U NIVERSITÀ DI P ISA
F ACOLTÀ DI F ARMACIA Corso di Laurea Specialistica in
F ARMACIA
Tesi di Laurea
Studio in vitro dell’interazione tra salbutamolo e agonisti PPAR-γ in cellule
di muscolatura liscia bronchiale
Relatore
Prof.ssa Maria Cristina Breschi
Correlatore
Dott. Stefano Fogli
Candidato
Luca Picchianti
Anno accademico 2008/2009
Indice
Indice ... 2
1. Introduzione ... 4
1.1 Elementi di fisiopatologia dell’asma ... 4
1.1.1 Cellule infiammatorie ... 11
1.1.2 Mediatori chimici coinvolti nella patogenesi dell’asma ... 15
1.1.3 Patogenesi immunologica dell’infiammazione ... 16
1.1.4 Remodeling delle vie aeree ... 18
1.2 Meccanismi di proliferazione delle cellule muscolari lisce delle vie respiratorie ... 22
1.3 Recettore
adrenergico ... 27
1.3.1 Struttura recettoriale ... 27
1.3.2 Attivazione del recettore e trasduzione del segnale ... 27
1.3.4 Interazione del recettore
-AR con i farmaci agonisti ... 29
1.3.5 Desensibilizzazione recettoriale ... 30
1.4 Glucocorticoidi ... 34
1.4.1 Interazione tra glucorticoidi e
-agonisti ... 36
1.5 Recettori attivati dai proliferatori perossisomiali (PPAR) ... 38
1.5.1 Caratteristiche strutturali e meccanismi biologici dei PPAR ... 39
1.5.2 PPAR- ... 42
1.5.2.1 Ruolo dei PPAR- nell’infiammazione ... 43
1.6 Rho chinasi ... 45
1.6.1 Struttura e attivazione di Rho chinasi ... 46
1.6.2 Meccanismo di contrazione delle cellule muscolari respiratorie ... 46
1.6.3 Desensibilizzazione del recettore
-adrenergico ... 47
1.6.4 Azione chemotattica sugli eosinofili ... 48
1.6.5 Proliferazione cellulare ... 48
2. Scopo della ricerca ... 49
3. Materiali e metodi ... 50
3.1 Composti chimici ... 50
3.1.1 Salbutamolo ... 50
3.1.2 Rosiglitazone ... 51
3.1.3 15-deossi-12,14-prostaglandina J2 ... 52
3.1.4 Desametasone ... 52
3.1.5 GW9662 ... 53
3.1.6 Butoxamina cloroidrato ... 54
3.1.7 Mifepristone ... 54
3.2 Linea cellulare ... 55
3.3 Terreno di coltura ... 56
3.4 Valutazione della proliferazione cellulare ... 57
3.5 Indice di combinazione (Combination Index, CI)... 58
3.6 Analisi dell’apoptosi ... 59
3.7 Modello in vitro di desensibilizzazione omologa ... 62
3.8 Analisi RT-PCR ... 63
3.9 Analisi EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) ... 65
4 Risultati e discussione ... 66
4.1 Desensibilizzazione omologa del β
2-AR ... 66
4.2 Proliferazione delle BSMC ... 75
6. Conclusioni ... 84
7. Bibliografia ... 86
1. Introduzione
1.1 Elementi di fisiopatologia dell’asma
L’asma costituisce un problema sanitario importante, non solo in termini di costi diretti ma anche come perdita di produttività lavorativa e ridotta partecipazione alla vita familiare (Gina report, 2006). Le linee guida GINA (Global Initiative for Asthma) aggiornate al 2006, definiscono l’asma come una malattia cronica delle
vie aeree caratterizzata da ostruzione bronchiale più o meno accessionale, reversibile spontaneamente o in seguito a terapia farmacologica, da iperreattività bronchiale e da un accelerato declino della funzionalità respiratoria che può evolvere, in alcuni casi, in una ostruzione irreversibile delle vie aeree.
Ostruzione bronchiale
Gli episodi ricorrenti di broncoostruzione nell’asma sono dovuti al contributo di
diversi meccanismi, tutti associati ad infiammazione delle vie aeree, quali la
contrazione della muscolatura liscia, l’edema della parete bronchiale, la
formazione di tappi di muco che occludono il lume e le alterazioni strutturali della
parete delle vie respiratorie (Figura 1). La broncocostrizione acuta nel paziente
asmatico è un evento che si può verificare in quanto le vie aeree sono
particolarmente reattive ad una molteplicità di stimoli, quali gli allergeni,
l’esercizio fisico, l’aria fredda, i fumi, le sostanze chimiche e le forti emozioni. In
questi casi la broncocostrizione è dovuta alla combinazione di meccanismi diversi
che agiscono direttamente, causando la contrazione delle cellule muscolari lisce
tracheobronchiali, o indirettamente, attraverso il rilascio di mediatori dalle cellule infiammatorie o la stimolazione, a livello centrale o locale, di riflessi neuronali.
Anche la somministrazione di farmaci -bloccanti può scatenare una broncocostrizione acuta, a volte anche grave causata dal fatto che, se si blocca l’effetto rilasciante
-adrenergico, il sistema non è più in grado di contrastare l’azione dei mediatori broncocostrittori (in particolare l’acetilcolina) (Barnes, 1992).
Figura1. Effetti della patologia asmatica a livello delle vie respiratorie
Contrattilità della muscolatura liscia
I meccanismi responsabili della broncocostrizione acuta dipendono dal tipo di
stimolo che la causa. La broncocostrizione acuta indotta da allergeni presenti
nell’aria è causata dal rilascio (IgE-dipendente), da parte dei mastociti, di
mediatori quali istamina, prostaglandine e leucotrieni, che sono tutti in grado di
stimolare la contrazione della muscolatura liscia delle vie respiratorie (Holgate,
1993).
Meccanismi non ancora identificati, ma comunque legati al rilascio di mediatori, ed in particolare di leucotrieni, sono coinvolti nell’asma indotto da farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) (Istrael et al., 1993; Szczeklik et al., 2001).
Edema della parete delle vie aeree
La broncoostruzione, può essere provocata anche da un rigonfiamento della parete delle vie aeree dovuto ad edema, indipendentemente dalla contrazione della muscolatura liscia. L’edema delle vie aeree è una conseguenza dell’aumento della permeabilità del microcircolo bronchiale soprattutto nella zona che si trova all’esterno della muscolatura liscia, con conseguente perdita della forza di retrazione elastica. Sia il rigonfiamento delle vie aeree che la perdita di forza di retrazione elastica possono contribuire all’iperresponsività bronchiale caratteristica dell’asma (James et al., 1989; Hogg et al., 1993).
