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Studio in vitro dell’interazione tra salbutamolo e agonisti PPAR-γ in cellule

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(1)

U NIVERSITÀ DI P ISA

F ACOLTÀ DI F ARMACIA Corso di Laurea Specialistica in

F ARMACIA

Tesi di Laurea

Studio in vitro dell’interazione tra salbutamolo e agonisti PPAR-γ in cellule

di muscolatura liscia bronchiale

Relatore

Prof.ssa Maria Cristina Breschi

Correlatore

Dott. Stefano Fogli

Candidato

Luca Picchianti

Anno accademico 2008/2009

(2)

Indice

Indice ... 2  

1. Introduzione ... 4  

1.1 Elementi di fisiopatologia dell’asma ... 4  

1.1.1 Cellule infiammatorie ... 11  

1.1.2 Mediatori chimici coinvolti nella patogenesi dell’asma ... 15  

1.1.3 Patogenesi immunologica dell’infiammazione ... 16  

1.1.4 Remodeling delle vie aeree ... 18  

1.2 Meccanismi di proliferazione delle cellule muscolari lisce delle vie respiratorie ... 22  

1.3 Recettore 

adrenergico ... 27  

1.3.1 Struttura recettoriale ... 27  

1.3.2 Attivazione del recettore e trasduzione del segnale ... 27  

1.3.4 Interazione del recettore 

-AR con i farmaci agonisti ... 29  

1.3.5 Desensibilizzazione recettoriale ... 30  

1.4 Glucocorticoidi ... 34  

1.4.1 Interazione tra glucorticoidi e 

-agonisti ... 36  

1.5 Recettori attivati dai proliferatori perossisomiali (PPAR) ... 38  

1.5.1 Caratteristiche strutturali e meccanismi biologici dei PPAR ... 39  

1.5.2 PPAR- ... 42  

1.5.2.1 Ruolo dei PPAR- nell’infiammazione ... 43  

1.6 Rho chinasi ... 45  

1.6.1 Struttura e attivazione di Rho chinasi ... 46  

1.6.2 Meccanismo di contrazione delle cellule muscolari respiratorie ... 46  

1.6.3 Desensibilizzazione del recettore 

-adrenergico ... 47  

1.6.4 Azione chemotattica sugli eosinofili ... 48  

1.6.5 Proliferazione cellulare ... 48  

2. Scopo della ricerca ... 49  

3. Materiali e metodi ... 50  

3.1 Composti chimici ... 50  

3.1.1 Salbutamolo ... 50  

3.1.2 Rosiglitazone ... 51  

3.1.3 15-deossi-12,14-prostaglandina J2 ... 52  

3.1.4 Desametasone ... 52  

3.1.5 GW9662 ... 53  

3.1.6 Butoxamina cloroidrato ... 54  

3.1.7 Mifepristone ... 54  

3.2 Linea cellulare ... 55  

(3)

3.3 Terreno di coltura ... 56  

3.4 Valutazione della proliferazione cellulare ... 57  

3.5 Indice di combinazione (Combination Index, CI)... 58  

3.6 Analisi dell’apoptosi ... 59  

3.7 Modello in vitro di desensibilizzazione omologa ... 62  

3.8 Analisi RT-PCR ... 63  

3.9 Analisi EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) ... 65  

4 Risultati e discussione ... 66  

4.1 Desensibilizzazione omologa del β

2

-AR ... 66  

4.2 Proliferazione delle BSMC ... 75  

6. Conclusioni ... 84  

7. Bibliografia ... 86  

(4)

1. Introduzione

1.1 Elementi di fisiopatologia dell’asma

L’asma costituisce un problema sanitario importante, non solo in termini di costi diretti ma anche come perdita di produttività lavorativa e ridotta partecipazione alla vita familiare (Gina report, 2006). Le linee guida GINA (Global Initiative for Asthma) aggiornate al 2006, definiscono l’asma come una malattia cronica delle

vie aeree caratterizzata da ostruzione bronchiale più o meno accessionale, reversibile spontaneamente o in seguito a terapia farmacologica, da iperreattività bronchiale e da un accelerato declino della funzionalità respiratoria che può evolvere, in alcuni casi, in una ostruzione irreversibile delle vie aeree.

Ostruzione bronchiale

Gli episodi ricorrenti di broncoostruzione nell’asma sono dovuti al contributo di

diversi meccanismi, tutti associati ad infiammazione delle vie aeree, quali la

contrazione della muscolatura liscia, l’edema della parete bronchiale, la

formazione di tappi di muco che occludono il lume e le alterazioni strutturali della

parete delle vie respiratorie (Figura 1). La broncocostrizione acuta nel paziente

asmatico è un evento che si può verificare in quanto le vie aeree sono

particolarmente reattive ad una molteplicità di stimoli, quali gli allergeni,

l’esercizio fisico, l’aria fredda, i fumi, le sostanze chimiche e le forti emozioni. In

questi casi la broncocostrizione è dovuta alla combinazione di meccanismi diversi

che agiscono direttamente, causando la contrazione delle cellule muscolari lisce

(5)

tracheobronchiali, o indirettamente, attraverso il rilascio di mediatori dalle cellule infiammatorie o la stimolazione, a livello centrale o locale, di riflessi neuronali.

Anche la somministrazione di farmaci -bloccanti può scatenare una broncocostrizione acuta, a volte anche grave causata dal fatto che, se si blocca l’effetto rilasciante 

-adrenergico, il sistema non è più in grado di contrastare l’azione dei mediatori broncocostrittori (in particolare l’acetilcolina) (Barnes, 1992).

Figura1. Effetti della patologia asmatica a livello delle vie respiratorie

Contrattilità della muscolatura liscia

I meccanismi responsabili della broncocostrizione acuta dipendono dal tipo di

stimolo che la causa. La broncocostrizione acuta indotta da allergeni presenti

nell’aria è causata dal rilascio (IgE-dipendente), da parte dei mastociti, di

mediatori quali istamina, prostaglandine e leucotrieni, che sono tutti in grado di

stimolare la contrazione della muscolatura liscia delle vie respiratorie (Holgate,

1993).

(6)

Meccanismi non ancora identificati, ma comunque legati al rilascio di mediatori, ed in particolare di leucotrieni, sono coinvolti nell’asma indotto da farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) (Istrael et al., 1993; Szczeklik et al., 2001).

Edema della parete delle vie aeree

La broncoostruzione, può essere provocata anche da un rigonfiamento della parete delle vie aeree dovuto ad edema, indipendentemente dalla contrazione della muscolatura liscia. L’edema delle vie aeree è una conseguenza dell’aumento della permeabilità del microcircolo bronchiale soprattutto nella zona che si trova all’esterno della muscolatura liscia, con conseguente perdita della forza di retrazione elastica. Sia il rigonfiamento delle vie aeree che la perdita di forza di retrazione elastica possono contribuire all’iperresponsività bronchiale caratteristica dell’asma (James et al., 1989; Hogg et al., 1993).

Alterazioni strutturali

La broncoostruzione, in alcuni pazienti, risulta essere irreversibile anche dopo un lungo ciclo di terapia con glucocorticoidi somministrati ad alte dosi per via orale.

Questa componente non reversibile della broncoostruzione potrebbe essere dovuta

allo sviluppo di alterazioni strutturali associate all’infiammazione cronica delle

vie aeree o a meccanismi meno conosciuti che comportano un difetto nella

risposta ai glucocorticoidi. Nei pazienti con asma lieve, anche in assenza di

sintomi e di una chiara broncoostruzione, ci può essere una iperresponsività

(7)

bronchiale associata ad una lieve infiammazione delle vie respiratorie (Jacoby et al., 2001).

Iperresponsività bronchiale

Una componente fisiopatologica importante dell’asma è rappresentata dall’aumento, rispetto ai soggetti normali, della reattività della muscolatura liscia tracheo-bronchiale in risposta a numerosi stimoli endogeni ed esogeni. Tra i vari meccanismi proposti per spiegare questa iperresponsività bronchiale, il più importante è l’infiammazione delle vie aeree.

L’ipersecrezione di muco

L’aumentata secrezione di muco e di essudati infiammatori nelle vie respiratorie può condurre all’occlusione del lume (“tappo di muco“). Nella patogenesi di queste alterazioni partecipano numerosi meccanismi, in particolare l’infiltrazione di cellule infiammatorie, il rilascio di mediatori ed il rimodellamento delle vie aeree. Clinicamente, l’asma si manifesta con dispnea, respiro sibilante, tosse, senso di costrizione toracica, la cui intensità varia in rapporto all’entità dell’ostruzione bronchiale ed al grado di percezione da parte del paziente (Gina report, 2006).

