Progettazione e modellazione dell’interfaccia neurale a rilascio di farmaco

Progettazione e modellazione

dell’interfaccia neurale a rilascio di

farmaco

Tutte le prove effettuate preliminarmente e descritte nei capitoli precedenti sono state finalizzate alla progettazione e realizzazione di un’interfaccia neurale a rilascio di farmaco.

È stato necessario, definire prima l’efficacia di rilascio della proteina dal film di polimero, valutare le corrette concentrazioni dei materiali da impiegare e testare infine l’efficacia delle prove di deposizione del pirrolo e dell’ossido di silicio.

Solo in ultima istanza è stato possibile valutare l’efficacia del sistema realizzato e testarlo direttamente con una linea cellulare, valutando la capacità di crescita delle cellule sulla matrice realizzata e soprattutto il rilascio delle proteine all’interno di esse, senza perdita delle loro attività e funzionalità biologica.

Nei successivi paragrafi, saranno riportati i vari step che hanno permesso la realizzazione del sistema.

5.1 Descrizione dell’interfaccia

L’obiettivo primo, di questo lavoro di tesi è la realizzazione di un sistema a rilascio impiegando un array di CNT.

La scelta dei nanotubi di carbonio come interfaccia ed eventualmente come elettrodo neurale impiantabile è dovuta essenzialmente alle loro piccole dimensioni che risultano essere dell’ordine dei nanometri e quindi compatibili con le dimensioni cellulari. La scelta è ricaduta sui nanotubi soprattutto per le buone

caratteristiche di biocompatibilità, meccaniche ed elettriche che li rendono negli ultimi anni i favoriti nell’ambito della ricerca.

Come visto precedentemente, l’array di CNT ha dimensioni , ed è posto al centro di un frammento di silicio, di forma quadrata di dimensioni . Al fine della realizzazione dell’interfaccia completa sono stati eseguiti quattro step: cm cm 1 1 × cm cm 3 3 ×

− Deposizione del polipirrolo o ossido di silicio − Deposizione del film di alginato e proteina − Deposizione del coating cellulare

− Semina delle cellule

5.1.1 Deposizione del polipirrolo e dell’ossido di silicio sull’array di

CNT

La deposizione del polipirrolo o dell’ossido di silicio è finalizzata a cercare di far mantenere ai CNT l’allineamento verticale, dopo che essi sono stati immersi in soluzione. Essi infatti, quando tolti fuori da una soluzione tendono ad aggregare le punte, formando microbundles [33], a causa delle forze elettrostatiche. In Fig 5.1 e 5.2 sono riportate immagini dei CNT prima e dopo l’immersione in una soluzione.

Fig5.2 Immagini al FIB dei CNT dopo essere immersi in una

soluzione acquosa

Per evitare che i CNT si aggreghino, in prima istanza è stato deposto il polipirrolo (PPy). L’idea è che, un sottile strato di polimero impedisca l’inclinazione dei nanotubi aumentando la forza meccanica e permettendo di mantenere, almeno teoricamente, l’allineamento verticale degli stessi.

Prima di essere sottoposti al trattamento con il polipirrolo, i CNT sono stati lavati con (acido nitrico) 1 M, al fine di eliminare qualsiasi tipo di eventuale residuo; sono stati lasciati nella soluzione per circa 30 min e successivamente risciacquati.

3

HNO

Per la deposizione di un film sottile di PPy si è partiti dal protocollo fornito in letteratura (1,05V, 90-120 sec, 1MKCl). Tale processo tuttavia non ha prodotto alcun passaggio di corrente nel circuito di elettrolisi. Ciò è dovuto probabilmente alla diversa impedenza (maggiore) dei CNT usati in questo lavoro di tesi rispetto a quella del lavoro mensionato.

La tensione da applicare è risultata 2 V. Collegando un multimetro alla cella elettrochimica, descritta nel capitolo precedente, è stata rilevata una corrente con picco massimo a 26, 9 mA, picco minimo a 15,3 mA per poi assestarsi ad un valore di corrente medio di 17,9 mA. L’osservazione al microscopio FIB ha rilevato uno spessore di pochi manometri (5-20 nm)

Ovviamente il pirrolo garantisce una separazione delle punte dei CNT solo parziale, ma sufficiente ai fini dell’interazione cellulare. La deposizione di

spessori superiori aumenterebbe la separazione, ma diminuirebbe il grado di vuoto, volume questo da riempire con il polimero per il rilascio [48].