Alterazioni strutturali
La broncoostruzione, in alcuni pazienti, risulta essere irreversibile anche dopo un lungo ciclo di terapia con glucocorticoidi somministrati ad alte dosi per via orale.
Questa componente non reversibile della broncoostruzione potrebbe essere dovuta
allo sviluppo di alterazioni strutturali associate all’infiammazione cronica delle
vie aeree o a meccanismi meno conosciuti che comportano un difetto nella
risposta ai glucocorticoidi. Nei pazienti con asma lieve, anche in assenza di
sintomi e di una chiara broncoostruzione, ci può essere una iperresponsività
bronchiale associata ad una lieve infiammazione delle vie respiratorie (Jacoby et al., 2001).
Iperresponsività bronchiale
Una componente fisiopatologica importante dell’asma è rappresentata dall’aumento, rispetto ai soggetti normali, della reattività della muscolatura liscia tracheo-bronchiale in risposta a numerosi stimoli endogeni ed esogeni. Tra i vari meccanismi proposti per spiegare questa iperresponsività bronchiale, il più importante è l’infiammazione delle vie aeree.
L’ipersecrezione di muco
L’aumentata secrezione di muco e di essudati infiammatori nelle vie respiratorie può condurre all’occlusione del lume (“tappo di muco“). Nella patogenesi di queste alterazioni partecipano numerosi meccanismi, in particolare l’infiltrazione di cellule infiammatorie, il rilascio di mediatori ed il rimodellamento delle vie aeree. Clinicamente, l’asma si manifesta con dispnea, respiro sibilante, tosse, senso di costrizione toracica, la cui intensità varia in rapporto all’entità dell’ostruzione bronchiale ed al grado di percezione da parte del paziente (Gina report, 2006).
Gli eventi alla base della patologia asmatica possono essere riassunti con la
presenza di un’intensa infiltrazione di eosinofili e linfociti, accompagnata da
distruzione dell’epitelio, vasodilatazione e stravaso proteico a livello
microvascolare. Sono inoltre presenti cambiamenti strutturali, quali iperplasia e
ipertrofia della muscolatura liscia, neoangiogenesi (Dunnill, 1960), aumento del numero delle cellule mucipare caliciformi nell’epitelio bronchiale e deposizione di collagene nella regione immediatamente sottostante l’epitelio (che porta ad un ispessimento della membrana basale subepiteliale). Il processo infiammatorio sia acuto che cronico è irregolarmente distribuito lungo l’albero bronchiale ed arriva ad interessare anche le vie aeree più piccole (<2 mm di diametro) ed il parenchima polmonare (Kraft et al., 1996).
In tutte le forme d’asma, i mastociti e gli eosinofili svolgono il ruolo di cellule effettrici nella risposta infiammatoria, poiché sono in grado di secernere numerosi mediatori infiammatori preformati o neoformati che possono agire sulle vie aeree sia direttamente che indirettamente, per esempio attraverso meccanismi neurogeni (Jacoby et al., 2001).
Recentemente l’uso di metodiche di biologia cellulare e molecolare ha permesso di dimostrare che i linfociti T sono le cellule che orchestrano la risposta infiammatoria attraverso il rilascio di diverse citochine multifunzionali (Robinson et al., 1992). Non è ancora chiaro se l’attivazione dei linfociti T, osservata nell’asma, sia caratteristica esclusiva di questa patologia, ma quest’ipotesi sembra alquanto improbabile, dato che altre malattie infiammatorie croniche delle vie aeree, come la bronchite cronica e le bronchiectasie, sono caratterizzate da una notevole infiltrazione linfocitaria (Saetta et al., 1993).
Inoltre nel processo di mantenimento della risposta infiammatoria, è considerato
sempre più importante il ruolo delle cellule “strutturali” delle vie aeree (in
particolare, fibroblasti, cellule epiteliali, cellule endoteliali e cellule della
muscolatura liscia bronchiale), anch’esse in grado di produrre un’ampia gamma di
citochine ad azione immunoregolatrice (Kraft et al., 1996; Holgate et al., 2000) o in grado di indurre alterazioni strutturali e di promuovere la chemiotassi di cellule infiammatorie (Box 1).
Box 1.
Le cellule strutturali sono anche responsabili del rilascio di potenti mediatori infiammatori, i quali inducono la contrazione del muscolo liscio, aumentano la permeabilità del microcircolo bronchiale, attivano alcuni tipi di neuroni sensitivi e stimolano le cellule mucosecernenti. In particolare, l’epitelio rappresenta una delle principali strutture-bersaglio del danno tissutale in quanto risulta essere specificamente danneggiato, desquamato e trasformato da ciliato pseudostratificato a monostrato di cellule basali (Montefort et al., 1992).
C
ELLULES
TRUTTURALICellule epiteliali delle vie aeree
Esprimono una varietà di proteine infiammatorie nell’asma, rilasciano citochine, chemochine, mediatori lipidici, ed interagiscono con i virus e le sostanze inquinanti dell’aria.
Cellule muscolari lisce
Esprimono proteine infiammatorie simili a quelle delle cellule epiteliali (Chung et al., 2000).
Cellule endoteliali
Le cellule endoteliali della circolazione bronchiale svolgono un ruolo nel reclutamento di cellule infiammatorie dal sistema circolatorio alle vie aeree.
Fibroblasti e miofroblasti
I fibroblasti e i miofibroblasti producono i componenti del tessuto connettivo, quali i collageni e i proteoglicani, che sono coinvolti nel rimodellamento delle vie aeree.
Cellule nervose delle vie aeree
I nervi delle vie aeree sono maggiormente rappresentati da quelli colinergici, i quali,
possono essere attivati da stimoli riflessi nelle vie aeree e causare broncocostrizione e
secrezione di muco. Le cellule nervose possono essere sensibilizzate dagli stimoli
infiammatori come le neurotrofine, che causano alterazioni riflesse e sintomi quali
tosse ed oppressione toracica, e possono liberare neuropeptidi infiammatori
(Groneberg et al., 2004).
Nel tentativo di riparare il danno subito, le cellule epiteliali basali ed i miofibroblasti direttamente sottostanti l’epitelio possono proliferare e costituire connettivo interstiziale a livello della lamina reticularis della membrana basale.
La lesione ed il successivo processo di riparazione, con abnorme risposta delle cellule strutturali, rappresentano un meccanismo plausibile per l’ispessimento della membrana basale subepiteliale che si osserva nell’asma (Brewster et al., 1990).