Gli eventi alla base della patologia asmatica possono essere riassunti con la

presenza di un’intensa infiltrazione di eosinofili e linfociti, accompagnata da

distruzione dell’epitelio, vasodilatazione e stravaso proteico a livello

microvascolare. Sono inoltre presenti cambiamenti strutturali, quali iperplasia e

(8)

ipertrofia della muscolatura liscia, neoangiogenesi (Dunnill, 1960), aumento del numero delle cellule mucipare caliciformi nell’epitelio bronchiale e deposizione di collagene nella regione immediatamente sottostante l’epitelio (che porta ad un ispessimento della membrana basale subepiteliale). Il processo infiammatorio sia acuto che cronico è irregolarmente distribuito lungo l’albero bronchiale ed arriva ad interessare anche le vie aeree più piccole (<2 mm di diametro) ed il parenchima polmonare (Kraft et al., 1996).

In tutte le forme d’asma, i mastociti e gli eosinofili svolgono il ruolo di cellule effettrici nella risposta infiammatoria, poiché sono in grado di secernere numerosi mediatori infiammatori preformati o neoformati che possono agire sulle vie aeree sia direttamente che indirettamente, per esempio attraverso meccanismi neurogeni (Jacoby et al., 2001).

Recentemente l’uso di metodiche di biologia cellulare e molecolare ha permesso di dimostrare che i linfociti T sono le cellule che orchestrano la risposta infiammatoria attraverso il rilascio di diverse citochine multifunzionali (Robinson et al., 1992). Non è ancora chiaro se l’attivazione dei linfociti T, osservata nell’asma, sia caratteristica esclusiva di questa patologia, ma quest’ipotesi sembra alquanto improbabile, dato che altre malattie infiammatorie croniche delle vie aeree, come la bronchite cronica e le bronchiectasie, sono caratterizzate da una notevole infiltrazione linfocitaria (Saetta et al., 1993).

Inoltre nel processo di mantenimento della risposta infiammatoria, è considerato

sempre più importante il ruolo delle cellule “strutturali” delle vie aeree (in

particolare, fibroblasti, cellule epiteliali, cellule endoteliali e cellule della

muscolatura liscia bronchiale), anch’esse in grado di produrre un’ampia gamma di

(9)

citochine ad azione immunoregolatrice (Kraft et al., 1996; Holgate et al., 2000) o in grado di indurre alterazioni strutturali e di promuovere la chemiotassi di cellule infiammatorie (Box 1).

Box 1.

Le cellule strutturali sono anche responsabili del rilascio di potenti mediatori infiammatori, i quali inducono la contrazione del muscolo liscio, aumentano la permeabilità del microcircolo bronchiale, attivano alcuni tipi di neuroni sensitivi e stimolano le cellule mucosecernenti. In particolare, l’epitelio rappresenta una delle principali strutture-bersaglio del danno tissutale in quanto risulta essere specificamente danneggiato, desquamato e trasformato da ciliato pseudostratificato a monostrato di cellule basali (Montefort et al., 1992).

C

ELLULE

S

TRUTTURALI

Cellule epiteliali delle vie aeree

Esprimono una varietà di proteine infiammatorie nell’asma, rilasciano citochine, chemochine, mediatori lipidici, ed interagiscono con i virus e le sostanze inquinanti dell’aria.

Cellule muscolari lisce

Esprimono proteine infiammatorie simili a quelle delle cellule epiteliali (Chung et al., 2000).

Cellule endoteliali

Le cellule endoteliali della circolazione bronchiale svolgono un ruolo nel reclutamento di cellule infiammatorie dal sistema circolatorio alle vie aeree.

Fibroblasti e miofroblasti

I fibroblasti e i miofibroblasti producono i componenti del tessuto connettivo, quali i collageni e i proteoglicani, che sono coinvolti nel rimodellamento delle vie aeree.

Cellule nervose delle vie aeree

I nervi delle vie aeree sono maggiormente rappresentati da quelli colinergici, i quali,

possono essere attivati da stimoli riflessi nelle vie aeree e causare broncocostrizione e

secrezione di muco. Le cellule nervose possono essere sensibilizzate dagli stimoli

infiammatori come le neurotrofine, che causano alterazioni riflesse e sintomi quali

tosse ed oppressione toracica, e possono liberare neuropeptidi infiammatori

(Groneberg et al., 2004).

(10)

Nel tentativo di riparare il danno subito, le cellule epiteliali basali ed i miofibroblasti direttamente sottostanti l’epitelio possono proliferare e costituire connettivo interstiziale a livello della lamina reticularis della membrana basale.

La lesione ed il successivo processo di riparazione, con abnorme risposta delle cellule strutturali, rappresentano un meccanismo plausibile per l’ispessimento della membrana basale subepiteliale che si osserva nell’asma (Brewster et al., 1990).

Altre alterazioni strutturali riscontrabili nell’asma bronchiale sono l’ipertrofia e l’iperplasia delle cellule muscolari lisce, l’aumento delle cellule caliciformi mucosecernenti, l’aumento del volume delle ghiandole della sottomucosa bronchiale ed il rimodellamento del tessuto connettivo nella parete bronchiale. Il rilascio di mediatori e la regolazione del processo infiammatorio avvengono attraverso meccanismi estremamente complessi che, una volta instaurati, sono in grado di automantenersi. Infiammazione e rimodellamento strutturale caratterizzano, quindi, il quadro anatomo-patologico delle vie aeree nell’asma bronchiale.

1.1.1 Infiammazione delle vie aeree nell’asma

L’infiammazione cronica delle vie aeree è una caratteristica della malattia

asmatica. L’infiammazione è persistente (nonostante i sintomi della malattia

asmatica siano episodici), anche se non è stato ancora chiaramente definito il

rapporto fra gravità dell’asma ed entità del processo infiammatorio (Cohn et al.,

2004; Bousquet et al., 2000). L’infiammazione interessa tutte le vie aeree, ma in

particolar modo i bronchi di medie dimensioni. Diversi elementi cellulari e

(11)

numerosi mediatori (Figura 2) risultano avere un ruolo nella modulazione della risposta infiammatoria nelle vie respiratorie (Wenzel, 2003).

Figura2. Fisiopatologia dell’asma

1.1.1 Cellule infiammatorie

Eosinofili. Gli eosinofili possiedono un ampio spettro di proprietà

biologiche, come la capacità di rilasciare proteine tossiche dai loro granuli,

radicali liberi dell’ossigeno, eicosanoidi (leucotrieni solfo-peptidici) (Busse at

al., 1994), fattore attivante le piastrine (PAF), citochine analoghe a quelle

prodotte dai Th2 (Ying et al., 1995; Broide et al., 1992) e una varietà di fattori

(12)

di crescita (Weller, 1991; Venge et al., 1987). La loro capacità di secernere mediatori può essere attivata da meccanismi sia immunologici che non immunologici (Venge et al., 1987).

Gli eosinofili attivati possono far iniziare la contrazione del muscolo liscio nelle vie aeree umane (Weller, 1991), aumentare la permeabilità microvascolare (Collins et al., 1993) e indurre iperresponsività bronchiale (Leff, 1994). Nei campioni bioptici bronchiali, prelevati da soggetti con asma cronico è stato rilevato un aumentato numero di eosinofili attivati, prevalentemente al di sotto della membrana basale. La maggior parte delle persone con asma allergico o non allergico, comprese quelle con asma lieve, hanno eosinofili nel lume e nella parete delle vie aeree. Inoltre, è stata riscontrata un’associazione significativa, sebbene variabile, tra attivazione degli eosinofili, gravità dell’asma e iperresponsività delle vie aeree (Bradley et al., 1991).

Mastociti. I mastociti si localizzano nei bronchi sia di soggetti normali sia

di quelli asmatici. Oltre a rilasciare mediatori autacoidi, i mastociti sono

un’importante fonte di citochine e di proteasi neutre, specialmente di triptasi,

che agiscono su substrati proteici, come ad esempio i recettori attivati da

proteasi (Pesci et al., 1993; Koshino et al., 1995). I mastociti attivati rilasciano

mediatori broncocostrittori (istamina, cistenil-leucotrieni, prostaglandina D

2

)

(Galli et al., 2005). Queste cellule sono attivate da allergeni, tramite i recettori

IgE ad alta affinità, o da stimoli osmotici (broncocostrizione indotta da

esercizio fisico). L’aumentato numero di mastociti nella muscolatura liscia

(13)

delle vie aeree è stato messo in relazione all’aumentata iperreattività bronchiale (Robinson et al., 2004).