Fig5.3 Immagini al FIB dei CNT dopo la deposizione con PPy

per 120 sec

In alternativa alla deposizione del polipirrolo, è stata eseguita la deposizione tramite sputtering di (ossido di silicio), già suggerita da altri autori [49]. Il campione è stato sottoposto a deposizione per circa 50 min con uno “sputtering rate” di 1 nm/s, l’osservazione al FIB in Fig 5.4 e 5.5 rivela che il film di non è uniforme, massimo sulla tip (

2

SiO

2

SiO ≈50nm) e minimo sulle pareti

Fig5.4 Immagini al FIB dei CNT dopo essere sottoposti a sputtering con SiO₂per 50 min

Fig5.5 Immagini al FIB dei CNT dopo essere stati sottoposti a sputtering con SiO₂per 50 min

Ovviamente la deposizione dell’ossido di silicio non è ottimale ai fini dell’impiego dell’interfaccia come elettrodi neurali, ma è risultata un’utile alternativa all’uso del PPy per la validazione in vitro del sistema a rilascio di farmaco discussa nel capitolo successivo.

Fig5.6 Immagini al FIB dei CNT dopo essere stati

immersi in una soluzione acquosa

Fig5.7 Immagini al FIB dei CNT dopo aver deposto uno strato di PPy, per 120 sec con

una soluzione 1M di KCl (sinistra), e CNT dopo aver deposto SiO₂per 50 min (destra).

Le immagini riportate sopra, Fig.5.6 e Fig. 5.7 riportano i CNT rispettivamente dopo l’immersione in soluzione acquosa, dopo la deposizione di PPy e dopo la deposizione di ossido di silicio e sottolineano l’esigenza del coating per cercare di ridimensionare l’effetto steaking dei CNT quando immersi in soluzione.

Appare evidente la differenza tra le immagini dei CNT in cui è deposto un sottile strato di film (Fig.5.7) e quella in cui invece non è deposto nulla (Fig.5.6) Qui i nanotubi tendono ad aggregarsi in microbundles. In realtà a causa dei bassi spessori di coating utilizzatii CNT dopo l’immersione tendono ad unirsi

comunque ma in modo meno accentuato Inoltre il rivestimento con sembrerebbe risultare più efficace rispetto a quello di PPy.

2

SiO

5.1.2 Deposizione dell’alginato sull’array di CNT

L’array di CNT, ha dimensioni 1cm 1× cm. Per far si che il film di alginato si disponga uniformemente sulla superficie dei nanotubi, l’area di interesse viene circondata con una well di forma cilindrica di 1 cm di diametro e di altezza. Questa viene fatta aderire al substrato di silicio, ovviamente stando bene attenti a non rovinare i delicati nanotubi. In Fig. 5.8 è riportata l’immagine dell’array di CNT, con deposta lo soluzione di alginato, lo spessore ottenuto è circa 5 mμ .

o

Fig5.8 Immagini al FIB dei CNT dopo la deposizione del film di alginato; (sinistra vista

dall’alto, destra vista laterale)

Dalle immagini sopra, è evidente come il film di alginato rispetti le caratteristiche imposte dalla modellazione matematica fatta precedentemente e riportata nel capitolo 4. Il film infatti risulta essere sottile lasciando, proprio come imposto, le punte dei CNT scoperte in modo tale che le cellule possano alloggiarsi su di esse.

Il lavoro fin’ora svolto dimostra come sia possibile modificare l’array di CNT per realizzare interfacce neurali a rilascio prolungato di farmaco (dell’ordine dei giorni).

Lo step, che a questo punto è necessario effettuare, è la modellazione e dunque la previsione del rilascio all’interfaccia.

5.2 Modellazione dell’interfaccia con FEMLab

Prima di effettuare le prove in vitro e quindi di testare direttamente sulle cellule l’efficacia del sistema a rilascio di farmaco, è stato creato un modello FEMLab dell’interfaccia, tenendo conto della geometria tridimensionale del sistema. Il programma utilizzato è un software di simulazione e modellazione matematica. Esso si basa sulla risoluzione, tramite il metodo degli elementi finiti, delle equazioni differenziali parziali (PDE) che esprimono i fenomeni fisici e chimici coinvolti nel sistema (in questo caso relativi alla diffusione della proteina nel mezzo di rilascio), consentendo di ottenere simulazioni sufficientemente complete e accurate del fenomeno in considerazione.

Al fine di ridurre la pesantezza computazionale del modello, è stata rappresentata solo una piccola porzione dell’array (2μm×2μm) ed inoltre l’altezza del bulk di rilascio è stata assunta pari a 0,5 mm.

La struttura 3D reale, è un parallelepipedo di base quadrata e altezza 7

cm cm 1 1 × m

μ . Nel modello si può assumere che i CNT si comportino come cilindri con diametro compreso tra i 50 e i 100 nm (il valore riportato nelle simulazioni è 80 nm) con coefficiente di diffusione nullo, non contribuendo perciò alla diffusione della proteina nel mezzo di rilascio. I cilindri sono disposti sull’array con una densità superficiale di e separati l’uno dall’altro da uno spazio di circa 300 nm.