Altre alterazioni strutturali riscontrabili nell’asma bronchiale sono l’ipertrofia e l’iperplasia delle cellule muscolari lisce, l’aumento delle cellule caliciformi mucosecernenti, l’aumento del volume delle ghiandole della sottomucosa bronchiale ed il rimodellamento del tessuto connettivo nella parete bronchiale. Il rilascio di mediatori e la regolazione del processo infiammatorio avvengono attraverso meccanismi estremamente complessi che, una volta instaurati, sono in grado di automantenersi. Infiammazione e rimodellamento strutturale caratterizzano, quindi, il quadro anatomo-patologico delle vie aeree nell’asma bronchiale.
1.1.1 Infiammazione delle vie aeree nell’asma
L’infiammazione cronica delle vie aeree è una caratteristica della malattia
asmatica. L’infiammazione è persistente (nonostante i sintomi della malattia
asmatica siano episodici), anche se non è stato ancora chiaramente definito il
rapporto fra gravità dell’asma ed entità del processo infiammatorio (Cohn et al.,
2004; Bousquet et al., 2000). L’infiammazione interessa tutte le vie aeree, ma in
particolar modo i bronchi di medie dimensioni. Diversi elementi cellulari e
numerosi mediatori (Figura 2) risultano avere un ruolo nella modulazione della risposta infiammatoria nelle vie respiratorie (Wenzel, 2003).
Figura2. Fisiopatologia dell’asma
1.1.1 Cellule infiammatorie
Eosinofili. Gli eosinofili possiedono un ampio spettro di proprietà
biologiche, come la capacità di rilasciare proteine tossiche dai loro granuli,
radicali liberi dell’ossigeno, eicosanoidi (leucotrieni solfo-peptidici) (Busse at
al., 1994), fattore attivante le piastrine (PAF), citochine analoghe a quelle
prodotte dai Th2 (Ying et al., 1995; Broide et al., 1992) e una varietà di fattori
di crescita (Weller, 1991; Venge et al., 1987). La loro capacità di secernere mediatori può essere attivata da meccanismi sia immunologici che non immunologici (Venge et al., 1987).
Gli eosinofili attivati possono far iniziare la contrazione del muscolo liscio nelle vie aeree umane (Weller, 1991), aumentare la permeabilità microvascolare (Collins et al., 1993) e indurre iperresponsività bronchiale (Leff, 1994). Nei campioni bioptici bronchiali, prelevati da soggetti con asma cronico è stato rilevato un aumentato numero di eosinofili attivati, prevalentemente al di sotto della membrana basale. La maggior parte delle persone con asma allergico o non allergico, comprese quelle con asma lieve, hanno eosinofili nel lume e nella parete delle vie aeree. Inoltre, è stata riscontrata un’associazione significativa, sebbene variabile, tra attivazione degli eosinofili, gravità dell’asma e iperresponsività delle vie aeree (Bradley et al., 1991).
Mastociti. I mastociti si localizzano nei bronchi sia di soggetti normali sia
di quelli asmatici. Oltre a rilasciare mediatori autacoidi, i mastociti sono
un’importante fonte di citochine e di proteasi neutre, specialmente di triptasi,
che agiscono su substrati proteici, come ad esempio i recettori attivati da
proteasi (Pesci et al., 1993; Koshino et al., 1995). I mastociti attivati rilasciano
mediatori broncocostrittori (istamina, cistenil-leucotrieni, prostaglandina D
2)
(Galli et al., 2005). Queste cellule sono attivate da allergeni, tramite i recettori
IgE ad alta affinità, o da stimoli osmotici (broncocostrizione indotta da
esercizio fisico). L’aumentato numero di mastociti nella muscolatura liscia
delle vie aeree è stato messo in relazione all’aumentata iperreattività bronchiale (Robinson et al., 2004).
Linfociti. I linfociti T, presenti in numero elevato nelle vie aeree, rilasciano citochine specifiche, comprese IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13, che orchestrano l’infiammazione eosinofilica e la produzione di IgE dai linfociti B (Larche et al., 2003).
Un aumento nell’attività delle cellule Th2 può essere dovuto in parte ad una riduzione delle cellule T regolatrici che normalmente inibiscono le cellule Th2. Ci può anche essere un aumento delle cellule iNKT, che rilasciano grandi quantità di citochine Th1 e Th2 (Akbari et al., 2006).
Le cellule dendritiche, catturano gli allergeni dalla superficie delle vie aeree e migrano ai linfonodi regionali, dove interagiscono con le cellule T regolatrici ed infine stimolano la produzione delle cellule Th2 da cellule T naïve98.
Neutrofili. I neutrofili sono aumentati nelle vie aeree e nell’espettorato di
pazienti con asma grave e negli asmatici fumatori, ma il ruolo fisiopatologico
di queste cellule è incerto ed il loro aumento può persino essere dovuto alla
terapia con corticosteroidi (Ying et al., 1995). I neutrofili polimorfonucleati
sono stati considerati per lungo tempo come cellule in stadio di
differenziazione terminale, incapaci di sintesi proteica e deputate solo a ruolo
di effettori passivi dell’infiammazione attraverso la fagocitosi e il rilascio di
enzimi preformati e di composti citotossici (Leckie et al., 2000; Lloyd et al.,
1992; Wenzel et al., 1997). Tuttavia i neutrofili possono sintetizzare un’ampia varietà di enzimi tra cui proteasi, che degradano la matrice extracellulare (per esempio la MMP-9 e l’elastasi), specie reattive dell’ossigeno, citochine e chemochine come IL-1β, TNF-α, IL-6 e IL-8. I neutrofili sono aumentati nelle vie aeree di pazienti con asma persistente, durante le riacutizzazioni dovute a virus respiratori o dopo l’esposizione ad inquinanti inalatori, ma il loro ruolo nella fisiopatologia dell’asma grave necessita ancora di chiarimenti (Frangova et al., 1996; Ronchi et al., 1996).
Macrofagi. I macrofagi sono aumentati nelle vie aeree del paziente asmatico
e possono essere attivati da allergeni tramite i recettori a bassa-affinità delle
IgE, per liberare i mediatori infiammatori e le citochine che amplificano la
risposta infiammatoria (Peters-Golden, 2004). I macrofagi tissutali hanno la
capacità di secernere un’ampia varietà di prodotti, molti dei quali svolgono un
ruolo di rilievo nei processi di danno e riparazione (Nathan, 1987). Essi
sintetizzano e secernono l’attivatore del plasminogeno e un gruppo di
metalloproteasi che possono degradare varie macromolecole della matrice
extracellulare come l’elastina (Malech et al., 1987). I macrofagi possono
anche essere coinvolti nel rimodellamento delle vie aeree tramite la secrezione
di fattori di crescita come quello derivato dalle piastrine (PDGF), il fattore di
crescita basico dei fibroblasti (b-FGF) e il fattore di crescita trasformante
(TGF-β) (Vignola et al., 1996).