Linfociti. I linfociti T, presenti in numero elevato nelle vie aeree, rilasciano citochine specifiche, comprese IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13, che orchestrano l’infiammazione eosinofilica e la produzione di IgE dai linfociti B (Larche et al., 2003).

Un aumento nell’attività delle cellule Th2 può essere dovuto in parte ad una riduzione delle cellule T regolatrici che normalmente inibiscono le cellule Th2. Ci può anche essere un aumento delle cellule iNKT, che rilasciano grandi quantità di citochine Th1 e Th2 (Akbari et al., 2006).

Le cellule dendritiche, catturano gli allergeni dalla superficie delle vie aeree e migrano ai linfonodi regionali, dove interagiscono con le cellule T regolatrici ed infine stimolano la produzione delle cellule Th2 da cellule T naïve98.

Neutrofili. I neutrofili sono aumentati nelle vie aeree e nell’espettorato di

pazienti con asma grave e negli asmatici fumatori, ma il ruolo fisiopatologico

di queste cellule è incerto ed il loro aumento può persino essere dovuto alla

terapia con corticosteroidi (Ying et al., 1995). I neutrofili polimorfonucleati

sono stati considerati per lungo tempo come cellule in stadio di

differenziazione terminale, incapaci di sintesi proteica e deputate solo a ruolo

di effettori passivi dell’infiammazione attraverso la fagocitosi e il rilascio di

enzimi preformati e di composti citotossici (Leckie et al., 2000; Lloyd et al.,

(14)

1992; Wenzel et al., 1997). Tuttavia i neutrofili possono sintetizzare un’ampia varietà di enzimi tra cui proteasi, che degradano la matrice extracellulare (per esempio la MMP-9 e l’elastasi), specie reattive dell’ossigeno, citochine e chemochine come IL-1β, TNF-α, IL-6 e IL-8. I neutrofili sono aumentati nelle vie aeree di pazienti con asma persistente, durante le riacutizzazioni dovute a virus respiratori o dopo l’esposizione ad inquinanti inalatori, ma il loro ruolo nella fisiopatologia dell’asma grave necessita ancora di chiarimenti (Frangova et al., 1996; Ronchi et al., 1996).

Macrofagi. I macrofagi sono aumentati nelle vie aeree del paziente asmatico

e possono essere attivati da allergeni tramite i recettori a bassa-affinità delle

IgE, per liberare i mediatori infiammatori e le citochine che amplificano la

risposta infiammatoria (Peters-Golden, 2004). I macrofagi tissutali hanno la

capacità di secernere un’ampia varietà di prodotti, molti dei quali svolgono un

ruolo di rilievo nei processi di danno e riparazione (Nathan, 1987). Essi

sintetizzano e secernono l’attivatore del plasminogeno e un gruppo di

metalloproteasi che possono degradare varie macromolecole della matrice

extracellulare come l’elastina (Malech et al., 1987). I macrofagi possono

anche essere coinvolti nel rimodellamento delle vie aeree tramite la secrezione

di fattori di crescita come quello derivato dalle piastrine (PDGF), il fattore di

crescita basico dei fibroblasti (b-FGF) e il fattore di crescita trasformante

(TGF-β) (Vignola et al., 1996).

.

(15)

1.1.2 Mediatori chimici coinvolti nella patogenesi dell’asma

Chemochine. Le chemochine sono importanti nel reclutamento delle cellule infiammatorie nelle vie aeree e sono espresse prevalentemente nelle cellule epiteliali (Wenzel, 2003). L’eotassina è relativamente selettiva per gli eosinofili, mentre le chemochine correlate all’attivazione timica (TARC) e le chemochine derivate da macrofagi (MDC) reclutano le cellule Th2.

Cistenil-leucotrieni. I cistenil-leucotrieni sono potenti broncocoscrittori principalmente derivati dai mastociti e la loro inibizione farmacologica comporta un notevole beneficio clinico nell’asma che consiste in un miglioramento della funzione polmonare e della sintomatologia asmatica (Miller et al., 2004).

Citochine. Le citochine modulano la risposta infiammatoria nell’asma e ne determinano la gravità (Ricciardolo et al., 2004). Le citochine più importanti comprendono l’IL-1β e il TNF-α, che amplificano la risposta infiammatoria, ed il GM-CSF che prolunga la sopravvivenza degli eosinofili. Le citochine derivate dai linfociti Th2 includono IL-5, necessaria per la differenziazione e la sopravvivenza degli eosinofili; IL-4, importante per la differenziazione delle cellule Th2, IL-13, necessaria per formazione di IgE.

Istamina. E’ un mediatore chimico liberato dai mastociti che contribuisce

alla broncocostrizione ed alla risposta infiammatoria.

(16)

Ossido Nitrico (NO). E’ una molecola prodotta principalmente dall’azione dell’enzima ossido nitrico sintetasi inducibile delle cellule epiteliali. L’NO nell’esalato viene valutato, in quanto marker associato con la presenza d’infiammazione nell’asma, per monitorare l’efficacia del trattamento antiasmatico (Smith et al., 2005).

Prostaglandina D

2.

E’ una prostaglandina ad attività broncocostrittrice prodotta principalmente dai mastociti e coinvolta nel reclutamento delle cellule Th2 nelle vie aeree.

1.1.3 Patogenesi immunologica dell’infiammazione

Il sistema immunitario è regolato da processi mediati da anticorpi e da cellule (Roit, 1992). I processi immuno-mediati sono caratterizzati dalla produzione e dalla secrezione di anticorpi specifici da parte dei linfociti B, mentre i processi cellulo-mediati dipendono dai linfociti T. I linfociti T controllano le funzioni dei linfociti B ed esercitano anche azioni proinfiammatorie attraverso l’attività citotossica (da parte dei linfociti T “killer” CD8+) e la secrezione di citochine.

Sono stati caratterizzati almeno due distinti sottotipi di linfociti T-helper (Th) CD4+, sulla base del loro profilo di produzione di citochine (Romagnani, 1994;

Humbert et al., 1997).

Benché entrambi i sottotipi cellulari secernano IL-3 e GM-CSF, il sottotipo Th1

produce preferenzialmente IL-2, che stimola la proliferazione dei linfociti T,

(17)

interferone- (IFN-) (che inibisce l’attivazione dei linfociti B e la sintesi di IgE) e il fattore di necrosi tumorale- (TNF-) (Romagnani, 1994; Humbert et al., 1997).

Il sottotipo Th2, principalmente coinvolto nell’asma, secerne le citochine IL-4, IL-5, IL-9, IL-13 ed IL-16.

Le citochine di tipo Th2 sono responsabili dello sviluppo della classica reazione di ipersensibilità ritardata o cellulo-mediata. L’IL-4 è una citochina cruciale nella risposta allergica, promuovendo il passaggio nelle cellule B verso la sintesi di IgE, dirigendo i linfociti T verso una via di differenziazione di tipo Th2, aumentando l’espressione della molecola di adesione VCAM-1 e controllando il livello di espressione di IgE Fcε, di recettori di citochine e chemochine e dei leucotrieni coinvolti nella cascata della reazione allergica (Holt et al., 1999).

Un passaggio cruciale nello sviluppo di una risposta immunitaria è costituito dall’attivazione dei linfociti T da parte di antigeni ad essi adeguatamente presentati dalle cellule accessorie, un processo che coinvolge le molecole del complesso maggiore di istocompatibilità, MHC (le molecole MHC di classe II sui linfociti T CD4+ e le molecole MHC di classe I sui linfociti T CD8+). Le cellule dendritiche sono le principali cellule che presentano gli antigeni nelle vie aeree.

Esse originano da precursori nel midollo osseo e formano una estesa rete di cellule interdigitate lungo tutto l’epitelio bronchiale (Holt et al., 1999).

Da questa localizzazione, esse migrano alle stazioni linfonodali locali sotto il

controllo del fattore di stimolazione di colonie di granulociti macrofagi (GM-

CSF), una citochina rilasciata da cellule epiteliali attivate, fibroblasti, linfociti T,

macrofagi e mastociti. Dopo la cattura dell’antigene, che è favorita dalla presenza

di IgE sulla superficie cellulare, le cellule dendritiche si muovono verso le regioni

(18)

ricche di linfociti. Qui, sotto l’influenza di altre citochine, esse maturano e diventano cellule efficaci nella presentazione antigenica (Banchereau et al., 1998).

