaginas buvo tirtas kaip potencialus vaistas, siekiant išvengti ūminės ar lėtinės kepenų pažaidos, dėl jo priešuždegiminių bei kolageno sintezę stabdančių poveikių [87]. Tikslus plumbagino veikimo mechanizmas nėra žinomas, tačiau yra ištirta, jog šis junginys geba generuoti ROS, yra topoizomerazės II inhibitorius, veikia įvairius ląstelės signalinius ir apoptozinius mechanizmus [66], keleto tyrimų metu nustatytas jo selektyvumas vėžinėms ląstelėms [6, 2]. Šiuo metu vis dar atliekami tyrimai su plumbaginu kaip potencialiu priešvėžiniu junginiu, siekiant geriau išsiaiškinti jo veikimo mechanizmą bei ištirti galimus biologinius poveikius.
Yra duomenų apie plumbagino gebėjimą surišti hidroksilo ir superoksido radikalus in vitro, kurie rodo, jog plumbaginas geba surišti 26 % hidroksilo radikalų ir 27 % superoksido radikalų, esant ≥ 120 μmol koncentracijai [49]. Atliktas bendro plumbagino antioksidacinio pajėgumo tyrimas parodė, kad plumbaginas turi reikšmingą antioksidacinį poveikį, lyginant su sintetiniu antioksidantu dibutilhidroksitoluenu (BHT), naudotu palyginimui [83]. Taip pat nustatyta, jog plumbaginas mažina lipidų peroksido kiekį fibrosarkoma sergančių žiurkių audiniuose [37]. Dar vienas plumbagino
antioksidacines savybes rodantis tyrimas buvo atliktas su žiurkėmis, kurioms buvo sukeltas miokardo infarktas ir reperfuzija. Rezultatai parodė, kad tų žiurkių, kurioms buvo duota plumbagino (5mg/kg), miokardo audinyje aptikta mažiau ROS bei riebalų peroksidų, lyginant su kontrole. Taip pat plumbaginas didino glutationo atsargas ląstelėje, sukėlė Nrf-2 aktyvavimą, NF-κB ekspresijos mažinimą, o tai turi apsauginį poveikį prieš uždegimo ir oksidacinio streso sukeliamus poveikius miokardo infarkto metu [89]. Panašūs rezultatai, rodantys plumbagino apsaugantį potencialą prieš oksidacinį stresą buvo gauti ir tyrimų su MC3T3-E1 ląstelių linija metu. Ląstelėse, kurios buvo paveiktos deksametazonu kartu su 10 μM plumbagino, buvo nustatyta reikšmingai mažesnė ROS koncentracija, didesnė osteogenezės žymeklių bei Nrf-2 ekspresija, didesni antioksidacinės sistemos fermentų kiekiai, negu lyginant su ląstelėmis, kurios buvo veiktos tik deksametazonu. Tai rodo galimą plumbagino veikimą prieš gliukokortikoidų sukeliamą osteoporozę [93].
Tyrimų su Leishmania donovani metu buvo nustatyta, jog plumbaginas sukelia ROS koncentracijos padidėjimą: po 3 h 2 μM koncentracijos plumbaginas 2,3 karto didino viduląstelinių ROS koncentraciją, pritaikant specifinį reagentą Mitosox Red, buvo nustatytas superoksido koncentracijos padidėjimas mitochondrijose, taip pat nustatyta mitochondrijos membranos depoliarizacija, ATP išeikvojimas, citozolio Ca2+ koncentracijos padidėjimas, kaspazės 3-7 tipo baltymų aktyvumo padidėjimas bei lipidų peroksidacija, buvo įrodyta, kad plumbaginas sukelia apoptozės tipo ląstelių žūtį [5]. Tyrimų su žmogaus krūties vėžio MCF-7 ląstelių linija buvo nustatyta, jog ląstelių proliferaciją stabdantis poveikis pasireiškia dėl p53 ir p21 auglio supresinių baltymų aktyvumo augimo, Bcl-2 tipo baltymų ekspresijos didėjimo bei apoptoziniuose mechanizmuose dalyvaujančių baltymų Bax ir Bak kiekio padidėjimo [95]. Tyrimų su žmogaus prostatos vėžio LNCaP ląstelių linija rezultatai parodė, jog reikšmingas ląstelių gyvybingumą mažinantis plumbagino poveikis po 24 h pasireiškia mažiausiai koncentracijai esant 3 μM, kai tuo tarpu paveikus 7,5 μM - gyvybingų ląstelių iš viso nelieka. Reikšmingas ROS koncentraciją didinantis poveikis po 2 h pasireiškia, kai koncentracija yra 5 μM [69].
Tačiau galima rasti duomenų, rodančių, kad plumbagino antiproliferacinio ir priešuždegiminio poveikio mechanizmas yra nepriklausomas nuo ROS generacijos, bet pasireiškia per viduląstelinių tiolių kiekio moduliavimą. Tyrimų su limfocitais metu buvo nustatyta, jog 5 μM koncentracijos plumbaginas reikšmingai didino ROS koncentraciją bei sukėlė GSH išeikvojimą, tačiau masių spektrometrijos ir ESC metodais buvo nustatyta, kad plumbaginas tiesiogiai jungėsi su GSH, taip pat buvo nustatytas bendras baltymų laisvų tiolio grupių sumažėjimas ląstelėse, paveiktose plumbagino, o plumbagino antiproliferacinis ir citokinų gamybą mažinantis poveikis buvo sumažintas ląsteles paveikus tiolio tipo antioksidantais [14].