.1.1.2 Mediatori chimici coinvolti nella patogenesi dell’asma
Chemochine. Le chemochine sono importanti nel reclutamento delle cellule infiammatorie nelle vie aeree e sono espresse prevalentemente nelle cellule epiteliali (Wenzel, 2003). L’eotassina è relativamente selettiva per gli eosinofili, mentre le chemochine correlate all’attivazione timica (TARC) e le chemochine derivate da macrofagi (MDC) reclutano le cellule Th2.
Cistenil-leucotrieni. I cistenil-leucotrieni sono potenti broncocoscrittori principalmente derivati dai mastociti e la loro inibizione farmacologica comporta un notevole beneficio clinico nell’asma che consiste in un miglioramento della funzione polmonare e della sintomatologia asmatica (Miller et al., 2004).
Citochine. Le citochine modulano la risposta infiammatoria nell’asma e ne determinano la gravità (Ricciardolo et al., 2004). Le citochine più importanti comprendono l’IL-1β e il TNF-α, che amplificano la risposta infiammatoria, ed il GM-CSF che prolunga la sopravvivenza degli eosinofili. Le citochine derivate dai linfociti Th2 includono IL-5, necessaria per la differenziazione e la sopravvivenza degli eosinofili; IL-4, importante per la differenziazione delle cellule Th2, IL-13, necessaria per formazione di IgE.
Istamina. E’ un mediatore chimico liberato dai mastociti che contribuisce
alla broncocostrizione ed alla risposta infiammatoria.
Ossido Nitrico (NO). E’ una molecola prodotta principalmente dall’azione dell’enzima ossido nitrico sintetasi inducibile delle cellule epiteliali. L’NO nell’esalato viene valutato, in quanto marker associato con la presenza d’infiammazione nell’asma, per monitorare l’efficacia del trattamento antiasmatico (Smith et al., 2005).
Prostaglandina D
2.E’ una prostaglandina ad attività broncocostrittrice prodotta principalmente dai mastociti e coinvolta nel reclutamento delle cellule Th2 nelle vie aeree.
1.1.3 Patogenesi immunologica dell’infiammazione
Il sistema immunitario è regolato da processi mediati da anticorpi e da cellule (Roit, 1992). I processi immuno-mediati sono caratterizzati dalla produzione e dalla secrezione di anticorpi specifici da parte dei linfociti B, mentre i processi cellulo-mediati dipendono dai linfociti T. I linfociti T controllano le funzioni dei linfociti B ed esercitano anche azioni proinfiammatorie attraverso l’attività citotossica (da parte dei linfociti T “killer” CD8+) e la secrezione di citochine.
Sono stati caratterizzati almeno due distinti sottotipi di linfociti T-helper (Th) CD4+, sulla base del loro profilo di produzione di citochine (Romagnani, 1994;
Humbert et al., 1997).
Benché entrambi i sottotipi cellulari secernano IL-3 e GM-CSF, il sottotipo Th1
produce preferenzialmente IL-2, che stimola la proliferazione dei linfociti T,
interferone- (IFN-) (che inibisce l’attivazione dei linfociti B e la sintesi di IgE) e il fattore di necrosi tumorale- (TNF-) (Romagnani, 1994; Humbert et al., 1997).
Il sottotipo Th2, principalmente coinvolto nell’asma, secerne le citochine IL-4, IL-5, IL-9, IL-13 ed IL-16.
Le citochine di tipo Th2 sono responsabili dello sviluppo della classica reazione di ipersensibilità ritardata o cellulo-mediata. L’IL-4 è una citochina cruciale nella risposta allergica, promuovendo il passaggio nelle cellule B verso la sintesi di IgE, dirigendo i linfociti T verso una via di differenziazione di tipo Th2, aumentando l’espressione della molecola di adesione VCAM-1 e controllando il livello di espressione di IgE Fcε, di recettori di citochine e chemochine e dei leucotrieni coinvolti nella cascata della reazione allergica (Holt et al., 1999).
Un passaggio cruciale nello sviluppo di una risposta immunitaria è costituito dall’attivazione dei linfociti T da parte di antigeni ad essi adeguatamente presentati dalle cellule accessorie, un processo che coinvolge le molecole del complesso maggiore di istocompatibilità, MHC (le molecole MHC di classe II sui linfociti T CD4+ e le molecole MHC di classe I sui linfociti T CD8+). Le cellule dendritiche sono le principali cellule che presentano gli antigeni nelle vie aeree.
Esse originano da precursori nel midollo osseo e formano una estesa rete di cellule interdigitate lungo tutto l’epitelio bronchiale (Holt et al., 1999).
Da questa localizzazione, esse migrano alle stazioni linfonodali locali sotto il
controllo del fattore di stimolazione di colonie di granulociti macrofagi (GM-
CSF), una citochina rilasciata da cellule epiteliali attivate, fibroblasti, linfociti T,
macrofagi e mastociti. Dopo la cattura dell’antigene, che è favorita dalla presenza
di IgE sulla superficie cellulare, le cellule dendritiche si muovono verso le regioni
ricche di linfociti. Qui, sotto l’influenza di altre citochine, esse maturano e diventano cellule efficaci nella presentazione antigenica (Banchereau et al., 1998).
Le cellule dendritiche possono anche dirigere la polarizzazione dei linfociti T
“naive” (Th0) verso il sottotipo Th2 che secerne in modo coordinato citochine, che sono codificate da un gruppo di geni che si trovano nella regione cromosomica 5q31-33 (“cluster” del gene dell’IL-4).
1.1.4 Remodeling delle vie aeree
Il processo infiammatorio nell’asma è associato a “rimodellamento” delle vie aeree. Questo termine indica l’insieme delle alterazioni strutturali della parete delle vie aeree che comprendono: l’ispessimento della membrana basale sottoepiteliale, la desquamazione epiteliale, la formazione di nuovi vasi (neoangiogenesi), l’ipertrofia e l’iperplasia del muscolo liscio. La principale caratteristica del rimodellamento è l’ispessimento e l’aumento della densità della lamina reticolare della membrana basale per deposizione di fibre collagene di tipo I, III, tenascina e fibronectina da parte dei miofibroblasti attivati (Vignola et al., 2003).
L’aumento dello spessore della membrana basale sembra essere positivamente correlato all’iperresponsività bronchiale, alla frequenza di attacchi d’asma e al numero di fibroblasti e miofibroblasti adiacenti ad essa (Evans et al., 1999).