Le cellule dendritiche possono anche dirigere la polarizzazione dei linfociti T

“naive” (Th0) verso il sottotipo Th2 che secerne in modo coordinato citochine, che sono codificate da un gruppo di geni che si trovano nella regione cromosomica 5q31-33 (“cluster” del gene dell’IL-4).

1.1.4 Remodeling delle vie aeree

Il processo infiammatorio nell’asma è associato a “rimodellamento” delle vie aeree. Questo termine indica l’insieme delle alterazioni strutturali della parete delle vie aeree che comprendono: l’ispessimento della membrana basale sottoepiteliale, la desquamazione epiteliale, la formazione di nuovi vasi (neoangiogenesi), l’ipertrofia e l’iperplasia del muscolo liscio. La principale caratteristica del rimodellamento è l’ispessimento e l’aumento della densità della lamina reticolare della membrana basale per deposizione di fibre collagene di tipo I, III, tenascina e fibronectina da parte dei miofibroblasti attivati (Vignola et al., 2003).

L’aumento dello spessore della membrana basale sembra essere positivamente correlato all’iperresponsività bronchiale, alla frequenza di attacchi d’asma e al numero di fibroblasti e miofibroblasti adiacenti ad essa (Evans et al., 1999).

L’ispessimento della membrana basale potrebbe essere una conseguenza del

danno epiteliale cui corrisponde una prolungata e continua riparazione che implica

la produzione di eccessive quantità di fattori di crescita che inducono i fibroblasti

(19)

a proliferare e deporre fibre collagene. Anche la matrice interstiziale è coinvolta nel processo di rimodellamento. Nei soggetti asmatici è stata dimostrata la presenza di fibre elastiche anomale, frammentate o assenti, che suggeriscono la presenza di un anomalo processo elastolitico (Vignola et al., 2003). La desquamazione epiteliale, che è caratterizzata dal distacco delle cellule colonnari dalle cellule basali, potrebbe essere dovuta alla distruzione di strutture di adesione intercellulari come desmosomi e giunzioni strette (Montefort et al., 1992) .

La desquamazione epiteliale potrebbe essere causata anche dall’aumento dell’apoptosi delle cellule epiteliali. L'epitelio può essere riparato e sostituito con una mucosa pluristratificata non più ciliata, ma costituita da cellule poligonali coperte da un sottile strato di cellule squamose (metaplasia squamosa). Queste modificazioni possono essere associate ad iperplasia delle cellule caliciformi mucipare e all’ aumento di volume delle ghiandole della mucosa bronchiale (Fahy et al., 2001) .

Questi aspetti sono responsabili dell’ipersecrezione di muco caratteristica

dell’asma bronchiale. Numerosi sono ormai gli studi che hanno evidenziato anche

un aumento della vascolarizzazione nelle vie aeree di soggetti con asma lieve

(Kuwano et al., 1993; Chetta et al., 2003). I meccanismi responsabili

dell’angiogenesi non sono ancora completamente noti. Un’ipotesi possibile è che

l’angiogenesi sia mediata dai mastociti poiché essi producono fattori quali

istamina ed eparina che possono svolgere un ruolo proangiogenetico. È stato

dimostrato che alcuni fattori di crescita tra i quali il VEGF, l’FGF e l’angiogenina

sono correlati all’angiogenesi nell’asma bronchiale (Hoshino et al., 2001) .

(20)

Sebbene il significato funzionale delle alterazioni vascolari nell’asma non sia ancora completamente chiaro, è ipotizzabile che tali alterazioni abbiano un ruolo nell’iperreattività bronchiale. È stato dimostrato che un aumento del numero di vasi può contribuire all’ispessimento della parete delle vie aeree, causando un notevole restringimento del lume bronchiale quando avviene la contrazione del muscolo liscio. Le alterazioni vascolari possono contribuire alla broncostruzione anche in modo indiretto: l’edema associato alla proliferazione dei vasi può contribuire sia al restringimento delle vie aeree che al danno subepiteliale tipico dell’asma (Hogg et al., 1987) . Un’altra caratteristica dell’asma è la proliferazione delle cellule muscolari lisce con conseguente aumento della componente muscolare. È stato dimostrato che la percentuale di parete bronchiale occupata dal muscolo liscio è raddoppiata nei soggetti con asma moderato rispetto ai soggetti di controllo non-asmatici, con un aumento volumetrico percentuale dal 50 all’83%

(Woodruff et al., 2004).

Inoltre nei soggetti con asma grave si osserva una riduzione della distanza tra

muscolatura liscia e membrana basale. Le cellule muscolari lisce presenti

normalmente in profondità nella sottomucosa possono differenziarsi e migrare

(Benayounet al., 2003). Questo può avvenire attraverso numerosi meccanismi

quali ad esempio l’ipertrofia, l’iperplasia, la migrazione dei miociti e la loro

differenziazione in fibromiociti e miofibroblasti. In particolare, in risposta allo

stimolo antigenico, le fibrocellule muscolari lisce migrano nella sottomucosa e

formano uno strato muscolare con fenotipo e funzione anomala (Vignola et al.,

2003) .

(21)

Il ruolo reciproco del processo infiammatorio cronico e del rimodellamento delle vie aeree nella patogenesi delle alterazioni anatomo-strutturali nell’asma resta tuttora da chiarire. Secondo un’ipotesi accreditata, il processo infiammatorio cronico sarebbe responsabile dello sviluppo delle alterazioni strutturali delle vie aeree che caratterizzano l’asma. Tuttavia, alcuni studi hanno suggerito che il rimodellamento strutturale delle vie aeree non sia la conseguenza dell’infiammazione cronica, ma svolga di per sé un ruolo fondamentale nella patogenesi dell’asma bronchiale. Il gruppo di ricerca di Holgate ha, infatti, ipotizzato che un’alterazione dell’interazione tra cellule epiteliali danneggiate e cellule mesenchimali indifferenziate (epithelial mesenchimal trophic unit – EMTU), svolga un ruolo fondamentale nella patogenesi dell’asma. Le numerose citochine proinfiammatorie prodotte dalle cellule epiteliali in risposta al danno tissutale potrebbero, infatti, sia perpetuare il processo infiammatorio, sia innescare un processo di proliferazione e differenziamento delle cellule mesenchimali verso cellule miofibroblastiche che condurrebbe ad un’aumentata deposizione di matrice extracellulare e di tessuto muscolare. L’interazione tra cellule epiteliali e cellule mesenchimali sarebbe quindi fondamentale nella patogenesi dell’asma e potrebbe spiegare sia l’infiammazione cronica che il rimodellamento strutturale associato alla malattia. Questa ipotesi potrebbe chiarire perché l’utilizzo di farmaci antinfiammatori, che consente il controllo dei sintomi della malattia e migliora notevolmente la qualità di vita dei pazienti asmatici, non sia però in grado di

“guarire l’asma” (Holgate et al., 2003; Holgate et al., 2004).

In sintesi, il quadro anatomo-patologico dell’asma nell’adulto è caratterizzato da

un processo infiammatorio eosinofilico associato ad un rimodellamento strutturale

(22)

che comprende ispessimento della membrana basale, desquamazione epiteliale, aumentata vascolarizzazione della parete e alterazioni della muscolatura liscia.

1.2 Meccanismi di proliferazione delle cellule muscolari lisce delle vie respiratorie

Il rimodellamento delle vie aeree nel soggetto asmatico è caratterizzato da una ostruzione correlata a iperplasia (aumento del numero delle cellule) e ipertrofia (aumento delle dimensioni delle cellule) del tessuto muscolare liscio. Il meccanismo molecolare responsabile dell’aumentata proliferazione è ancora da chiarire; tuttavia, numerosi studi hanno identificato diversi mediatori cellulari che intervengono nella promozione della crescita e nella duplicazione cellulare:

 Istamina (Panettieri et al.,1990)

 5-idrossi triptamina (5-HT) (Hershenson et al., 1995)

 Endotelina ET-1 (Noveral et al., 1992)

 Leucotriene D

4

(Cohen et al., 1995)

 -trombina (Panettieri et al., 1995)

 -glucuronidasi (Lew et al., 1991)

 PDGF (fattori di crescita di derivazione piastrinica) (Hirst et al., 1996)

 EGF (fattore di crescita epiteliale) (Tomlinson et al., 1994)

 FGF-2 (fattore di crescita dei fibroblasti) (Bonner et al., 1996)

 IGFs (fattore di crescita insulinico) (Noverale t al., 1994)

 Interleuchina-e interleuchina-6 (De S et al., 1993; 1995)

(23)

 TNF- (fattore di necrosi tumorale ) (Stewart el al., 1995)

 Fibronectina e collagene (Hirst et al., 1997)

I fattori mitogenici delle cellule muscolari bronchiali lisce possono essere divisi in due categorie: recettori attivati da proteine tirosin chinasiche (RTK), quali PDGF, EGF, FGF-2 e IGF; e recettori legati a proteine G, quali -trombina, istamina, serotonina, trombossano, leucotriene D

4

.

