Materiali e metodi

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Materiali e metodi

Il lavoro si è incentrato su tre fasi: nella prima fase si sono condotte prove su un campione di liquame artificialmente contaminato, per valutare l’efficacia della metodica impiegata (ultracentrifugazione) nel processo di concentrazione del campione, in seguito quantificato mediante Real Time PCR; nella seconda fase si è applicata la metodica analitica a campioni ambientali per la ricerca virale; nella terza fase si è proceduto a concentrare, con la metodica messa a punto nella precedente fase, campioni di liquame prelevati con cadenza mensile da un depuratore di liquami urbani. I campioni così trattati sono stati analizzati per diversi target batterici e virali (scelti in funzione di un precedente monitoraggio) mediante: due metodiche molecolari (Real Time PCR e Microarray); un metodo colturale (infettività con titolazione virale TCID50, metodo di Sperman e Karber) per un target virale (Human Adenovirus).

Prima fase: valutazione del protocollo di trattamento del campione

Da precedenti studi è emersa la maggior efficienza dell’ultracentrifuga rispetto al polietilenglicole nel concentrare campioni di liquame ultrafiltrati. In questa fase si procede alla concentrazione, mediante centrifuga, di campioni di liquame ultrafiltrati e artificialmente contaminati con aliquote di target virali (Human Adenovirus 5, Enterovirus Coxsackievirus B2) e batterici (Salmonella Enterica) a titolo noto. Successivamente i campioni sono sottoposti ad ultracentrifuga (35000rpm a 4°C per 2 ore), estrazione acidi nucleici e analisi mediante qPCR (figura 5).

Figura 5: schema operativo valutazione del protocollo di trattamento del campione

Procedura analitica

In figura 6 è rappresentata in modo dettagliato la procedura analitica utilizzata per concentrare il campione. La metodica in questione prevede una prima concentrazione mediante centrifuga (5000 rpm per 13 minuti), così da separare i batteri dai virus, e successivamente due cicli di ultracentrifuga (35000 rpm per 2 ore a 4°C). Campione ultrafiltrato + aggiunta target a titolo noto

Ultracentrifuga Estrazione acidi _nucleici Centrifuga

qPCR

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Figura 6: protocollo analitico fase sperimentale

In seguito a questo trattamento i campioni sono stati analizzati mediante qPCR. I dati ottenuti ci hanno permesso di stabilire l’efficacia del recupero dei target mediante uno e due cicli di ultracentrifuga.

Seconda fase: applicazione metodica su campioni ambientali per la ricerca virale Campione ultrafiltrato Centrifuga Pellet (1) _Surnatante Pellet (3) Ultracentrifuga Surnatante(4) Ultracentrifuga Surnatante (6) Pellet (5) Surnatante (2)

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In questa fase si è applicata la metodica di trattamento precedentemente messa a punto su 13 campioni ambientali (liquame prelevato da un depuratore urbano) per la ricerca virale. In figura 7 viene rappresentato lo schema operativo.

Figura 7: schema operativo applicazione metodica su campioni ambientali per la ricerca virale Terza fase: monitoraggio ambientale

In seguito ai dati ottenuti nella fase di applicazione della metodica su campioni ambientali per la ricerca virale, si è deciso di concentrare tredici campioni di liquame ultrafiltrato, provenienti da un depuratore di liquami urbani, mediante centrifuga e ultracentrifuga. I campioni così trattati sono stati poi sottoposti a: titolazione virale (metodo di Spearman-Karber TCID50) per Human Adenovirus; analisi mediante qPCR e piattaforma Microarray. In figura 8 viene rappresentato lo schema operativo.

Figura 8: schema operativo relativo al monitoraggio ambientale Protocollo di trattamento dei campioni (monitoraggio ambientale)

Campione ultrafiltrato Centrifuga Pellet (1) _Surnatante Pellet (3) Ultracentrifuga Surnatante(4) Campione ultrafiltrato Estrazione acidi nucleici Ultracentrifuga qPCR Titolazione virale Microarray Centrifuga

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Per i tredici campioni del monitoraggio ambientale si è utilizzato il seguente protocollo (figura 9).