L’ispessimento della membrana basale potrebbe essere una conseguenza del
danno epiteliale cui corrisponde una prolungata e continua riparazione che implica
la produzione di eccessive quantità di fattori di crescita che inducono i fibroblasti
a proliferare e deporre fibre collagene. Anche la matrice interstiziale è coinvolta nel processo di rimodellamento. Nei soggetti asmatici è stata dimostrata la presenza di fibre elastiche anomale, frammentate o assenti, che suggeriscono la presenza di un anomalo processo elastolitico (Vignola et al., 2003). La desquamazione epiteliale, che è caratterizzata dal distacco delle cellule colonnari dalle cellule basali, potrebbe essere dovuta alla distruzione di strutture di adesione intercellulari come desmosomi e giunzioni strette (Montefort et al., 1992) .
La desquamazione epiteliale potrebbe essere causata anche dall’aumento dell’apoptosi delle cellule epiteliali. L'epitelio può essere riparato e sostituito con una mucosa pluristratificata non più ciliata, ma costituita da cellule poligonali coperte da un sottile strato di cellule squamose (metaplasia squamosa). Queste modificazioni possono essere associate ad iperplasia delle cellule caliciformi mucipare e all’ aumento di volume delle ghiandole della mucosa bronchiale (Fahy et al., 2001) .
Questi aspetti sono responsabili dell’ipersecrezione di muco caratteristica
dell’asma bronchiale. Numerosi sono ormai gli studi che hanno evidenziato anche
un aumento della vascolarizzazione nelle vie aeree di soggetti con asma lieve
(Kuwano et al., 1993; Chetta et al., 2003). I meccanismi responsabili
dell’angiogenesi non sono ancora completamente noti. Un’ipotesi possibile è che
l’angiogenesi sia mediata dai mastociti poiché essi producono fattori quali
istamina ed eparina che possono svolgere un ruolo proangiogenetico. È stato
dimostrato che alcuni fattori di crescita tra i quali il VEGF, l’FGF e l’angiogenina
sono correlati all’angiogenesi nell’asma bronchiale (Hoshino et al., 2001) .
Sebbene il significato funzionale delle alterazioni vascolari nell’asma non sia ancora completamente chiaro, è ipotizzabile che tali alterazioni abbiano un ruolo nell’iperreattività bronchiale. È stato dimostrato che un aumento del numero di vasi può contribuire all’ispessimento della parete delle vie aeree, causando un notevole restringimento del lume bronchiale quando avviene la contrazione del muscolo liscio. Le alterazioni vascolari possono contribuire alla broncostruzione anche in modo indiretto: l’edema associato alla proliferazione dei vasi può contribuire sia al restringimento delle vie aeree che al danno subepiteliale tipico dell’asma (Hogg et al., 1987) . Un’altra caratteristica dell’asma è la proliferazione delle cellule muscolari lisce con conseguente aumento della componente muscolare. È stato dimostrato che la percentuale di parete bronchiale occupata dal muscolo liscio è raddoppiata nei soggetti con asma moderato rispetto ai soggetti di controllo non-asmatici, con un aumento volumetrico percentuale dal 50 all’83%
(Woodruff et al., 2004).
Inoltre nei soggetti con asma grave si osserva una riduzione della distanza tra
muscolatura liscia e membrana basale. Le cellule muscolari lisce presenti
normalmente in profondità nella sottomucosa possono differenziarsi e migrare
(Benayounet al., 2003). Questo può avvenire attraverso numerosi meccanismi
quali ad esempio l’ipertrofia, l’iperplasia, la migrazione dei miociti e la loro
differenziazione in fibromiociti e miofibroblasti. In particolare, in risposta allo
stimolo antigenico, le fibrocellule muscolari lisce migrano nella sottomucosa e
formano uno strato muscolare con fenotipo e funzione anomala (Vignola et al.,
2003) .
Il ruolo reciproco del processo infiammatorio cronico e del rimodellamento delle vie aeree nella patogenesi delle alterazioni anatomo-strutturali nell’asma resta tuttora da chiarire. Secondo un’ipotesi accreditata, il processo infiammatorio cronico sarebbe responsabile dello sviluppo delle alterazioni strutturali delle vie aeree che caratterizzano l’asma. Tuttavia, alcuni studi hanno suggerito che il rimodellamento strutturale delle vie aeree non sia la conseguenza dell’infiammazione cronica, ma svolga di per sé un ruolo fondamentale nella patogenesi dell’asma bronchiale. Il gruppo di ricerca di Holgate ha, infatti, ipotizzato che un’alterazione dell’interazione tra cellule epiteliali danneggiate e cellule mesenchimali indifferenziate (epithelial mesenchimal trophic unit – EMTU), svolga un ruolo fondamentale nella patogenesi dell’asma. Le numerose citochine proinfiammatorie prodotte dalle cellule epiteliali in risposta al danno tissutale potrebbero, infatti, sia perpetuare il processo infiammatorio, sia innescare un processo di proliferazione e differenziamento delle cellule mesenchimali verso cellule miofibroblastiche che condurrebbe ad un’aumentata deposizione di matrice extracellulare e di tessuto muscolare. L’interazione tra cellule epiteliali e cellule mesenchimali sarebbe quindi fondamentale nella patogenesi dell’asma e potrebbe spiegare sia l’infiammazione cronica che il rimodellamento strutturale associato alla malattia. Questa ipotesi potrebbe chiarire perché l’utilizzo di farmaci antinfiammatori, che consente il controllo dei sintomi della malattia e migliora notevolmente la qualità di vita dei pazienti asmatici, non sia però in grado di
“guarire l’asma” (Holgate et al., 2003; Holgate et al., 2004).
In sintesi, il quadro anatomo-patologico dell’asma nell’adulto è caratterizzato da
un processo infiammatorio eosinofilico associato ad un rimodellamento strutturale
che comprende ispessimento della membrana basale, desquamazione epiteliale, aumentata vascolarizzazione della parete e alterazioni della muscolatura liscia.