2 8

10

8× cm

Nel modello eseguito, sarà considerata una porzione di array contenente soltanto sei nanotubi per lato con la reale altezza di 7 mμ

Fig5.9 Immagine nel piano xy di una porzione di array di nanotubi creato al Femlab

Fig5.10 Immagine nel piano xyz di una porzione di array di nanotubi creato al Femlab

La Fig. 5.10 è una rappresentazione di una porzione di matrice 3D, dove lo spazio tra ogni cilindro è occupato dal film di polimero, l’alginato con intrappolata la proteina, caratterizzato da un coefficiente di diffusione D (il valore di D è 10−12)[50], mentre i nanotubi di carbonio sono i cilindri cavi con

coefficiente di diffusione uguale a zero, ciò significa che la presenza dei nanotubi non influisce nella diffusione della proteina nel mezzo. Supponiamo di considerare anche il bulk di rilascio dove le cellule saranno soggette alla diffusione della proteina. Nella simulazione riportata di seguito la dimensione del bulk è stata assunta 0,5 mm, ma nella realtà il volume di rilascio può essere considerato di dimensioni infinite rispetto alle dimensioni dell’array. Al fine di rendere quanto più realistica la simulazione il bulk di rilascio non viene considerato isolato all’interfaccia con l’ambiente esterno ma viene imposta la condizione di flusso continuo.

Fig5.11 Immagine nel piano xyz di una porzione di array di nanotubi creato al Femlab e del bulk di rilascio

Ai fini di ottenere la simulazione, è necessario imporre il settaggio dei sottodomini. In questo caso saranno presi in considerazione: il bulk di rilascio, i CNT (cilindri), e il bulk 1 che rappresenta lo spazio occupato dal film di alginato.

Per il settaggio dei sottodomini sarà necessario aggiungere negli opportuni spazi il valore relativo al coefficiente di diffusione (nel caso in fig. 5.11. D è uguale a zero perché il sottodominio in esame rappresenta un cilindro e quindi un nanotubo in cui come detto precedentemente la diffusione è nulla).

Fig5.12 Schema del programma Femlab per il settaggio dei sottodomini

Successivamente sarà necessario imporre le condizioni al contorno, perché come detto già prima il programma simula matematicamente risolvendo delle equazioni differenziali che in questo caso sono equazioni di diffusione chimica. Anche per questo passaggio è possibile aggiornare una tabella che il programma fornisce autonomamente ed in cui è necessario soltanto aggiungere le condizioni al contorno del sistema fisico. Relativamente al bulk di rilascio, la condizione al contorno definita all’interfaccia (ambiente esterno/volume di rilascio) è quella di flusso continuo, poiché, nella realtà il volume in cui la proteina rilascia è molto maggiore rispetto all’altezza dei nanotubi. Il coefficiente di scambio massico h utilizzato nella simulazione è quello calcolato analiticamente nel capitolo precedente e corrisponde ad un valore di 10−9m /s.

Come dato relativo alla concentrazione iniziale di proteina impiegata da rilasciare è stato utilizzato il valore utilizzato effettivamente nelle prove sperimentali ossia 0,675 mol/m che rappresenta la concentrazione di albumina marcata. Come ultimo dato infine è necessario definire il parametro tempo: ovviamente la simulazione viene imposta dipendente dal tempo. I tempi di analisi è stato scelto da 0:1000:10000.

Fig5.13 Schema del programma Femlab per l’impostazione dei parametri di calcolo

Dopo aver imposto quindi tutti i parametri di calcolo è possibile procedere alla simulazione del processo di diffusione della proteina attraverso il film di alginato in una struttura 3D non omogenea:

che riproduce il processo diffusivo dell’albumina nel bulk di rilascio prima di raggiungere lo stato stazionario

Ciò che è importante ai fini della modellazione è conoscere la concentrazione di proteina nel bulk di rilascio e all’interfaccia tra i nanotubi e il mezzo di coltura cellulare. Considerando il punto medio di diversi piani (in particolare a distanza 10 mμ , 100μm, 200 μm, 500μm dall’interfaccia dei CNT) nel bulk di rilascio è stato possibile calcolare il profilo della concentrazione all’ultimo istante di tempo nei diversi punti e come si nota dalla Fig 5.15 è massima in prossimità dell’interfaccia e tende a diminuire man mano che la distanza dalla stessa aumenta.

Fig5.15 Andamento della concentrazione del punto medio di piani a distanza 10μm,100 μm, 200 μm, 500 μm dall’interfaccia CNT bulk di rilascio.

Ultimate tutte le fasi di progettazione ed effettuata la modellazione del sistema a rilascio di farmaco sarà possibile testare l’efficacia del sistema creato analizzando l’effetto che la proteina ha su cellule che vengono poste sulla matrice tridimensionale, ossia valutando se davvero la proteina, o comunque qualsiasi fattore di crescita si voglia, è rilasciata all’interno delle cellule. Sarà inoltre importante valutare che il sistema progettato non causi la denaturazione delle

proteine, cioè preservi la sua attività e funzionalità senza provocare alcun tipo di alterazione.