Figura 9: protocollo di trattamento dei campioni (monitoraggio ambientale)

A ciascun campione è stato assegnato un codice campione, il quale fa riferimento a un preciso step del processo di trattamento descritto nella figura soprastante (tabella 5).

Campione (1) -> analisi batteri

Campione (3) -> analisi virus dopo ultracentrifuga Campione (4) -> surnatante (conservato a -20°C)

Campione ultrafiltrato Centrifuga Pellet (1) _Surnatante Pellet (3) Ultracentrifuga Surnatante conservato (4)

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Tabella 5: campioni monitoraggio e relativa codifica

Estrazione acidi nucleici

Per l’estrazione degli acidi nucleici è stato utilizzato il QIAmp Fast DNA Stool Mini (Qiagen). Questo kit permette la co-purificazione di entrambi gli acidi nucleici se presenti, ovvero sia DNA che RNA, da matrici fecali tramite apposite colonnine da centrifuga (QIAmp Mini Spin column). Queste colonnine contengono una membrana di silica-gel su cui l’acido nucleico si lega in modo specifico, mentre i contaminanti (inibitori della PCR, proteine, cationi divalenti ecc.) passano attraverso la membrana. Durante la lisi le sostanze degradanti gli acidi nucleici e gli inibitori della PCR presenti nel campione vengono allontanate grazie all’InhibitEx buffer (incubazione a 70°C). In seguito a centrifugazione si fa precipitare la matrice del campione e l’acido nucleico presente nel sopranatante è purificato mediante QIAmp Mini spin columns. In sintesi la procedura di purificazione prevede la digestione delle proteine, il legame del DNA alla membrana di silicio della colonnina, il lavaggio delle impurità e l’eluizione del DNA puro dalla colonna.

Retro-trascrizione

Per quanto riguarda i virus a RNA si è deciso di utilizzare come kit di retrotrascrizione Vilo SuperScript (Invitrogen). Per una singola reazione, si devono combinare i seguenti componenti in una microeppendorf:

Vilo Super Script cDNA Synthesis kit Volume per 1 reazione

5X VILO Reaction Mix 4 µL

10X SuperScript Enzyme Mix 2 µL

RNA 6 µL

H2O 8 µL

Data prelievo Codice Codice Campione (1) Codice Campione (3) Codice Campione (4) 06/13 TN1 TN1-1 TN1-3 TN1-4 07/13 TN2 TN2-1 TN2-3 TN2-4 08/13 TN3 TN3-1 TN3-3 TN3-4 09/13 TN4 TN4-1 TN4-3 TN4-4 10/13 TN5 TN5-1 TN5-3 TN5-4 11/13 TN6 TN6-1 TN6-3 TN6-4 12/13 TN7 TN7-1 TN7-3 TN7-4 01/14 TN8 TN8-1 TN8-3 TN8-4 02/14 TN9 TN9-1 TN9-3 TN9-4 03/14 TN10 TN10-1 TN10-3 TN10-4 04/14 TN11 TN11-1 TN11-3 TN11-4 05/14 TN12 TN12-1 TN12-3 TN12-4 06/14 TN13 TN13-1 TN13-3 TN13-4

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impostando il seguente protocollo termico:

Fasi Temperatura Tempi

Step 1 25°C 10 minuti

Il cDNA così ottenuto sarà conservato a -20°C fino al momento dell’utilizzo. Protocolli Real Time PCR

Tutti i campioni vengono caricati in triplo in presenza di campioni standard e controllo negativo, analizzati con lo strumento ABI7300 Real Time PCR (Applied Biosystem). Nella tabella 10 sono riportate le sequenze utilizzate e la pubblicazione di riferimento.