La più importante via biochimica di proliferazione cellulare legata ai fattori di crescita sembra essere quella connessa ad ERK, che a sua volta attiva la proteina chinasi attivata da mitogeni, MAPK (Figura 3) (Hershenson et al., 1995).

Figrura 3. Reazioni coinvolte nella trasmissione del

segnale mitogenico dopo attivazione dei recettori TK.

(24)

L’importanza di ERK è dovuta alla sua capacità di far passare la cellula dallo stadio G

0

allo stadio G

i

del ciclo cellulare (Hershenson et al., 1997). La cascata di reazioni inizia con il legame dei fattori di crescita all’omonimo recettore di membrana, che porta alla fosforilazione dei residui tirosinici contenuti nella proteina Grb2. Grb2, scambia Sos con la proteina p21-Ras, la cui attivazione comporta l’attivazione di Raf-1, la successiva fosforilazione di MEK-1, e l’attivazione di entrambe le isoforme di ERK, p44

ERK1

e p42

ERK2

. Queste traslocano nel nucleo e vanno ad attivare ed a favorire la trascrizione di altri elementi della cascata mitogenica quali la proteina attivatrice 1 (AP-1), la proteina del retinoblastoma (pRb) e la ciclina D

1

(Kelleher et al., 1995; Malarkey et al., 1995).

Lo studio condotto dall’equipe di Page (1999), ha messo in evidenza l’importanza

della proteina Ras per il passaggio della cellula alla fase S del ciclo cellulare,

dimostrando la presenza di due distinti meccanismi: ERK-dipendente ed ERK-

indipendente. Panettieri e collaboratori (1995) osservarono che la proliferazione

cellulare non veniva solo promossa da fattori di crescita, ma anche da agonisti di

recettori accoppiati a proteine G (Figura 4).

(25)

Figura 4. Attivazione della cascata mitogenica dopo stimolazione dei recettori accoppiati a proteine G e cross-talk con i recettori TK.

I meccanismi di proliferazione cellulare non correlati ai recettori tirosin chinasici, sembrano essere legati principalmente all’attivazione dei recettori accoppiati alle proteine G

i

che portano all’attivazione di Ras. È stato inoltre evidenziato che anche i recettori accoppiati alle proteine G

q

, mediante l’aumento del flusso intracellulare di ioni Ca

2+

e l’attivazione sequenziale di Raf-1 ed ERK svolgano un ruolo nella proliferazione delle cellule muscolari liscie delle vie respiratorie (Vichi et al., 1999).

Un’altra via di attivazione della proliferazione delle cellule muscolari lisce

bronchiali è legata all’idrolisi della fosfatidilcolina (PC), che porta ad un’aumento

prolungato dei livelli di DAG e quindi ad una prolungata attivazione della

proteina chinasi C (PKC) che, a sua volta, comporta un aumento del segnale

mitogenico (Nishizuka et al., 1995; Panettieri et al., 1997). Sono state identificate

(26)

varie isoforme di PKC, ma le uniche due espresse nelle cellule in stato proliferativo sono la PKC e la PKC. Al contrario, l’isoforma PKC ha dimostrato di ritardare l’ingresso della cellula nella fase G

1

attraverso un meccanismo sulle cicline (Fukumoto et al., 1997), suggerendo che l’azione della PKC non è solo quella di promuovere, ma più in generale di modulare la proliferazione cellulare.

Il meccanismo d’azione antiproliferativa dei farmaci glucorticoidi si basa sul blocco del ciclo cellulare in fase G

1

, mediante un effetto non citotossico non apoptotico, correlato all’inibizione della fosforilazione di pRb (Fernandes et al., 1999). Anche gli agonisti 

2

-adrenergici, hanno dimostrato di esercitare un effetto antiproliferativo sulle cellule muscolari lisce bronchiali (Tomlinson et al., 1994);

il loro meccanismo d’azione sembra correlato ad un aumento dei livelli

intracellulari di cAMP (Tomlinson et al., 1995). Inoltre, lo studio effettuato da

Stewart e collaboratori (1999), ha dimostrato che i farmaci 

2

agonisti, come il

salbutamolo, bloccano il passaggio delle cellule muscolari bronchiali lisce

attraverso le fasi del ciclo cellulare. Nello specifico, inibiscono

l’iperfosforilazione di pRb e l’espressione della ciclina D

1

. La variazione

dell’espressione della ciclina D

1

ad opera del salbutamolo, non avviene a livello

del mRNA, ma si pensa avvenga a livello post-traslazionale e forse attraverso un

aumento nella degradazione della ciclina stessa (Stewart et al., 1999). Altro

meccanismo antiproliferativo imputabile al salbutamolo è quello di prevenire

l’attivazione di ERK, che normalmente è attivata dalla -trombina; la mancanza o

il ritardo nell’attivazione di ERK attraverso al proteina G

i

, porta al blocco del

ciclo cellulare (Kelleher at al., 1995; Malarkey et al., 1995).

(27)

1.3 Recettore 

adrenergico

1.3.1 Struttura recettoriale

Il gene umano che codifica per il recettore 

-adrenergico (

2

-AR) è situato sul braccio lungo del cromosoma 5 ed è costituito da 1.200 paia basi (Kobilka et al., 1987). Il recettore è una proteina di 46,5 Kda costituita da 413 residui amminoacidici (Kobilka et al., 1987), distribuiti in 7 domini transmembranari tra i quali se ne riconoscono 3 extracitoplasmatici, con la porzione ammino-terminale, e 3 intracitoplasmatici, con la porzione carbossi-terminale. Il recettore viene attivato mediante N-glicosilazione sugli amminoacidi 6, 15 e 187; un processo importante non solo per l’inserimento all’interno della membrana cellulare, ma anche per il legame del recettore con l’agonista (Johnson, 2006). La presenza dell’amminoacido cisteina in posizione 341 è fondamentale per l’ancoraggio della catena carbossi-terminale con la membrana citoplasmatica (O’Dowd et al., 1989).

1.3.2 Attivazione del recettore e trasduzione del segnale

L’attivazione del recettore 

-AR comporta l’incremento intracellulare dei livelli

di cAMP (Robison et al., 1967). Questo è il risultato della stimolazione

dell’adenilato ciclasi, che catalizza la conversione dell’adenosin trifosfato (ATP)

in cAMP. L’attivazione della proteina trimerica G

s

si ottiene tramite il legame tra

recettore 



e adenilato ciclasi (Figura 5).

(28)

Figura 5. Attivazione recettore

2

-AR.

La proteina G è costituita da una subunità (che stimola l’adenilato ciclasi) e le subunità (che trasducono il segnale). I livelli di cAMP, sono regolati dalle fosfodiesterasi, che degradano il cAMP in 5’-AMP.

Il meccanismo tramite il quale cAMP determina il rilassamento della muscolatura liscia respiratoria non è del tutto chiaro, ma sembra ciò si realizzi mediante l’attivazione della proteina chinasi A (PKA), che a sua volta fosforila proteine- chiave coinvolte nel processo di contrazione muscolare (Johnson et al., 1995).

Il cAMP inoltre, risulta essere un inibitore del rilascio del calcio (Ca

2+

) dai

depositi intracellulari, inibendone anche l’ingresso nella cellula e portando ad un

(29)

rilassamento della muscolatura liscia. Comunque è stato visto recentemente che alcune risposte indotte dai 



agonisti sono mediate da meccanismi cAMP- indipendenti, che coinvolgono direttamente la proteina G

s

e i canali al potassio (K

+

) presenti nelle cellule muscolari lisce dell’albero respiratorio (O’Dowb et al., 1989).

I recettori 

possono essere accoppiati anche a proteine G

i

(Daaka et al., 1997). Il risultato di questa associazione è la stimolazione di un segnale intracellulare che porta all’attivazione della p38MAPK, una proteina chinasi coinvolta nella trasmissione del segnale mitogenico. Per l’attivazione di questa via è necessaria la fosforilazione PKA-mediata del recettore 

 l’assemblaggio di proteine intracellulari come Raf, Csrc, RAS con la subunità  della proteina G, e l’attivazione di MAPK (Daaka et al., 1997).