1.2 Meccanismi di proliferazione delle cellule muscolari lisce delle vie respiratorie
Il rimodellamento delle vie aeree nel soggetto asmatico è caratterizzato da una ostruzione correlata a iperplasia (aumento del numero delle cellule) e ipertrofia (aumento delle dimensioni delle cellule) del tessuto muscolare liscio. Il meccanismo molecolare responsabile dell’aumentata proliferazione è ancora da chiarire; tuttavia, numerosi studi hanno identificato diversi mediatori cellulari che intervengono nella promozione della crescita e nella duplicazione cellulare:
Istamina (Panettieri et al.,1990)
5-idrossi triptamina (5-HT) (Hershenson et al., 1995)
Endotelina ET-1 (Noveral et al., 1992)
Leucotriene D
4(Cohen et al., 1995)
-trombina (Panettieri et al., 1995)
-glucuronidasi (Lew et al., 1991)
PDGF (fattori di crescita di derivazione piastrinica) (Hirst et al., 1996)
EGF (fattore di crescita epiteliale) (Tomlinson et al., 1994)
FGF-2 (fattore di crescita dei fibroblasti) (Bonner et al., 1996)
IGFs (fattore di crescita insulinico) (Noverale t al., 1994)
Interleuchina-e interleuchina-6 (De S et al., 1993; 1995)
TNF- (fattore di necrosi tumorale ) (Stewart el al., 1995)
Fibronectina e collagene (Hirst et al., 1997)
I fattori mitogenici delle cellule muscolari bronchiali lisce possono essere divisi in due categorie: recettori attivati da proteine tirosin chinasiche (RTK), quali PDGF, EGF, FGF-2 e IGF; e recettori legati a proteine G, quali -trombina, istamina, serotonina, trombossano, leucotriene D
4.
La più importante via biochimica di proliferazione cellulare legata ai fattori di crescita sembra essere quella connessa ad ERK, che a sua volta attiva la proteina chinasi attivata da mitogeni, MAPK (Figura 3) (Hershenson et al., 1995).
Figrura 3. Reazioni coinvolte nella trasmissione del
segnale mitogenico dopo attivazione dei recettori TK.
L’importanza di ERK è dovuta alla sua capacità di far passare la cellula dallo stadio G
0allo stadio G
idel ciclo cellulare (Hershenson et al., 1997). La cascata di reazioni inizia con il legame dei fattori di crescita all’omonimo recettore di membrana, che porta alla fosforilazione dei residui tirosinici contenuti nella proteina Grb2. Grb2, scambia Sos con la proteina p21-Ras, la cui attivazione comporta l’attivazione di Raf-1, la successiva fosforilazione di MEK-1, e l’attivazione di entrambe le isoforme di ERK, p44
ERK1e p42
ERK2. Queste traslocano nel nucleo e vanno ad attivare ed a favorire la trascrizione di altri elementi della cascata mitogenica quali la proteina attivatrice 1 (AP-1), la proteina del retinoblastoma (pRb) e la ciclina D
1(Kelleher et al., 1995; Malarkey et al., 1995).
Lo studio condotto dall’equipe di Page (1999), ha messo in evidenza l’importanza
della proteina Ras per il passaggio della cellula alla fase S del ciclo cellulare,
dimostrando la presenza di due distinti meccanismi: ERK-dipendente ed ERK-
indipendente. Panettieri e collaboratori (1995) osservarono che la proliferazione
cellulare non veniva solo promossa da fattori di crescita, ma anche da agonisti di
recettori accoppiati a proteine G (Figura 4).
Figura 4. Attivazione della cascata mitogenica dopo stimolazione dei recettori accoppiati a proteine G e cross-talk con i recettori TK.
I meccanismi di proliferazione cellulare non correlati ai recettori tirosin chinasici, sembrano essere legati principalmente all’attivazione dei recettori accoppiati alle proteine G
iche portano all’attivazione di Ras. È stato inoltre evidenziato che anche i recettori accoppiati alle proteine G
q, mediante l’aumento del flusso intracellulare di ioni Ca
2+e l’attivazione sequenziale di Raf-1 ed ERK svolgano un ruolo nella proliferazione delle cellule muscolari liscie delle vie respiratorie (Vichi et al., 1999).
Un’altra via di attivazione della proliferazione delle cellule muscolari lisce
bronchiali è legata all’idrolisi della fosfatidilcolina (PC), che porta ad un’aumento
prolungato dei livelli di DAG e quindi ad una prolungata attivazione della
proteina chinasi C (PKC) che, a sua volta, comporta un aumento del segnale
mitogenico (Nishizuka et al., 1995; Panettieri et al., 1997). Sono state identificate
varie isoforme di PKC, ma le uniche due espresse nelle cellule in stato proliferativo sono la PKC e la PKC. Al contrario, l’isoforma PKC ha dimostrato di ritardare l’ingresso della cellula nella fase G
1attraverso un meccanismo sulle cicline (Fukumoto et al., 1997), suggerendo che l’azione della PKC non è solo quella di promuovere, ma più in generale di modulare la proliferazione cellulare.
Il meccanismo d’azione antiproliferativa dei farmaci glucorticoidi si basa sul blocco del ciclo cellulare in fase G
1, mediante un effetto non citotossico non apoptotico, correlato all’inibizione della fosforilazione di pRb (Fernandes et al., 1999). Anche gli agonisti
2-adrenergici, hanno dimostrato di esercitare un effetto antiproliferativo sulle cellule muscolari lisce bronchiali (Tomlinson et al., 1994);
il loro meccanismo d’azione sembra correlato ad un aumento dei livelli
intracellulari di cAMP (Tomlinson et al., 1995). Inoltre, lo studio effettuato da
Stewart e collaboratori (1999), ha dimostrato che i farmaci
2agonisti, come il
salbutamolo, bloccano il passaggio delle cellule muscolari bronchiali lisce
attraverso le fasi del ciclo cellulare. Nello specifico, inibiscono
l’iperfosforilazione di pRb e l’espressione della ciclina D
1. La variazione
dell’espressione della ciclina D
1ad opera del salbutamolo, non avviene a livello
del mRNA, ma si pensa avvenga a livello post-traslazionale e forse attraverso un
aumento nella degradazione della ciclina stessa (Stewart et al., 1999). Altro
meccanismo antiproliferativo imputabile al salbutamolo è quello di prevenire
l’attivazione di ERK, che normalmente è attivata dalla -trombina; la mancanza o
il ritardo nell’attivazione di ERK attraverso al proteina G
i, porta al blocco del
ciclo cellulare (Kelleher at al., 1995; Malarkey et al., 1995).