1.2.4. Lavsonas
Lavsonas (5-hidroksi-1,4-naftochinonas) yra gamtoje sutinkamas, antrinis augalų metabolitas (1 pav.). Šis junginys gali būti išskiriamas iš heninės lavsonijos (lot. Lawsonia inermis) bei vandens hiacinto (lot. Eichhornia crassipes) lapų [4]. Heninės lavsonijos lapai yra gerai žinomi kaip augalinių dažų, dar vadinamų henna, žaliava. Dažomosios šio augalo savybės buvo pirmosios, dėl kurių prieš daugelį metų heninė lavsonija ir buvo pastebėta. Vėliau šis augalas buvo naudotas ne tik kosmetikos tikslams, bet ir medicinai, dėl savo priešgrybelinio poveikio [71], taip pat henna dažai padėdavo apsaugoti plaukus nuo išdžiūvimo, UV poveikio bei neleisdavo veistis parazitams [23]. Dabar jau žinoma, jog henna gali palengvinti tokius diabetinės pėdos simptomus kaip odos išsausėjimas ir skilinėjimas, negyjančios žaizdos, diskomforto jausmas [62], galima rasti informacijos apie antibakterinį, priešvirusinį, priešuždegiminį, analgezinį, priešvėžinį, hepatoprotekcinį, imunomoduliacinį, antioksidacinį, prieštripanosominį poveikius [76, 54, 97]. Taip pat heninės lavsonijos ekstraktai pasižymi priešvėžiniu poveikiu prieš tokias ląstelių linijas kaip gimdos kaklelio [48] ar odos vėžio [41, 63].
Lavsonas yra junginys, kuris ir suteikia heninei lavsonijai dažomąsias savybes, dėl gebėjimo jungtis su odos ar plaukų baltymais [4], taip pat šiam junginiui priskiriami ir daugelis kitų biologinių augalo poveikių [76], dėl to yra atliekami tyrimai jo veiksmingumui ir veikimo mechanizmui išsiaiškinti.
Tyrimuose su žiurkių eritrocitais, buvo nustatyta, kad lavsonas (3mM) sukelia ROS generacijos padidėjimą, bet jis yra per mažas, kad išeikvotų ląstelės GSH glutationo atsargas ir sukeltų oksidacinį stresą [56].Tyrimų su pankreatitų sergančiomis žiurkėmis metu nustatyta, kad 100 ir 200 mg/kg lavsono dozėmis gydytų žiurkių kepenyse, plaučiuose ir kasoje GSH kiekiai buvo padidėję, o naviko nekrozės faktoriaus (TNF-α), C reaktyviojo baltymo, interleukino-6 kiekiai panašūs kaip sveikų žiurkių organizme, kas parodo galimą lavsono apsauginį priešuždegiminį ir antioksidacinį poveikius [9]. Dėl gerų lavsono antioksidacinių savybių buvo tiriami ir įvairūs lavsono dimero dariniai bei jų antioksidacinės savybės. Nustatyta, jog furano žiedą turintis lavsono junginys, pasižymi stipresniu antioksidaciniu aktyvumu už sintetinį antioksidantą BHT [16].
Lavsonas taip pat pasižymi ir priešvėžiniu aktyvumu: 2 mg/ml koncentracijos lavsonas reikšmingai stabdė žmogaus gaubtinės žarnos vėžio ląstelių proliferaciją, o kaip to priežastis nurodomas NF-κB aktyvumo sumažėjimas [88]. Tyrimų su pelių melanomos B16-F10 ląstelėmis metu nustatyta, jog koncentracijos nuo 150 μM reikšmingai mažina ląstelių gyvybingumą, taip pat lavsonas mažino melanino bei MITF baltymo, svarbaus melanomos vystymuisi [85], kiekio didėjimą, stabdė tirozino kinazės aktyvumą [53].
1.3. ROS vaidmuo ląstelių apoptoziniuose mechanizmuose
Ląstelėse ROS generuojami fagosomose, peroksisomose, endoplazminiame tinkle, ląstelinėse membranose [18], taip pat didelė dalis mitochondrijose, kur ROS susidaro, dėl elektronų nutekėjimo oksidacinio fosforilinimo bei O2 redukcijos reakcijų metu. Tiek ROS produkcija, tiek jų neutralizavimas yra svarbūs normaliai ląstelių veiklai, todėl svarbu, kad būtų išlaikomas balansas. Šį balansą palaikyti padeda įvairios fermentinės-antioksidacinės sistemos. Vienos iš svarbiausiųjų yra: superoksido dismutazės (SOD), glutaredoksinas-2 (Grx2), glutationo peroksidazės (GPx), tioredoksino/tioredoksino reduktazės/peroksiredoksino reduktazės sistema (Trx2/TrxR2/Prx) [34]. Jeigu paminėtos antioksidacinės sistemos negeba neutralizuoti padidėjusių H2O2 kiekių, susidariusių neutralizavus O2.−, vyksta baltymų tiolių oksidacija, dėl ko gali įvykti konformaciniai pokyčiai, susidaryti tiolinės jungtys molekulėse ar tarp molekulių. Jeigu tokie pokyčiai įvyksta baltymų ar lipidų fosfatazių aktyviajame centre, jos tampa nebeaktyvios, kas sukelia pakitimus apoptozės signalą reguliuojančios kinazės 1 (AKS1) ir proteino kinazės (Akt) signaliniuose keliuose, atsakinguose už ląstelių proliferaciją ir gyvybingumą [73].
Kaip jau buvo apžvelgta anksčiau, visi mūsų tiriami 1,4-naftochinonai – menadionas, juglonas, plumbaginas ir lavsonas – pasižymi gebėjimu generuoti ROS įvairiose ląstelių linijose. Remiantis literatūra, galima manyti, kad jų proliferaciją stabdantis veikimas ir yra susijęs su H2O2 kiekio padidėjimu ląstelėse ir dėl to pasireiškiančiais pokyčiais signaliniuose keliuose.
Mūsų atliktų tyrimų metu, mes ne tik nustatinėsime, ar šie 1,4-naftochinonai taip pat veiks ROS kiekius mūsų pasirinktoje ląstelių linijoje, bet taip pat palyginsime šių junginių veikimą tarpusavyje.
1.4. Glioblastoma
Glioblastoma, dar žinoma kaip daugiaformė glioblastoma, tai agresyvaus tipo galvos smegenų vėžio forma, susiformuojanti iš astrocitų, sutrikus jų dalijimuisi [11]. Ji sudaro 15 % visų vėžinių smegenų susirgimų [92], bei pasižymi atsparumu didžiajai daliai priešnavikinių vaistų [59]. Pastaruosius 40 metų šios ligos gydymui yra skiriama daug dėmesio, tačiau išgyvenamumo lygis nedidėja [92].