Organismo Regione Sequenza Riferimento

bibliografico

Human

Adenovirus HEXON

AdF (100 μM): 5’-CWT ACA TGC ACA TCK CSG G-3’ AdR(100μM):5’-RCGGGCRAAYTGCACCAG-3’ AdP1(100 μM): 5’-FAM CCGGGCTCAGGTACTCCGAGGCGTCCT-TAMRA-3’ Hernroth et al., 2002 Enterovirus (Coxsackievirus B2) 5’-UTR EVF: 5’-GGCCCCTGAATGCGGCTAAT-3’ EVR: 5’-CACCGGATGGCCAATCCAA-3’ EV: 5’-FAM CGGACACCCAAAGTAGTCGGTTCCG-TAMRA-3’ Donaldson et al., 2002

Norovirus GII Rdr Pol

JJV2F: 5’-CAAGAGTCAATGTTTAGGTGGATGAG-3’ COG2R : 5’-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3’ RING2-TP: Skraber et al., 2009

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5’- FAMTGGGAGGGCGATCGCAATCT-BHQ -3’

HAV 5’-NTR

HAV 1Q:

5’-AGG CTA CGG GTG AAA CCT CTT AG – 3’

HAV 2Q:

5’-GCC GCT GTT ACC CTA TCC AA – 3’ Sybr Green Master Mix

Casas et al., 2007

Rotavirus human Beg9

AmpRV F

5’- GGAAGGCGGCTTTAAAAGAG -3’ AmpRV R

5’- CAGCTGTGGGTCAACAGAAA -3’ Sybr Green Master Mix

Pant et al., 2006 (modificato) Salmonella InvA Primer Sense 5’-AGGAAACGTTGAAAAACTGAGGA-3’ Primer Antisense 5’-TCGTCATTCCATTACCTACC-3’ Taq Man probe

5’-FAM-TCTGGTTGATTTCCTGATC-TAMRA-3’ Nam et al., 2005; Hoorfar et al., 2000 E. Coli Stx1 – Stx2 Stx1 Primer Sense: 5’-CTGGATTTAATGTCGCATAGCG-3’ Primer Antisense: 5’-AAGAACGCCCACTGAGATCATC-3’ BHQ probe: 5’-FAM CTGACGCAGTCTGTGG MGB-3’ Stx2 Primer Sense: 5’-GTTCCGGAATGCAAATCAGTC-3’ Guion et al., 2008; Bellin et al., 2001

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Primer Antisense:

5’-CTCTGTATCTGCCTGAAGCGTAAG-3’ MGB Probe:

5’ FAM-CAGAGCAGTTCTGCGTTT –MGB 3

Tabella 6: regioni e sequenze utilizzate per la costruzione di primer e sonde, comprensive di relativo riferimento bibliografico

Tali scelte sono state effettuate poiché le regioni individuate sono risultate atte all’applicazione dei protocolli da sottoporre sia per quanto riguarda le Real Time PCR sia per i protocolli Microarray. Di seguito si riportano i protocolli qPCR utilizzati.

Protocollo qPCR per Adenovirus

Il protocollo utilizzato, descritto da Henroth e colleghi (2002), è stato adottato a seguito della partecipazione del laboratorio al progetto europeo Virobathe inerente la ricerca di adenovirus in acque ricreative. Il protocollo è risultato estremamente efficiente nella sua applicazione per il monitoraggio dell’efficienza di rimozione virale nei depuratori. I primer e la probe utilizzati hanno le seguenti sequenze:

AdF: 5’-CWT ACA TGC ACA TCK CSG G-3’ AdR: 5’-RCGGGCRAAYTGCACCAG-3’