Da studi recenti è emerso, inoltre, che l’attivazione di questa via porta alla fosforilazione, da parte della MAPK, del recettore glucocorticoide (GR) rendendolo più sensibile all’azione degli steroidi (Johnson, 2002). L’attivazione del recettore 

-ARporta anche alla traslocazione del recettore GR dal citoplasma al nucleo, uno dei passaggi fondamentali nel meccanismo d’azione di questi farmaci Roth et al., 2002).

1.3.4 Interazione del recettore 

-AR con i farmaci agonisti

I residui amminoacidici del recettore β

2

-AR che prendono parte al legame con

l’agonista sono: l’aspartato 113, localizzato nel terzo dominio, i residui di serina

(30)

nelle posizioni 2, 204 e 207 nel quinto dominio e l’asparagina 293 nel sesto dominio extracellulare (Liggett, 2002).

Il legame tra recettore e agonista avviene tramite alcuni residui amminoacidici del recettore e gruppi funzionali presenti nel ligando. I due gruppi serinici interagiscono con il gruppo idrossilico presente sull’anello fenilico dell’agonista

adrenergico, mentre il gruppo  idrossilico, presente nel 

agonista, lega l’asparagina 293 (Liggett, 2002). La struttura molecolare dei 

agonisti, determina il modo in cui viene attivato il recettore adrenergico 



Ad esempio,

gli short-acting come il salbutamolo, che presenta una natura idrofilica, accedono al

sito d’azione recettoriale tramite il compartimento acquoso extracellulare (Johnson, 2000). Questi farmaci si legano rapidamente al sito d’azione e la durata dell’effetto terapeutico è di circa 4-6 ore.

I 



agonisti long acting, come il formeterolo, hanno un differente meccanismo d’azione: essendo più lipofili, formano un deposito all’interno della membrana cellulare, da dove progressivamente il farmaco viene solubilizzato nel fluido extracellulare e può così interagire con il recettore.

1.3.5 Desensibilizzazione recettoriale

Associato con l’attivazione del recettore 

-adrenergico vi è il processo

autoregolatorio di desensibilizzazione recettoriale. Questo processo avviene

fisiologicamente per preservare il recettore da una sovrastimolazione indotta da

agonisti endogeni ed esogeni. La desensibilizzazione avviene in seguito al legame

(31)

tra recettore e agonista ed i meccanismi attraverso i quali può avvenire sono di 3 tipi (Figura 6): (1) disaccoppiamento tra recettore e adenilato ciclasi, (2) internalizzazione del recettore non accoppiato e (3) down-regulation.

Figura 6. Desensibilizzazione del recettore

2

-AR.

1. Il legame tra recettore e agonista innesca quasi immediatamente la fosforilazione di specifici residui amminoacidici di serina e treonina nel terzo loop intracitoplasmatico e nella terminazione carbossi-terminale del recettore. Il 

2

-AR è fosforilato dalla PKA o da chinasi specifiche delle proteine G (GRK) (Bouvier at al., 1988, 1989; Hausdorff et al., 1989).

Il legame dell’agonista con il recettore porta ad una immediata

traslocazione del GRKs dal citoplasma alla membrana e alla successiva

(32)

fosforilazione del recettore. Una volta ultimata la fosforilazione, la - arrestina si lega la recettore, non permettendo più l’accoppiamento del recettore con la proteina G

s

, limitando così la funzionalità recettoriale stessa. L’azione della -arrestina si esplica anche mediante il legame con altre proteine, come la fosfodiesterasi IV (Johnson, 2006).

L’attivazione di altri reccetori, che utilizzano cAMP come secondo messaggero, possono indurre desensibilizzazione eterologa del recettore

2

-AR, a causa della formazione di cAMP e della successiva attivazione di PKA. La desensibilizzazione omologa, invece, è la risultante dell’attivazione combinata di PKA e GRK.

2. L’arrestina, non svolge solo un importante ruolo nel disaccoppiamento

recettoriale, ma è anche un mediatore cruciale coinvolto

nell’internalizzazione del recettore, infatti vi è una forte connessione tra la

fosforilazione del recettore 

2

-AR e il legame della -arrestina con il

processo di endocitosi di 

2

-AR. Una delle funzioni della -arrestina è

quella di collegare il recettore 

2

-AR con il sistema di endocitosi,

costituito da clatritina e 

2

-adattatore (la subunità-della proteina

adattatore AP2) (Goodman et al., 1997; Laporte et al., 1999, 2000). In

seguito all’internalizzazione, il recettore 

2

-AR può andare incontro a

defosforilazione da parte degli enzimi endosomiali ed essere riciclatato

sulla membrana cellulare, oppure può essere degradato dai lisosomi

(Campbell et al., 1991; Barak et al., 1994). L’internalizzazione e la

(33)

degrazione lisosomiale del recettore 

2

-AR comportano la necessità della neosintesi del recettore, affinché venga nuovamente espresso.

3. La down-regulation del recettore 

2

-AR è un processo che porta alla desensibilizzazione, come risultato di eventi trascrizionali. Lo studio condotto da Hadcock e Malbon (1988) ha dimostrato che in seguito all’esposizione all’agonista forskolina, alla concentrazione M per 18 ore, si ha una riduzione del 50% dei livelli di espressione del recettore.

Oltre alla capacità dei -agonisti di indurre desensibilizzazione omologa, altri stimoli sono capaci di ridurre la risposta -adrenergica, un processo definito desensibilizzazione eterologa.

Ad esempio, gli agonisti muscarinici hanno al capacità di attivare la subunità inibitrice G

i

delle proteine G portando ad un’inibizione dell’adenilato ciclasi e attenuando la risposta del -agonista attraverso l’attivazione di PKC (Grandorby et al., 1994). Inoltre, uno studio recentemente pubblicato da Ahiua e collaboratori (2008), ha dimostrato che la desensibilizzazione eterologa dei recettori 

2

-AR, risultante da una esposizione prolungata alla PGE

2

o alla forskolina, è mediata da un aumento dell’ attività della PDE4.

Numerose citochine, quali IL-1, TNF, IL-5 e TGF riducono la capacità delle cellule muscolari bronchiali lisce di generare cAMP. Le citochine, non alterano l’espressione della PKA e non hanno effetto sulla risposta cellulare alla forskolina, un agente che attiva direttamente l’adenilato ciclasi (Shore et al., 1997;

Laporte et al., 1998; Pang et al., 1998; Pascual et al., 2001). Questi risultati

(34)

suggeriscono che il meccanismo di desensibilizzazione, in questo caso, si realizzi a livello dell’accoppiamento tra recettore -adrenergico e proteina G

s

(Shore et al., 1997). Inoltre, l’effetto dell’ IL-1 è dipendenete dall’attivazione di ERK e p38 MAPK (Laporte et al., 1999; Gerthoffer et al., 2003).

Uno degli aspetti fisiopatologici più rilevanti che caratterizzano il paziente asmatico è l’espressione, nei bronchi, delle citochine derivanti dai linfociti Th2, IL-4 e IL-13, le quali esplicano la loro azione attraverso il recettore di tipo II per l’

IL-4, un dimero costituito dalle subunità IL-4R e IL-13R1 (Laporte et al., 2001; Hirst et al., 2002). Il legame di IL-13 o IL-4 al recettore, provoca l’attivazione della chinasi Jak e la fosforilazione dei residui tirosinici presenti sulle due subunità recettoriali. La fosforilazione della tirosina nella regione 14R di IL-4R, porta al reclutamento di IRS-1/2 e alla sua attivazione da parte della chinasi Jak. La fosforilazione di IRS-1/2 conduce all’associazione tra la proteina adattatrice Grb2 e Sos e all’attivazione di Ras che, in ultima analisi, porta all’attivazione della proteina ERK. La proteina ERK contribuisce alla desensibilizzazione del recettore 

2

-AR attraverso il disaccoppiamento tra 

2

-AR e G

s

(Laporte et al., 2001).

1.4 Glucocorticoidi

L’azione dei glucocorticodi è mediata dal recettore intracellulare GR, che

appartiene alla famiglia dei recettori nucleari. Il gene umano che codifica per il

(35)

recettore (hGR) è localizzato sul cromosoma 5 ed è costituito da 9 esoni. In base al differente splicing si possono ottenere 3 diversi tipi di mRNA: quelli relativi ai recettori hGR e hGR, che differiscono per l’esone 9 (9 e 9) e l’mRNA contenente l’esone 9, il 9 ed una “J region”. Si ritiene che questo mRNA possa essere tradotto sia in hGR che hGR (Oakley et al., 1996). Delle due isoforme, solo hGRα ha la capacità di legare i corticosteroidi, mentre hGRβ interagisce con il DNA inibendo il legame tra hGRα e DNA (Lewis-Tuffin et al., 2006).