Šiuo metu efektyviausiai glioblastoma yra gydoma operaciniu būdu, kartu pritaikant radio ir chemoterapiją, nes dažnai auglio neįmanoma visiškai pašalinti, taip pat auglys gali būti neoperuotinas. Vienintelis efektyvus chemoterapijai naudojamas vaistas yra temozolamidas, kurio veikimo mechanizmas paremtas alkilinančiu/metilinančiu poveikiu ląstelių DNR [92]. Tačiau jis yra
naudojamas kaip papildoma priemonė, gerinanti radioterapijos efektyvumą, galinti pailginti gyvenimą keletu mėnesių [80].
Kaip perspektyviausi ateities preparatai yra įvardijami alkilinantys vaistai, vartojami kartu su O-6-metilguanino-DNR-metiltransferazės inhibitoriais, taip pat MDR (angl. multidrug resistance
protein) moduliatoriai, vystomi imunoterapiniai preparatai. Tačiau vis dar trūksta klinikinių tyrimų,
galinčių patvirtinti jų efektyvumą [59]. Todėl yra atliekama nemažai tyrimų su įvairiomis glioblastomos ląstelių linijomis, ieškoma molekulių, veikiančių jų gyvybingumą bei proliferaciją. Tarp šių molekulių patenka ir 1,4-naftochinono atstovai. Yra nustatytas juglono citotoksinis poveikis žiurkių glioblastomos C6 ląstelių linijai [1], taip pat juglono bei plumbagino 5-O esteriai bei eteriai pasižymėjo augimą stabdančiu poveikiu tyrimuose su žmogaus glioblastomos U373 ląstelių linija [28]. O šio magistrinio darbo metu glioblastomos C6 ląstelių linija bus naudojama tirti galimam menadiono, juglono, lavsono ir plumbagino poveikiui viduląstelinių ROS koncentracijai po to, kai ankstesnių tyrimų LSMU neuromokslų institute metu buvo nustatytas citotoksinis šių junginių poveikis glioblastomos C6 ląstelėms.
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Naudotos medžiagos
1. Fermentas krienų peroksidazė (HPR) (Sigma-Aldrich)
2. Dažas 10-acetil-3,7-dihidroksifenoksazinas (AmplexRed) (Sigma Aldrich) 3. H2O2 – vandenilio peroksidas (Sigma Aldrich)
4. Tirpiklis dimetilsulfoksidas (DMSO) (Sigma Aldrich)
5. Dažas 2,7-dichlorofluorescindiacetatas (DCF-DA) (Sigma Aldrich) 6. HBSS buferinė sistema (Hanks’ balanced salt solution) (Sigma Aldrich) 7. Tripsinas/EDTA (Sigma-Aldrich)
8. Ląstelių auginimo terpė (DMEM) (Sigma-Aldrich) 9. Fetalinis veršelio serumas (FBS) (Sigma-Aldrich)
10. Sudėtinis antibiotikų tirpalas (penicilino – streptomicino tirpalas) (Sigma-Aldrich) 11. Triptano mėlio dažų tirpalas (0,4%) (Sigma-Aldrich)
12. Etanolis (96%) (UAB ,,Stumbras”)
13. 2-metil-1,4-naftochinonas – menadionas (Sigma-Aldrich)
14. 5-hidroksi-2-metil-1,4-naftochinonas – plumbaginas (Sigma-Aldrich) 15. 2-hidroksi-1,4-naftochinonas – lavsonas (Sigma-Aldrich)
16. 5-hidroksi-1,4-naftochinonas – juglonas (Sigma-Aldrich) 17. Specifinis dažas MitoSox Red (Molecular probes)
2.2. Naudota aparatūra
1. Fluorimetras - Thermo scientific Fluoroskan Ascent. 2. Centrifuga - Eppendorf centrifuge 5810R.
3. Fluorescencinis mikroskopas - OLYMPUS IX71S1F-3
4. Laboratorinės analizinės svarstyklės (0,0001 tikslumo) - HF-1200 GD, A&D Company.
2.3. Vandenilio peroksido koncentracijos nustatymas fluorimetriniu metodu
Šiam tyrimui atlikti buvo naudojamas specifinis dažas AmplexRed ir fermentas krienų peroksidazė (HPR). Krienų peroksidazė - tai iš krienų šaknies ekstrakto išgrynintas baltymas, kuris katalizuoja vandenilio peroksido redukciją iki vandens. Aplinkoje esant vandenilio donorų, šis fermentas nespalvotus ar nefluorescuojančius junginius paverčia fluorescuojančiais ar spalvotais (3 pav.). Šiuo atveju kaip vandenilio donoras buvo naudojamas dažas AmplexRed, kuris reagavo su vandenilio peroksidu, pastarasis buvo redukuojamas iki vandens, o AmplexRed oksidavosi iki raudono fluorescuojančio 7-hidroksi-3H-fenoksazin-3-ono (rezorufino), kurio fluorescencijos intensyvumas ir buvo išmatuotas. Jeigu tyrimui yra naudojamos medžiagos, galinčios surišti vandenilio peroksido molekules, tai H2O2 koncentracija sumažėja, todėl mažiau specifinio dažo AmplexRed paverčiama į fluorescuojantį rezorufiną ir fluorescencijos intensyvumas mažėja. Tyrimui naudojant medžiagas, pasižyminčias H2O2 generaciją skatinančiu poveikiu, rezorufino koncentracija ir fluorescencijos intensyvumas didėja [96].
Į 96 šulinėlių lėkštelės šulinėlius buvo įpiltas apskaičiuotas kiekis ląstelių auginimo terpės. Tuomet buvo sudėti apskaičiuoti kiekiai tiriamųjų medžiagų lavsono, menadiono, plumbagino ir juglono etanolinių tirpalų (70 %). Į kiekvieną šulinėlį dedama 10 μl 3 % vandenilio peroksido, 5 μl
AmplexRed ir 5 μl krienų peroksidazės. Matuojamas fluorescencijos intensyvumas, naudojant
fluorimetrą, bangos ilgiams esant: 544 nm – sužadinimo, 590 nm – emisijos.