1.3 Recettore
adrenergico
1.3.1 Struttura recettoriale
Il gene umano che codifica per il recettore
-adrenergico (
2-AR) è situato sul braccio lungo del cromosoma 5 ed è costituito da 1.200 paia basi (Kobilka et al., 1987). Il recettore è una proteina di 46,5 Kda costituita da 413 residui amminoacidici (Kobilka et al., 1987), distribuiti in 7 domini transmembranari tra i quali se ne riconoscono 3 extracitoplasmatici, con la porzione ammino-terminale, e 3 intracitoplasmatici, con la porzione carbossi-terminale. Il recettore viene attivato mediante N-glicosilazione sugli amminoacidi 6, 15 e 187; un processo importante non solo per l’inserimento all’interno della membrana cellulare, ma anche per il legame del recettore con l’agonista (Johnson, 2006). La presenza dell’amminoacido cisteina in posizione 341 è fondamentale per l’ancoraggio della catena carbossi-terminale con la membrana citoplasmatica (O’Dowd et al., 1989).
1.3.2 Attivazione del recettore e trasduzione del segnale
L’attivazione del recettore
-AR comporta l’incremento intracellulare dei livelli
di cAMP (Robison et al., 1967). Questo è il risultato della stimolazione
dell’adenilato ciclasi, che catalizza la conversione dell’adenosin trifosfato (ATP)
in cAMP. L’attivazione della proteina trimerica G
ssi ottiene tramite il legame tra
recettore
e adenilato ciclasi (Figura 5).
Figura 5. Attivazione recettore
2-AR.
La proteina G è costituita da una subunità (che stimola l’adenilato ciclasi) e le subunità (che trasducono il segnale). I livelli di cAMP, sono regolati dalle fosfodiesterasi, che degradano il cAMP in 5’-AMP.
Il meccanismo tramite il quale cAMP determina il rilassamento della muscolatura liscia respiratoria non è del tutto chiaro, ma sembra ciò si realizzi mediante l’attivazione della proteina chinasi A (PKA), che a sua volta fosforila proteine- chiave coinvolte nel processo di contrazione muscolare (Johnson et al., 1995).
Il cAMP inoltre, risulta essere un inibitore del rilascio del calcio (Ca
2+) dai
depositi intracellulari, inibendone anche l’ingresso nella cellula e portando ad un
rilassamento della muscolatura liscia. Comunque è stato visto recentemente che alcune risposte indotte dai
agonisti sono mediate da meccanismi cAMP- indipendenti, che coinvolgono direttamente la proteina G
se i canali al potassio (K
+) presenti nelle cellule muscolari lisce dell’albero respiratorio (O’Dowb et al., 1989).
I recettori
possono essere accoppiati anche a proteine G
i(Daaka et al., 1997). Il risultato di questa associazione è la stimolazione di un segnale intracellulare che porta all’attivazione della p38MAPK, una proteina chinasi coinvolta nella trasmissione del segnale mitogenico. Per l’attivazione di questa via è necessaria la fosforilazione PKA-mediata del recettore
l’assemblaggio di proteine intracellulari come Raf, Csrc, RAS con la subunità della proteina G, e l’attivazione di MAPK (Daaka et al., 1997).
Da studi recenti è emerso, inoltre, che l’attivazione di questa via porta alla fosforilazione, da parte della MAPK, del recettore glucocorticoide (GR) rendendolo più sensibile all’azione degli steroidi (Johnson, 2002). L’attivazione del recettore
-ARporta anche alla traslocazione del recettore GR dal citoplasma al nucleo, uno dei passaggi fondamentali nel meccanismo d’azione di questi farmaci Roth et al., 2002).
1.3.4 Interazione del recettore
-AR con i farmaci agonisti
I residui amminoacidici del recettore β
2-AR che prendono parte al legame con
l’agonista sono: l’aspartato 113, localizzato nel terzo dominio, i residui di serina
nelle posizioni 2, 204 e 207 nel quinto dominio e l’asparagina 293 nel sesto dominio extracellulare (Liggett, 2002).
Il legame tra recettore e agonista avviene tramite alcuni residui amminoacidici del recettore e gruppi funzionali presenti nel ligando. I due gruppi serinici interagiscono con il gruppo idrossilico presente sull’anello fenilico dell’agonista
adrenergico, mentre il gruppo idrossilico, presente nel
agonista, lega l’asparagina 293 (Liggett, 2002). La struttura molecolare dei
agonisti, determina il modo in cui viene attivato il recettore adrenergico
Ad esempio,
gli short-acting come il salbutamolo, che presenta una natura idrofilica, accedono al
sito d’azione recettoriale tramite il compartimento acquoso extracellulare (Johnson, 2000). Questi farmaci si legano rapidamente al sito d’azione e la durata dell’effetto terapeutico è di circa 4-6 ore.
I
agonisti long acting, come il formeterolo, hanno un differente meccanismo d’azione: essendo più lipofili, formano un deposito all’interno della membrana cellulare, da dove progressivamente il farmaco viene solubilizzato nel fluido extracellulare e può così interagire con il recettore.
1.3.5 Desensibilizzazione recettoriale
Associato con l’attivazione del recettore
-adrenergico vi è il processo
autoregolatorio di desensibilizzazione recettoriale. Questo processo avviene
fisiologicamente per preservare il recettore da una sovrastimolazione indotta da
agonisti endogeni ed esogeni. La desensibilizzazione avviene in seguito al legame
tra recettore e agonista ed i meccanismi attraverso i quali può avvenire sono di 3 tipi (Figura 6): (1) disaccoppiamento tra recettore e adenilato ciclasi, (2) internalizzazione del recettore non accoppiato e (3) down-regulation.
Figura 6. Desensibilizzazione del recettore
2-AR.
1. Il legame tra recettore e agonista innesca quasi immediatamente la fosforilazione di specifici residui amminoacidici di serina e treonina nel terzo loop intracitoplasmatico e nella terminazione carbossi-terminale del recettore. Il
2-AR è fosforilato dalla PKA o da chinasi specifiche delle proteine G (GRK) (Bouvier at al., 1988, 1989; Hausdorff et al., 1989).
Il legame dell’agonista con il recettore porta ad una immediata
traslocazione del GRKs dal citoplasma alla membrana e alla successiva
fosforilazione del recettore. Una volta ultimata la fosforilazione, la - arrestina si lega la recettore, non permettendo più l’accoppiamento del recettore con la proteina G
s, limitando così la funzionalità recettoriale stessa. L’azione della -arrestina si esplica anche mediante il legame con altre proteine, come la fosfodiesterasi IV (Johnson, 2006).
L’attivazione di altri reccetori, che utilizzano cAMP come secondo messaggero, possono indurre desensibilizzazione eterologa del recettore
2-AR, a causa della formazione di cAMP e della successiva attivazione di PKA. La desensibilizzazione omologa, invece, è la risultante dell’attivazione combinata di PKA e GRK.