Il meccanismo d’azione del recettore hGR si può articolare in diversi punti:

• Legame con il ligando e dissociazione dalle proteine dello shock termico (in particolare hsp90).

• Fosforilazione e traslocazione nel nucleo.

• Omodimerizzazione e legame con il DNA (GR può legare specifiche sequenze del DNA chiamate GREs, ossia Glucocorticoid Response Elements).

• Transattivazione, ossia attivazione della trascrizione genica mediante il legame con positive GRE.

• Inibizione dell’espressione di alcuni geni mediante legami con negative GRE o attraverso meccanismi non mediati dal legame al DNA.

Studi recenti hanno evidenziato che nei pazienti con asma potenzialmente letale è

stata riscontrata una maggiore espressione dell’isoforma hGR nelle cellule

infiammatorie delle vie aeree rispetto a soggetti sani (Christodoulopoulos et al.,

2000). Inoltre è stato evidenziato che la sovraespressione della forma hGR, la

down-regulation omologa e la trans-repressione di GR mediata da NF-kB, sono

(36)

meccanismi responsabili della resistenza ai glucocorticoidi e della diminuzione della loro efficacia clinica (Schaaf et al., 2002).

I principali effetti antinfiammatori/immunosoppressivi dei glucocorticoidi sono i seguenti:

Inibizione della via dell’NF-kB (inibizione della sintesi di proteine proinfiammatorie e immunostimolanti).

Sintesi di proteine antinfiammatorie ed immunosoppressive (IkB).

Azione stabilizzante sulla membrana cellulare e lisosomiale.

Depressione della reazione antigene-anticorpo.

Inibizione della permeabilità e della dilatazione capillare.

Attivazione adrenergica per stimolazione della feniletanolamina-N- metiltransferasi.

Sensibilizzazione dei β-recettori alle catecolamine.

Inibizione della biosintesi di mucopolisaccaridi.

Azione anti-ialuronidasica diretta.

1.4.1 Interazione tra glucorticoidi e 

-agonisti

L’associazione tra glucocorticoidi e farmaci 

-agonisti è largamente impiegata

nel trattamento dell’asma (Greening et al., 1994; Shrewburg et al., 2000). I

glucorticoidi inibiscono la proliferazione delle cellule muscolari liscie bronchiali

attraverso la down-regulation dell’espressione della ciclina-D1 e la fosforilazione

della proteina del retinoblastoma (Fernandes et al., 1999), mentre i 

2

-agonisti

(37)

inibiscono la proliferazione cellulare mediante un aumento dei livelli intracellulari di cAMP (Stewart et al., 1997).

Lo studio condotto da Roth et al. (2002) ha messo in evidenza il sinergismo d’azione della combinazione tra glucorticoidi e 

2

-agonisti (Figura 7), che si realizza mediante l’attivazione sia del recettore glucorticoide, sia di C/EBP-

(CCAAT-enhancer binding protein). Infatti la stimolazione contemporanea del recettore glucorticoide e di C/EBP- produce un’azione antiproliferativa più rapida ed efficace, attraverso un aumento dell’espressione di p21

(Waf1/Cip1)

, una proteina inibitoria che controlla il ciclo cellulare (Rüdiger et al., 2002; Cram et al., 2008).

Figura 7. Meccanismo di interazione tra

2

-agonisti e glucocorticoidi.

(38)

Il recettore glucorticoide non interagisce solamente con C/EBP-ma svolge la sua azione anche modulando fattori di trascrizione quali la proteina AP-1, la cAMP responsive element binding protein (CREMBP) ed i fattori nucleari NFB/

IKB (Jonat et al., 1990; Strahle et al., 1988).

Dallo studio condotto da Roth et al. (2002) è stato messo in ulteriore evidenza che la combinazione tra formeterolo e budesonide inibisce l’espressione di molecole di adesione quali ICAM-1, VCAM-1 e del fattore di crescita GM-CSF.

I risultati ottenuti dallo studio evidenziano che la combinazione glucorticoidi-

- agonisti sincronizza l’attivazione del recettore glucocorticoide e C/EBP-. Questa azione permette un’attivazione più rapida e prolungata di p21

(Waf1/Cip1)

rispetto all’utilizzo dei farmaci singoli. Inoltre, nell’associazione sono utilizzate concentrazioni di farmaco che risulterebbero inattive se somministrate da sole.

1.5 Recettori attivati dai proliferatori perossisomiali (PPAR)

I PPAR sono fattori di trascrizione attivati da ligandi, appartenenti alla

superfamiglia dei recettori nucleari. Questi recettori sono stati identificati nel

1990 negli epatociti dei roditori e il nome deriva dalla loro capacità di indurre la

proliferazione del perossisoma (Kota et al., 2004). Oltre al ruolo nella regolazione

del metabolismo glucidico e lipidico, recentemente è stato evidenziato il loro

coinvolgimento anche nella regolazione di altri processi patologici importanti

quali, ad esempio, l’infiammazione (Belvisi et., al 2006). Sono note tre isoforme

derivanti da tre geni diversi: PPAR-, PPAR- e PPAR- codificate

(39)

rispettivamente dai geni NR1C1, NR1C2 e NR1C3. Tutte le isoforme presentano caratteristiche simili sia dal punto di vista strutturale che funzionale (Kota et al., 2004), ma si distinguono principalmente per diversa distribuzione tissutale. Infatti, il PPAR- è maggiormente espresso nei tessuti ad alto catabolismo di acidi grassi quali fegato, cuore, rene e muscolo; PPAR- invece, è espresso nel tessuto adiposo mentre PPAR-è espresso in diversi tessuti ed il suo ruolo specifico non è stato ancora chiarito (Trifilieff et al., 2003).

Questi recettori, una volta attivati, possono legarsi ad una sequenza specifica nella regione promoter di geni-bersaglio regolandone la trascrizione oppure, possono interagire direttamente con fattori di trascrizione inibendoli (Belvisi et al., 2006).

1.5.1 Caratteristiche strutturali e meccanismi biologici dei PPAR

Il recettore PPAR presenta quattro domini funzionali chiamati A/B, C, D, e E/F (Fig. 8).

Fig. 8. Rappresentazione schematica dei domini funzionali dei PPAR.

Il dominio A/B si trova nella regione N-terminale e presenta una regione AF-1che

è responsabile dell’attivazione del recettore, indipendentemente dalla presenza del

ligando. Il dominio C è il dominio di legame al DNA; il D serve per il legame del

(40)

recettore con eventuali cofattori ed il dominio E/F è, infine, responsabile dell’attivazione del recettore da parte del ligando e contiene la regione AF-2 che serve per reclutare cofattori per promuovere la trascrizione genica.

In particolare, nel dominio C di legame al DNA, è presente una sequenza nucleotidica definita peroxisome proliferation response elements (PPRE), localizzata all’interno della regione promoter dei geni bersaglio. I PPRE presentano la ripetizione di un elemento (DR)-1 costituito da una sequenza di due esanucleotidi (AGGTCA) separati da un singolo nucleotide spaziatore. Prima di legarsi a questa PPRE, il recettore PPAR si associa all’RXR (recettore retinoico X), membro della superfamiglia dei recettori ormonali nucleari attivati dal legame con l’acido 9-cis-retinoico, per formare un eterodimero che può attivare o reprimere la trascrizione genica a seconda della sua interazione con diversi coattivatori o corepressori (Kota et al., 2004; Sher et al., 2005).

Come per i PPAR, ci sono 3 diverse isoforme di RXR, chiamate RXR, RXR, RXR, che sono tutte attivate dal ligando endogeno, l’acido 9-cis retinoico (Moraes et al., 2006).

L’isoforma  è quella meglio conosciuta e si è visto che l’eterodimero PPAR-

/RXR inattivo è localizzato nel citoplasma ed è fortemente legato a dei

corepressori che gli impediscono il legame al DNA. In seguito al legame con il

ligando, l’eterodimero si attiva ed il corepressore si stacca; in questo modo il

complesso PPAR/RXR è libero di entrare nel nucleo e di interagire a livello del

PPRE nella regione promoter del gene bersaglio, provocando l’attivazione o la

repressione del gene (Belvisi et al., 2006; Sher et al., 2005). L’interazione

(41)

trascrizionale dell'eterodimero con l’elemento risposta nella regione del promotore richiede il reclutamento di proteine co-attivatrici (Fig.9).