3 pav. AmplexRed oksidacija iki fluorescuojančio rezorufino
H2O2, HRP
2.4. Ląstelių auginimo metodika
Tyrimuose buvo panaudota žiurkės smegenų auglio Glioblastoma multiforme C6 ląstelių linija. Ląstelės buvo auginamos flakonuose, augimo terpėje, sudarytoje iš DMEM ląstelių augimo terpės, į kurią buvo dedama sudėtinio penicilino-streptomicino (10000 IU/ml – 10000 μg/ml) tirpalo, bei FBS. Ląstelės buvo auginamos inkubatoriuje, esant 37 °C ir 5 % CO2 atmosferai. Ląstelėms nuo flakono pagrindo atskirti bei tarpląstelinėms jungtims suardyti buvo naudojamas 0,25% tripsino/EDTA tirpalas.
2.5. Ląstelių tankio apskaičiavimas
Ląstelių tankiui apskaičiuoti buvo naudojamas hemocitometras (Neubauer), bei 0,4% triptano mėlio tirpalas. Į mėgintuvėlį pilama 20 μl ląstelių suspensijos bei 20 μl triptano mėlio, kuris nudažo terpę, tačiau neprasiskverbia pro sveikų ląstelių membranas ir jos lieka matomos mėlyname fone. Tada imamas dengiamasis stiklelis ir prispaudžiamas prie hemocitometro kameros, tarp jų esantis tarpas užpildomas su 20 μl ląstelių suspensijos ir triptano mėlio tirpalu. Stebima pro šviesinį mikroskopą, esant 20 kartų didinimui. Suskaičiuojamos sveikos ląstelės, esančios 4 kampiniuose langeliuose.
Bendram ląstelių kiekiui 1 ml suskaičiuoti naudojama formulė: X = n*2*4*5000, kur:
X – ląstelių skaičius 1 ml; n – ląstelių skaičius 4 langeliuose; 2 – skiedimai; 5000 – konstanta.
Toliau apskaičiuojamas reikalingas ląstelių suspensijos kiekis, norint užsėti atitinkamą skaičių plokštelės šulinėlių. Šiuo atveju į šulinėlį buvo sėjama po 20000 ląstelių. Pagal šulinėlių tūrį apskaičiuojamas reikalingas augimo terpės kiekis ir ląstelės užsėjamos. Jos buvo inkubuojamos inkubatoriuje, esant 37 °C ir 5 % CO2 atmosferai, vieną parą.
2.6. Viduląstelinių ROS koncentracijos nustatymas fluorimetriniu metodu
Fluorimetriškai nustatinėjant viduląstelinių ROS koncentraciją, buvo panaudotas specifinis dažas 2,7-dichlorofluorescindiacetatas (DCF-DA), kuris patekęs į ląstelę yra deacilinamas viduląstelinių esterazių iki nefluorescuojančio junginio, tačiau vėliau oksiduojamas ląstelės viduje esančių ROS iki fluorescuojančio 2,7-dichlorofluorescino (4 pav.). Todėl padidėjusi viduląstelinių ROS koncentracija sąlygoja fluorescencijos intensyvumo padidėjimą, o ROS koncentracijos sumažėjimas atitinkamai fluorescencijos intensyvumą mažina [25].
Po to, kai į šulinėlius pasėtos ląstelės buvo inkubuotos vieną parą, terpė nuo ląstelių buvo nupilama ir kiekvienas šulinėlis nuplautas su 100 μl HBSS buferinės sistemos (Hanks’ balanced salt solution). Tada į kiekvieną šulinėlį buvo įpilta 10 μl tūris 10 μM koncentracijos DCF-DA dažo (laikomas tamsoje) ir inkubuojama 15 min., esant 37 °C ir 5 % CO2 atmosferai, tamsoje. Po 15 min. dažai nupilami ir dar kartą plaunama su 100 μl HBSS buferinės sistemos. Po antrojo plovimo į kiekvieną šulinėlį dedama 200 μl HBSS buferinės sistemos ir apskaičiuotas kiekis skirtingų koncentracijų tiriamųjų medžiagų (menadiono, plumbagino, lavsono, juglono). Iš karto po to atliekamas pirmasis matavimas fluorimetru, bangos ilgiams esant: 485 nm – sužadinimo, 583 nm – emisijos. Po pirmojo matavimo plokštelė laikoma tamsoje ir matavimai kartojami kas 30 min., kai paskutinis matavimas atliekamas po 3 h nuo bandymo pradžios.
4 pav. Fluorescuojančio 2,7-dichlorofluorescino susidarymas ląstelėje
2.7. Superoksido koncentracijos mitochondrijose nustatymas fluorescenciniu
metodu
Superoksido koncentracijai mitochondrijose įvertinti yra naudojamas specifinis dažas
MitoSox Red. Šis reagentas prasiskverbia į gyvas ląstelės ir nukeliauja į mitochondrijas. Ten įvyksta
šio reagento oksidacija, dalyvaujant superoksidui (5 pav.). Jokios kitos reaktyvios deguonies ar azoto formos MitoSox Red dažo neoksiduoja. Oksiduotas reagentas pasižymi raudona fluorescencija. Todėl padidėjusi superoksido koncentracija mitochondrijose sąlygoja fluorescencijos intensyvumo didėjimą ir atvirkščiai [61].
MitoSox Red reagentas paruošiamas pagal gamintojų instrukciją, pagaminant darbinį 0,5 mM tirpalą, su kuriuo ląstelės inkubuojamos 10 min., esant 37 °C ir 5 % CO2 atmosferai. Tada į šulinėlius sudedami atitinkami kiekiai tiriamųjų medžiagų tirpalų ir vėl inkubuojama 10 min. tomis pačiomis sąlygomis. Pro fluorescencinį mikroskopą, naudojant UV šviesą, stebima raudona fluorescencija bei daromos nuotraukos, kurios vėliau panaudotos apskaičiuoti fluorescencijos intensyvumą, naudojant atvirojo kodo ImageJ programinę įrangą.
Viduląstelinės
esterazės ROS
5 pav. Mitosox Red oksidacija, dalyvaujant superoksido radikalui
2.8. Statistinė duomenų analizė
Statistinis duomenų įvertinimas buvo atliktas naudojant SigmaPlot 12.5 versiją (Systat Software Inc.), atliekant ANOVA (angl. one-way analysis of variance) analizę pagal Dunnett‘s testą. Rezultatai pateikti kaip vidurkiai ± standartinė paklaida. Skirtumas tarp dviejų reikšmių, kai p<0,05, priimtas kaip statistiškai reikšmingas.