2. L’arrestina, non svolge solo un importante ruolo nel disaccoppiamento
recettoriale, ma è anche un mediatore cruciale coinvolto
nell’internalizzazione del recettore, infatti vi è una forte connessione tra la
fosforilazione del recettore
2-AR e il legame della -arrestina con il
processo di endocitosi di
2-AR. Una delle funzioni della -arrestina è
quella di collegare il recettore
2-AR con il sistema di endocitosi,
costituito da clatritina e
2-adattatore (la subunità-della proteina
adattatore AP2) (Goodman et al., 1997; Laporte et al., 1999, 2000). In
seguito all’internalizzazione, il recettore
2-AR può andare incontro a
defosforilazione da parte degli enzimi endosomiali ed essere riciclatato
sulla membrana cellulare, oppure può essere degradato dai lisosomi
(Campbell et al., 1991; Barak et al., 1994). L’internalizzazione e la
degrazione lisosomiale del recettore
2-AR comportano la necessità della neosintesi del recettore, affinché venga nuovamente espresso.
3. La down-regulation del recettore
2-AR è un processo che porta alla desensibilizzazione, come risultato di eventi trascrizionali. Lo studio condotto da Hadcock e Malbon (1988) ha dimostrato che in seguito all’esposizione all’agonista forskolina, alla concentrazione M per 18 ore, si ha una riduzione del 50% dei livelli di espressione del recettore.
Oltre alla capacità dei -agonisti di indurre desensibilizzazione omologa, altri stimoli sono capaci di ridurre la risposta -adrenergica, un processo definito desensibilizzazione eterologa.
Ad esempio, gli agonisti muscarinici hanno al capacità di attivare la subunità inibitrice G
idelle proteine G portando ad un’inibizione dell’adenilato ciclasi e attenuando la risposta del -agonista attraverso l’attivazione di PKC (Grandorby et al., 1994). Inoltre, uno studio recentemente pubblicato da Ahiua e collaboratori (2008), ha dimostrato che la desensibilizzazione eterologa dei recettori
2-AR, risultante da una esposizione prolungata alla PGE
2o alla forskolina, è mediata da un aumento dell’ attività della PDE4.
Numerose citochine, quali IL-1, TNF, IL-5 e TGF riducono la capacità delle cellule muscolari bronchiali lisce di generare cAMP. Le citochine, non alterano l’espressione della PKA e non hanno effetto sulla risposta cellulare alla forskolina, un agente che attiva direttamente l’adenilato ciclasi (Shore et al., 1997;
Laporte et al., 1998; Pang et al., 1998; Pascual et al., 2001). Questi risultati
suggeriscono che il meccanismo di desensibilizzazione, in questo caso, si realizzi a livello dell’accoppiamento tra recettore -adrenergico e proteina G
s(Shore et al., 1997). Inoltre, l’effetto dell’ IL-1 è dipendenete dall’attivazione di ERK e p38 MAPK (Laporte et al., 1999; Gerthoffer et al., 2003).
Uno degli aspetti fisiopatologici più rilevanti che caratterizzano il paziente asmatico è l’espressione, nei bronchi, delle citochine derivanti dai linfociti Th2, IL-4 e IL-13, le quali esplicano la loro azione attraverso il recettore di tipo II per l’
IL-4, un dimero costituito dalle subunità IL-4R e IL-13R1 (Laporte et al., 2001; Hirst et al., 2002). Il legame di IL-13 o IL-4 al recettore, provoca l’attivazione della chinasi Jak e la fosforilazione dei residui tirosinici presenti sulle due subunità recettoriali. La fosforilazione della tirosina nella regione 14R di IL-4R, porta al reclutamento di IRS-1/2 e alla sua attivazione da parte della chinasi Jak. La fosforilazione di IRS-1/2 conduce all’associazione tra la proteina adattatrice Grb2 e Sos e all’attivazione di Ras che, in ultima analisi, porta all’attivazione della proteina ERK. La proteina ERK contribuisce alla desensibilizzazione del recettore
2-AR attraverso il disaccoppiamento tra
2-AR e G
s(Laporte et al., 2001).
1.4 Glucocorticoidi
L’azione dei glucocorticodi è mediata dal recettore intracellulare GR, che
appartiene alla famiglia dei recettori nucleari. Il gene umano che codifica per il
recettore (hGR) è localizzato sul cromosoma 5 ed è costituito da 9 esoni. In base al differente splicing si possono ottenere 3 diversi tipi di mRNA: quelli relativi ai recettori hGR e hGR, che differiscono per l’esone 9 (9 e 9) e l’mRNA contenente l’esone 9, il 9 ed una “J region”. Si ritiene che questo mRNA possa essere tradotto sia in hGR che hGR (Oakley et al., 1996). Delle due isoforme, solo hGRα ha la capacità di legare i corticosteroidi, mentre hGRβ interagisce con il DNA inibendo il legame tra hGRα e DNA (Lewis-Tuffin et al., 2006).
Il meccanismo d’azione del recettore hGR si può articolare in diversi punti:
• Legame con il ligando e dissociazione dalle proteine dello shock termico (in particolare hsp90).
• Fosforilazione e traslocazione nel nucleo.
• Omodimerizzazione e legame con il DNA (GR può legare specifiche sequenze del DNA chiamate GREs, ossia Glucocorticoid Response Elements).
• Transattivazione, ossia attivazione della trascrizione genica mediante il legame con positive GRE.
• Inibizione dell’espressione di alcuni geni mediante legami con negative GRE o attraverso meccanismi non mediati dal legame al DNA.
Studi recenti hanno evidenziato che nei pazienti con asma potenzialmente letale è
stata riscontrata una maggiore espressione dell’isoforma hGR nelle cellule
infiammatorie delle vie aeree rispetto a soggetti sani (Christodoulopoulos et al.,
2000). Inoltre è stato evidenziato che la sovraespressione della forma hGR, la
down-regulation omologa e la trans-repressione di GR mediata da NF-kB, sono
meccanismi responsabili della resistenza ai glucocorticoidi e della diminuzione della loro efficacia clinica (Schaaf et al., 2002).
I principali effetti antinfiammatori/immunosoppressivi dei glucocorticoidi sono i seguenti:
Inibizione della via dell’NF-kB (inibizione della sintesi di proteine proinfiammatorie e immunostimolanti).
Sintesi di proteine antinfiammatorie ed immunosoppressive (IkB).
Azione stabilizzante sulla membrana cellulare e lisosomiale.
Depressione della reazione antigene-anticorpo.
Inibizione della permeabilità e della dilatazione capillare.
Attivazione adrenergica per stimolazione della feniletanolamina-N- metiltransferasi.
Sensibilizzazione dei β-recettori alle catecolamine.
Inibizione della biosintesi di mucopolisaccaridi.