Fig. 9. Meccanismo di trascrizione genica del PPAR.

E’ stato riscontrato che PPAR- può esercitare la sua funzione di regolatore della

trascrizione genica senza interagire direttamente con il DNA; infatti,

l’eterodimero PPAR-/RXR si lega ai fattori di trascrizione impedendogli di

indurre la trascrizione di geni bersaglio. Questo meccanismo è stato dimostrato

per le proteine appartenenti alla famiglia NF-B e per diversi membri della

famiglia delle MAPK (Belvisi et al., 2006).

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1.5.2 PPAR-

PPAR-  è maggiormente espresso nel tessuto adiposo. Una volta attivato, questo recettore svolge un ruolo in molti processi biologici quali il differenziamento degli adipociti, il metabolismo lipidico e l’omeostasi glucidica (Kota et al., 2004).

Negli ultimi anni gli è stata inoltre attribuita un’ampia partecipazione in molti aspetti dell’infiammazione (Belvisi et al., 2006).

La formazione di adipociti è un processo di differenziamento di cellule precursori dette pre-adipociti che diventano capaci di accumulare gocciole lipidiche al quale contribuiscono i PPAR-. L’attivazione dei PPAR-inoltre, induce apoptosi negli adipociti maturi promuovendo indirettamente la stimolazione del differenziamento di altri pre-adipociti (Kota et al., 2004).

La resistenza insulinica è un fenomeno complesso che non dipende solo dal

diabete; infatti la sensibilità all’insulina la si può perdere anche con la gravidanza

e l’obesità (Robbins et al., 1997). In vari studi si è visto che i PPAR- riducono la

resistenza all’insulina, agendo sul TNF-, uno dei fattori responsabili

dell’insulino-resistenza negli adipociti. Gli agonisti PPAR stimolano l’espressione

della proteina trasportatrice del glucosio (GLUT4) necessaria per la sua

captazione negli adipociti. (Kota et al., 2004).

(43)

1.5.2.1 Ruolo dei PPAR- nell’infiammazione

L’infiammazione è un processo importante in molte malattie respiratorie e prevede il rilascio di citochine e di radicali liberi dell’ossigeno da parte di cellule infiammatorie attivate quali neutrofili, eosinofili, monociti e macrofagi. L’attività dei PPAR- agonisti si realizza inibendo l’espressione di molti geni pro- infiammatori, e con la liberazione di citochine e di agenti chemiotattici. (Belvisi et al., 2006).

I PPAR sono attivati da ligandi endogeni, in particolare acidi grassi e derivati delle prostaglandine quali la 15-deoxy-12-14PGJ2 (15d-PGJ2) (Kota et al., 2004), e da ligandi esogeni appartenenti alla famiglia dei tiazolidindioni quali, ad esempio, il rosiglitazone (Tesse et al., 2008).

Il sottotipo  è quello maggiormente coinvolto nel processo infiammatorio; esso è espresso infatti in cellule del sistema immunitario quali monociti/macrofagi, cellule B e T e cellule dendritiche (Belvisi et al., 2006). E’ stato dimostrato che, agonisti dei PPAR- inibiscono il rilascio di mediatori pro-infiammatori da parte dei monociti (Jiang et al., 1998) e da cellule dell’epitelio sia alveolare che bronchiale (Wang et al., 2001). Inoltre essi inibiscono la proliferazione delle cellule muscolari lisce vascolari e inducono apoptosi nelle cellule endoteliali e nei macrofagi (Belvisi et al., 2006).

Sono stati effettuati numerosi studi su cellule epiteliali respiratorie che sostengono

il ruolo anti-infiammatorio dei PPAR- Ad esempio, uno studio effettuato su

cellule A549 dimostra che l’attivazione di questi recettori da parte di agonisti

quali 15dPGJ2 e ciglitazone porta ad una diminuzione dose-dipendente

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dell’espressione di citochine indotta da IL-4 (Wang et al., 2001), suggerendo un potenziale impiego nel trattamento di malattie respiratorie quali l’asma, la malattia polmonare cronica ostruttiva, la sindrome da distress respiratorio e la fibrosi polmonare (Belvisi et al 2006).

Gli agonisti PPAR- hanno anche dimostrato di possedere anche effetti anti- aterosclerotici in diversi modelli animali (Kota et al., 2004). L’aterosclerosi è una patologia caratterizzata da un ispessimento della tonaca intima delle arterie dovuta all’accumulo di cellule schiumose (Singh et al., 2005) . L’attivazione dei PPAR-

ostacola la formazione di cellule schiumose regolando l’espressione di geni sia dei trasportatori che mediano il flusso di colesterolo sia di quelli che codificano per i recettori scavenger CD36 dei macrofagi (Tesse et al., 20084).

I tiazolidindioni inibiscono l’espressione delle molecole di adesione delle cellule vascolari (VCAM-1) e delle molecole di adesione intercellulare (ICAM-1) provocando la riduzione dell’accumulo di monociti nelle tonaca intima delle arterie (Kota et al., 2004). L’attivazione dei PPAR- blocca la sovrapproduzione di NO, l’espressione di IL-6 e TNF-(tumor necrosis factor) e l’induzione di COX- 2 e iNOS attraverso la repressione dell’attivazione sia di F che di AP1 (activator protein-1). Questi dati suggeriscono un ruolo protettivo degli agonisti PPAR- nelle malattie cardiovascolari per le loro proprietà anti-infiammatorie (Tesse et al 2008) .

I PPAR-  sono espressi anche nei macrofagi alveolari umani dove inibiscono la

produzione di citochine, aumentano l’espressione del CD36 e migliorano la

fagocitosi di neutrofili apoptotici da parte di queste cellule, tutti eventi necessari

(45)

alla risoluzione dell’infiammazione (Belvisi et al., 2006). L’attività anti- infiammatoria degli agonisti PPAR è da attribuire ad una inibizione del fattore nucleare di trascrizione F e alla capacità dei recettori attivati di agire direttamente a livello del DNA. Recentemente sono stati dimostrati anche effetti non genomici dei recettori PPAR legati, ad esempio, all’inibizione delle modificazioni del calcio intracellulare indotte da fMLP in cellule mononucleate umane (Singh et al., 2005). Nel loro insieme i dati della letteratura scientifica indicano che gli agonisti PPAR rappresentano bersagli interessanti per l’identificazione di nuove strategie terapeutiche nelle malattie infiammatorie croniche (Belvisi et al., 2006).

1.6 Rho chinasi

La chinasi Rho è l’effettore molecolare di RhoA, una proteina monomerica legata

al GTP, appartenente alla famiglia delle proteine Ras. La chinasi Rho è coinvolta

in numerosi processi alla base della fisiopatologia asmatica quali la contrazione

muscolare bronchiale, il reclutamento degli eosinofili, i processi di

rimodellamento bronchiale, l’iperattività bronchiale e la desensibilizzazione del

recettore -adrenergico (Hiroaki, 2008).

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1.6.1 Struttura e attivazione di Rho chinasi

Esistono diverse isoforme di Rho, A-E e G, anche se, le maggiori funzioni sono svolte dalla RhoA. Essendo una proteina G, ha la capacità di legare GDP e GTP ed è dotata di attività GTPasica. Quest’ultima proprietà permette, attraverso l’idrolisi del GTP, il passaggio dal complesso GTP-RhoA, che rappresenta lo stato attivo, a GDP-RhoA che invece è lo stato inattivo della molecola (Somlyo et al., 2000).

La struttura dell’enzima Rho chinasi è costituita da una porzione N-terminale, denominata kinase domain, una porzione centrale denominata coiled coil domain, dove si trova il dominio di legame con il RhoA-GTP e l’estremità C-terminale che è costituita dal pleckstrin (PH) domain, ricco di cisteine (Kimura et al., 1996).

1.6.2 Meccanismo di contrazione delle cellule muscolari respiratorie

Come nelle cellule muscolari striate, l’evento cruciale della contrazione nelle

cellule muscolari lisce delle vie respiratorie è dato dalla fosforilazione delle catena

leggera di 20 kda della miosina (MLC), ad opera di una specifica chinasi

Ca

2+

/calmodulina-dipendente, denominata myosin light chain kinase (MLCK). Il

processo di contrazione ha inizio con il legame del Ca

2+

intracellulare alla

calmodulina, il complesso formatosi porta all’attivazione della chinasi specifica

per le catene leggere della miosina (MLCK), che portano alla fosforilazione delle

MLC (Gerthoffer et al., 1991).

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