3. REZULTATAI
3.1. 1,4-naftochinono darinių poveikis ekstraląstelinei vandenilio peroksido
koncentracijai
Pirmojo eksperimento metu, pritaikant fluorimetrinį analizės metodą, buvo bandoma nustatyti ir palyginti tiriamų 1,4-naftochinono darinių, juglono, plumbagino, menadiono ir lavsono, poveikį vandenilio peroksido koncentracijai ląstelių auginimo terpėje. 6-9 paveiksluose pateikti rezultatai, gauti išmatavus fluorescencijos intensyvumą po to, kai į reakcijos tarp dažo AmplexRed ir vandenilio peroksido mišinį, dalyvaujant krienų peroksidazei, buvo įdėti atitinkami kiekiai skirtingos koncentracijos tiriamųjų medžiagų tirpalų. Visi gauti rezultatai buvo lyginti su kontrole, kurios fluorescencijos intensyvumas atitinka 100 %.
·O
2Juglono koncentracija M kontrolė 1 2 4 8 16 32 64 F lu o re s c e n c ijo s in te n s y v u m a s p ro c . 0 20 40 60 80 100 120 140 160
6 pav. Juglono poveikis H2O2 koncentracijai, (n=4), *p<0,05 vs kontrolė
Kaip iš gautų rezultatų matome (6 pav.), 1 μM koncentracijos juglonas pasižymėjo statistiškai nereikšmingu H2O2 koncentraciją mažinančiu poveikiu – fluorescencijos intensyvumas sumažėjo 10%, lyginant su kontrole. Koncentracijai didėjant nuo 4 iki 64 μM, išryškėja juglono H2O2 generaciją skatinantis poveikis – fluorescencijos intensyvumas atitinkamai didėjo 15,8 %, 23,8 %, 28,5 %, 34,7 % ir 41,5 %, lyginant su kontrole. Taigi, šio tyrimo metu nustatėme, kad 1 μM koncentracijos juglonas turi nereikšmingą antioksidacinį poveikį, o 4-64 μM koncentracijos juglonas pasižymi H2O2 generaciją skatinančiu veikimu. Plumbagino koncentracija M kontrolė 1 3 5 8 10 12,5 15 18 F lu o re s c e n c ijo s in te n s y v u m a s p ro c . 0 20 40 60 80 100 120 140 160 * * * *
Iš gautų rezultatų matome (7 pav.), kad 1 μM koncentracijos plumbaginas turi H2O2 koncentraciją mažinantį poveikį, nustatytas fluorescencijos intensyvumo sumažėjimas 18,5 %, lyginant su kontrole. Esant 3 ir 5 μM koncentracijai antioksidacinis aktyvumas mažėja - fluorescencijos intensyvumas atitinkamai sumažėjo 12,3% ir 3,3%. Nuo 8 μM pradeda ryškėti plumbagino H2O2 koncentraciją didinančios savybės, o 12,5, 15 ir 18 μM koncentracijos plumbaginas fluorescencijos intensyvumą reikšmingai keičia, jį atitinkamai didindamas 18,5 %, 28 % ir 48,3 %. Taigi, šio tyrimo metu nustatėme, jog plumbaginas, veikia priklausomai nuo koncentracijos: 1 μM koncentracijos plumbaginas pasižymi antioksidacinėmis savybėmis, o 12,5-18 μM – prooksidacinėmis savybėmis.
Menadiono koncentracija M Kontrolė 1 3 4 5 6 7 8 15 25 F lu o re s c e n c ijo s in te n s y v u m a s p ro c . 0 20 40 60 80 100 120 140 * * * * *
8 pav. Menadiono poveikis H2O2 koncentracijai, (n=4), *p<0,05 vs kontrolė
Kaip iš gautų rezultatų, pateiktų 8 paveikslėlyje, matome, 1, 3 ir 4 μM koncentracijos menadionas pasižymi H2O2 neutralizuojančių veikimu: stipriausiai antioksidaciškai veikia 1 μM koncentracijos menadionas, kuris fluorescencijos intensyvumą mažina 40 %. Didėjant koncentracijai šis poveikis mažėja ir 4 μM koncentracijos menadionas fluorescenciją mažina 18 %. Vidutinių 5, 6 ir 7 μM koncentracijų menadionas reikšmingų pokyčių nesukėlė, o koncentracijai didėjant ir pasiekus 8 μM pastebimas H2O2 generaciją skatinančio poveikio išryškėjimas. Koncentracijoms esant 15 ir 25 μM, atitinkamai pasiekiamas fluorescencijos intensyvumo padidėjimas 21 % ir 29 %. Taigi, šio tyrimo metu nustatėme, jog menadiono poveikis priklauso nuo koncentracijos: 1-4 μM koncentracijos menadionas pasižymi antioksidaciniu veikimu, o 15-25 μM – prooksidaciniu.
Lavsono koncentracija M Kontrolė 10 25 50 75 100 250 500 750 1500 2000 F lu o re s c e n c ij o s i n te n s y v u m a s p ro c . 0 20 40 60 80 100 120 * * * * * * *
9 pav. Lavsono poveikis H2O2 koncentracijai, (n=4), *p<0,05 vs kontrolė
Kaip iš gautų rezultatų matome (9 pav.), visų, išskyrus 10 μM, koncentracijų lavsonas pasižymėjo fluorescenciją mažinančių poveikiu. Koncentracijoms didėjant nuo 75 μM iki 2000 μM, lavsonas pasižymėjo reikšmingu H2O2 neutralizuojančiu poveikiu ir fluorescencijos intensyvumą atitinkamai mažino 16,3-90,2 %, lyginant su kontrole. Taigi, nustatėme, jog 75-2000 μM koncentracijos lavsonas pasižymi antioksidacinėmis savybėmis.
Apibendrinant gautus rezultatus, galima teigti, kad juglonas pasižymi ryškiausiomis H2O2 generaciją didinančiomis savybėmis, plumbaginas ir menadionas priklausomai nuo koncentracijos gali pasižymėti tiek neutralizuojančiu, tiek generaciją skatinančiu veikimu. Tuo tarpu lavsonas yra stipriomis H2O2 neutralizuojančiomis savybėmis pasižymintis junginys.
Nustačius šių junginių H2O2 neutralizavimo bei generavimo galimybes terpėje be ląstelių buvo aktualu toliau tirti, kaip tiriamieji 1,4-naftochinonai gali paveikti viduląstelinę ROS koncentraciją žiurkės glioblastomos C6 ląstelėse.
3.2. 1,4-naftochinono darinių poveikis viduląstelinei ROS koncentracijai
Antrojo tyrimo metu, pritaikant fluorimetrinį analizės metodą, buvo nustatoma juglono, plumbagino, menadiono ir lavsono įtaka viduląstelinei reaktyviųjų deguonies formų koncentracijai žiurkės glioblastomos ląstelėse. 10-13 paveikslėliuose pateikti rezultatai, gauti išmatavus 2,7-dichlorofluorescino fluorescencijos intensyvumą po to, kai su 2,7-dichlorofluorescindiacetatu 15 min.
inkubuotos ląstelės buvo paveiktos skirtingos koncentracijos tiriamųjų junginių tirpalais. Matavimai kartoti kas 30 min., paskutinis matavimas – 3 h nuo bandymo pradžios. Gauti rezultatai lyginti su kontrole, kurios fluorescencijos intensyvumas 0 min. laiko momentu atitinka 100 proc.
10 pav. Juglono poveikis viduląstelinei ROS koncentracijai, (n=3), *p<0,05 vs kontrolė
Kaip matome 10 paveikslėlyje, visų koncentracijų juglonas didino fluorescencijos intensyvumą, lyginant su kontrole, išskyrus 1 μM juglono tirpalą, kuris turėjo nežymų fluorescenciją mažinantį poveikį. Labiausiai fluorescencijos intensyvumą didino 64 μM juglonas, kuris jau 0 h fluorescenciją didino 56,5 %, o po 3 h šis skirtumas išaugo daugiau negu dvigubai – 113,36 %. Po 0,5 h fluorescenciją reikšmingai pradėjo didinti ir 8 μM juglonas – 23,1 % daugiau negu kontrolė, o po 2,5 h – 4 μM, kuris fluorescenciją didino 19,27 %. Šio tyrimo rezultatai parodė, jog 4-64 μM juglonas reikšmingai didina ROS koncentraciją ląstelėje – veikia kaip prooksidantas.
11 pav. Plumbagino poveikis viduląstelinei ROS koncentracijai, (n=3), *p<0,05 vs kontrolė
11 paveikslėlyje pavaizduoti rezultatai rodo, jog 1 bei 3 μM koncentracijos plumbaginas fluorescencijos intensyvumą mažinančių poveikiu pasižymėjo nuo 0 iki 1 h, tačiau vėlesniais laiko momentais šis poveikis pasikeitė į nežymų fluorescenciją mažinantį ar didinantį poveikį. 0 h laiko momentu fluorescenciją reikšmingai didino 15 ir 18 μM plumbaginas, atitinkamai 13,5 % ir 19,4 % daugiau, lyginant su kontrole. Po 1 h 12,5 μM plumbaginas taip pat pradėjo reikšmingai didinti fluorescencijos intensyvumą – 12,23 % daugiau negu kontrolė. 1,5 h laiko momentu fluorescenciją didinančiu poveikiu pasižymėjo visos koncentracijos, pradedant nuo 8 μM. Po 3 h, esant 18 μM plumbagino koncentracijai, išmatuotas didžiausias fluorescencijos intensyvumas - 77 % didesnis negu kontrolė. Taigi, šie rezultatai rodo, jog plumbaginas pasižymi nuo koncentracijos priklausančiu veikimu: 1-3 μM plumbaginas viduląstelinių ROS koncentraciją gali mažinti, tuo tarpu 8-18 μM plumbaginas ją didina.
12 pav. Menadiono poveikis viduląstelinei ROS koncentracijai, (n=3), *p<0,05 vs kontrolė
12 paveikslėlyje pavaizduoti rezultatai rodo, jog jau tyrimo pradžioje 1, 3 bei 4 μM koncentracijos menadionas pasižymėjo reikšmingu fluorescenciją mažinančių poveikiu. Po 3 h 1 μM menadionas fluorescenciją sumažino 52,7 %, lyginant su kontrole tuo laiko momentu. Tačiau didžiausios 15 ir 25 μM menadiono koncentracijos viso tyrimo metu turėjo fluorescenciją didinantį poveikį, o jau po 1 h ir 8 μM menadionas reikšmingai didino fluorescencijos intensyvumą. Po 3 h 25 μM menadionas fluorescenciją didino 69,6 %, lyginant su kontrole. Taigi, nustatėme, jog menadionas veikia priklausomai nuo koncentracijos: 1-4 μM menadionas viduląstelinių ROS koncentraciją mažina, tuo tarpu 8-25 μM plumbaginas ją didina.
13 pav. Lavsono poveikis viduląstelinei ROS koncentracijai, (n=3), *p<0,05 vs kontrolė
13 paveikslėlyje parodyti rezultatai rodo, jog visos lavsono koncentracijos turėjo fluorescenciją mažinantį poveikį. Jau po 0 h visos koncentracijos, pradedant nuo 50 μM, reikšmingai mažino fluorescencijos intensyvumą. Po 0,5 h fluorescenciją reikšmingai mažino ir 25 μM koncentracijos lavsonas. Stipriausiu poveikiu pasižymėjo 2000 μM lavsonas, kuris po 3 h fluorescencijos intensyvumą mažino 80,8 %, lyginant su kontrole. Taigi, šie rezultatai rodo, jog 25-2000 μM lavsonas veikia kaip viduląstelinių ROS koncentraciją mažinantis junginys bei kaip ir pirmojo bandymo metu, parodė stiprias antioksidacines savybes, bei potencialų ląsteles apsaugantį poveikį.
Apibendrinant gautus rezultatus, galima teigti, jog juglonas yra viduląstelinių ROS koncentraciją didinantis 1,4-naftochinono darinys, menadiono ir plumbagino poveikis ROS kiekiui priklauso nuo jų koncentracijos, o lavsonas pasižymi viduląstelinių ROS koncentraciją mažinančiu poveikiu. Gauti rezultatai turi ryšį su pirmojo tyrimo metu gautais duomenimis apie šių junginių poveikį H2O2 koncentracijai bei antioksidacines/prooksidacines savybes. Toliau buvo aktualu tirti, kaip šie junginiai galėtų veikti mitochondrijų superoksido koncentraciją glioblastomos C6 ląstelėse.
3.3. 1,4-naftochinono darinių poveikis mitochondrijų superoksido koncentracijai
Trečiojo tyrimo metu, pritaikant fluorescencinį analizės metodą, buvo nustatomas juglono, plumbagino, menadiono ir lavsono poveikis mitochondrijų superoksido koncentracijai žiurkės glioblastomos ląstelėse. Paveikslėliuose pateikti duomenys, gauti išmatavus specifinio dažo, oksiduojamo superoksido radikalų, MitoSox Red fluorescencijos intensyvumą, kuris nustatytas, naudojant fluorescencinio mikroskopo UV šviesą, po to, kai ląstelės buvo paveiktos skirtingų koncentracijų tiriamųjų medžiagų tirpalais.
Juglono koncentracija M kontrolė 1 2 4 8 16 32 64 F lu o re s c e n c ijo s in te n s y v u m a s p ro c . 0 50 100 150 200 250 * * * * * *
14 pav. Juglono poveikis mitochondrijų superoksido koncentracijai, (n=4), *p<0,05 vs kontrolė
Kaip iš pateiktų rezultatų matome (14 pav.), 1 μM koncentracijos juglonas pasižymėjo nereikšmingu fluorescencijos intensyvumo mažinimu, tuo tarpu 2-64 μM koncentracijos juglonas reikšmingai didino fluorescencijos intensyvumą, atitinkamai 20,6-98,4 %, lyginant su kontrole. Taigi, juglonas yra mitochondrijų superoksido koncentraciją didinantis junginys.
15 pav. Nuotraukos, parodančios skirtingų juglono koncentracijų poveikį fluorescencijos intensyvumui glioblastomos C6 ląstelėse. a – kontrolė, b – 16 μM, c – 64 μM. a1, b1, c1 – nuotraukos be fluorescencijos Plumbagino koncentracija M kontrolė 1 3 5 8 10 12,5 15 18 F lu o re s c e n c ijo s in te n s y v u m a s p ro c . 0 50 100 150 200 250 * * * * * *
16 pav. Plumbagino poveikis mitochondrijų superoksido koncentracijai, (n=4), *p<0,05 vs kontrolė
Kaip matoma 16 paveikslėlyje, 1-3 μM koncentracijos plumbaginas nereikšmingai mažino fluorescencijos intensyvumą, tuo tarpu 5-18 μM koncentracijų plumbaginas sukėlė reikšmingą fluorescencijos intensyvumo padidėjimą: 5 μM – fluorescencijos intensyvumas didėja 25,2 %, lyginant su kontrole, o 18 μM koncentracijos plumbaginas fluorescenciją didino 106 %. Taigi, galime
teigti, kad plumbaginas yra mitochondrijų superoksido koncentraciją didinantis junginys, kai jo koncentracija yra ≥5 μM.
17 pav. Nuotraukos, parodančios skirtingų plumbagino koncentracijų poveikį fluorescencijos intensyvumui glioblastomos C6 ląstelėse. a – kontrolė, b – 5 μM, c – 15 μM. a1, b1, c1 – nuotraukos be fluorescencijos Menadiono koncentracija M kontrolė 1 3 4 5 6 7 8 15 25 F lu o re s c e n c ijo s in te n s y v u m a s p ro c . 0 50 100 150 200 250 300 * * * * * *
18 pav. Menadiono poveikis mitochondrijų superoksido koncentracijai, (n=4), *p<0,05 vs kontrolė
Kaip iš pateiktų rezultatų matome (18 pav.), 1 ir 3 μM koncentracijos menadionas turėjo reikšmingą fluorescenciją mažinantį poveikį, atitinkamai 29,1 ir 20,7 %, lyginant su kontrole. 4-6 μM koncentracijos reikšmingų rezultatų neturėjo, o koncentracijai didėjant nuo 7 iki 25 μM, išryškėjo
fluorescenciją didinantis poveikis, atitinkamai 23,8-124,2 %, lyginant su kontrole. Rezultatai rodo, kad menadionas priklausomai nuo jo koncentracijos, mažina arba didina mitochondrijų superoksido kiekį.
19 pav. Nuotraukos, parodančios skirtingų menadiono koncentracijų poveikį fluorescencijos intensyvumui glioblastomos C6 ląstelėse. a – kontrolė, b – 1 μM, c – 25 μM. a1, b1, c1 – nuotraukos be fluorescencijos Lavsono konc. M kontrolė 10 25 50 75 100 250 500 750 1500 2000 Fluor e sc e nc ijos int e ns yv um as pr oc . 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 * * * * *
20 pav. Lavsono poveikis mitochondrijų superoksido koncentracijai, (n=4), *p<0,05 vs kontrolė
Kaip iš pateiktų rezultatų matome (20 pav.), tyrimo su lavonu metu nustatyta, kad 10-50 μM koncentracijos reikšmingai mažino fluorescenciją, atitinkamai 39,7-32,1 %. Vidutinio dydžio koncentracijos reikšmingo poveikio neturėjo, o tuo tarpu 1500 ir 2000 μM koncentracijos
fluorescenciją didino - 30,2 ir 38,6 % lyginant su kontrole. Taigi, lavsono poveikis priklauso nuo koncentracijos ir gali būti tiek superoksido koncentraciją didinantis, tiek mažinantis.
21 pav. Nuotraukos, parodančios skirtingų lavsono koncentracijų poveikį fluorescencijos intensyvumui glioblastomos C6 ląstelėse. a – kontrolė, b – 10 μM, c – 1500 μM. a1, b1, c1 – nuotraukos be fluorescencijos
Apibendrinus šio tyrimo rezultatus, matoma, jog juglonas ir plumbaginas yra mitochondrijų superoksido koncentraciją didinantys junginiai, o menadionas bei lavsonas, priklausomai nuo koncentracijos, pasižymėjo superoksido koncentraciją mažinančiu arba didinančiu poveikiu.
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Ištyrus juglono poveikį H2O2 koncentracijai, gauti rezultatai rodo, jog atliktų tyrimų metu juglonas pasižymėjo prooksidaciniu veikimu: vienintelė 1 μM koncentracija turėjo nereikšmingą antioksidacinį poveikį, mažinantį H2O2 koncentraciją terpėje. Tai, kad juglonas nepasižymi antioksidacinėmis savybėmis yra pastebėję ir kiti tyrėjai (Kumar S. ir kt., 2013), kurie nustatė, jog in
vitro juglonas gebėjo surišti 9 % hidroksilo radikalų, o superoksido radikalų surišimas buvo statistiškai
nereikšmingas, net pasiekus aukštas koncentracijas (≥120 μM) [49]. Tuo tarpu prooksidacines juglono savybes parodė tyrimai, kurių metu nustatytas viduląstelinių ROS bei mitochondrijų superoksido koncentracijų padidėjimas C6 glioblastomos ląstelėse, jas paveikus juglonu. Tiriant viduląstelinius ROS, po 2,5 h visos koncentracijos, pradedant nuo 4 μM, reikšmingai didino ROS koncentraciją, o po 3 h 64 μM juglonas ROS koncentraciją didino daugiau negu dvigubai. H.L. Xu ir kt. tyrimo su žmogaus leukemijos HL-60 ląstelių linija metu taip pat nustatė, jog 2 μM, 4 μM ir 8 μM
koncentracijos juglonas, po 24 h inkubacijos, viduląstelinių ROS kiekį didino atitinkamai 2,4; 3,5; 8,4 kartus [90]. ROS koncentracijų padidėjimas ląsteles paveikus juglonu yra nustatytas ir tyrimuose su žmogaus šlapino pūslės T24 [50], žmogaus krūties vėžio MCF-7 [39], pelių melanomos B16F1 [3], glioblastomos C6 [1] ląstelių linijomis.
Ištyrus plumbagino poveikį H2O2 koncentracijai, galima teigti, kad mažų koncentracijų plumbaginas veikia kaip antioksidantas: rezultatai rodo, jog 1 μM plumbaginas reikšmingai mažina H2O2 koncentraciją terpėje, o 1-3 μM plumbaginas gali reikšmingai mažinti viduląstelinių ROS koncentraciją pirmosiomis 30 tyrimo minučių. Tai, kad mažos plumbagino dozės gali turėti reikšmingą antioksidacinį aktyvumą yra nustatę ir kiti tyrėjai. S.X. Wang ir kt. tyrimuose su žiurkėmis, kurioms buvo sukeltas miokardo infarktas, nustatė, jog 5mg/kg plumbagino dozė mažina ROS bei riebalų peroksidų kiekį miokardo audinyje [89]. M. Tan ir kt. atlikto bendrą plumbagino antioksidacinio pajėgumo tyrimą in vitro ir rezultatai parodė, kad plumbaginas turi reikšmingą antioksidacinį poveikį, lyginant su sintetiniu antioksidantu dibutilhidroksitoluenu (BHT) [83]. Visų mūsų tyrimų metu didesnės plumbagino koncentracijos (≥5 μM) veikė kaip prooksidantai. Apie galimą plumbagino viduląstelinių ROS didinantį poveikį rašo ir A.A. Powolny ir kt., kurie tyrimų su žmogaus prostatos vėžio LNCaP ląstelių linija metu nustatė, jog reikšmingas viduląstelinių ROS koncentraciją didinantis poveikis po 2 h pasireiškia, kai koncentracija yra 5 μM [69]. Tiriant mitochondrijų superoksido koncentraciją gauta, kad jau 5 μM plumbaginas turi reikšmingą prooksidacinį poveikį. Galimą plumbagino superoksido koncentraciją didinantį poveikį yra pastebėję ir kiti mokslininkai (Awasthi ir kt., 2016), tyrimų su Leishmania donovani metu, pritaikant MitoSox reagentą, buvo nustatyta, jog: po 3 h 2 μM koncentracijos plumbaginas reikšmingai didino superoksido koncentraciją mitochondrijose [5]. Ištyrus menadiono poveikį H2O2 koncentracijai, nustatėme, jog 1, 3 ir 4 μM koncentracijos menadionas reikšmingai mažina H2O2 koncentraciją terpėje. Šių menadiono koncentracijų antioksidacinį poveikį patvirtino ir tyrimai, nustatant jų įtaką viduląstelinių ROS generacijai, o 1 bei 3 μM menadionas mažino ir mitochondrijų superoksido koncentraciją. Kiti mokslininkai taip pat yra nustatę, jog menadionas gali veikti kaip antioksidantas. S. Kumar ir kt. atliktų tyrimų metu nustatė, jog menadionas in vitro surišo 23 % hidroksilo ir 30 % superoksido radikalų bei pastaruosius neutralizavo efektyviau negu plumbaginas ar juglonas, esant ≥ 120 μmol koncentracijai [49]. D. Fiorentini ir kt. nustatė, jog 7,4 μmol koncentracijos redukuotas menadionas yra panašaus stiprumo antioksidantas kaip 7 μmol α-tokoferolis, matuojant antioksidacinį poveikį tirpaluose ir membranų modeliuose [27]. Tuo tarpu tiriant 7 μM ir didesnes menadiono koncentracijas, pastebėjome, kad pradeda ryškėti jo prooksidacinės savybės. Ši tendencija pastebėta visų atliktų tyrimų metu. Y.J. Kim ir kt. taip pat tyrė viduląstelinių ROS kiekio pokyčius menadionu paveikus kiaušidžių karcinomos ląstelių liniją. Jie nustatė, jog 7,5 μM koncentracijos menadionas, po 24 h inkubacijos, daugiau negu dvigubai didina ROS kiekį ląstelėje, lyginant su kontrole, bei 50 % mažina ląstelių gyvybingumą [43].