AdP1: 5’-FAM CCGGGCTCAGGTACTCCGAGGCGTCCT-TAMRA-3’ 1. Reagenti: Concentrazione della soluzione stock Concentrazione finale Volume a reazione (µl) Master Mix 2 x 2 x 1 x 12,50 Primer 1 AdR 22,5 uM 0,9 uM 1 Primer 2 AdF 22,5 uM 0,9 uM 1 Sonda AdPU 11,25 uM 0,225 uM 0,5 Estratto DNA 10 Volume totale (µl) 25

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2. Protocollo termico:

Step 1 50°C 2 minuti Attivazione

Uracil-N-Glycosylase

Step 2 95°C 10 minuti Attivazione Taq

Step 3 (45 cicli) 95°C 60°C 15 secondi 1 minuto Amplificazione e rilevazione dati

Protocollo qPCR per Norovirus GII

Il protocollo scelto è quello relativo all’articolo di Skraber et al. (2009) che ha come target la regione RdR Pol di Norovirus che è stata utilizzata per il disegno delle sonde per DNA microarray. Il protocollo è stato scelto poiché, come da bibliografia, applicato su matrice ambientale è risultato estremamente efficiente. I primer e la probe utilizzata hanno le seguenti sequenze:

Primer JJV2F 5’-CAAGAGTCAATGTTTAGGTGGATGAG-3’ Primer COG2R: 5’-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3’

Probe RING2-TP: 5’- FAM-TGGGAGGGCGATCGCAATCT-BHQ -3’ 1. Reverse Trascription:

Reazione di retrotrascrizione come da protocollo Vilo SuperScript (Invitrogen).

2. Reagenti: Concentrazione della soluzione stock Concentrazione finale Volume a reazione (µl) Master Mix 2 x 2 x 1 x 12,50 Primer JJV2F 10 uM 1000 nM 2,50 Primer COG2R 10 uM 1000 nM 2,50 Sonda RING2-TP 10 uM 100 nM 0,25 H20 2,26 cDNA 5 Volume totale (µl) 25

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Protocollo qPCR per Enterovirus

Il protocollo scelto è quello relativo all’articolo di Donaldson et al. (2002) che ha come target la regione regione 5’UTR di Enterovirus che è stata utilizzata per il disegno delle sonde per DNA microarray. Il protocollo è stato scelto poiché, come da bibliografia, applicato su matrice ambientale è risultato estremamente efficiente. Poiché questo virus è a RNA, si è proceduto alla sua retro-trascrizione utilizzando una retro-trascrittasi random primers (Vilo SuperScript cDNA kit synthesis – Invitrogen). I primer e le probe utilizzate hanno le seguenti sequenze:

Primer EVF: 5’-GGCCCCTGAATGCGGCTAAT-3’ Primer EVR: 5’-CACCGGATGGCCAATCCAA-3’

Probe EV: 5’-FAM-CGGACACCCAAAGTAGTCGGTTCCG-TAMRA-3’

1. Reverse Trascription:

Reazione di retrotrascrizione come da protocollo Vilo SuperScript (Invitrogen).

2. Reagenti: Concentrazione stock Concentrazione finale Volume a reazione (µl) Master Mix 2 x 2 x 1 x 12,5 Primer EVR 10 uM 600 nM 1,5 Primer EVF 10 uM 600 nM 1,5 Sonda EV 10 uM 250 nM 0,625 H20 3,875 cDNA 5 Volume totale (µl) 25

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Protocollo qPCR per HAV

Il protocollo, descritto da Casas et al.(2007), è stato standardizzato per la ricerca del virus in mitili a seguito di una valutazione bibliografica. Questa qPCR utilizza come Master Mix il Sybr Green. I primer utilizzati hanno le seguenti sequenze:

Primer HAV 1Q 5’- AGG CTA CGG GTG AAA CCT CTT AG – 3’ Primer HAV 2Q 5’ – GCC GCT GTT ACC CTA TCC AA – 3’ 1. Reverse Trascription:

Reazione di retrotrascrizione come da protocollo Vilo SuperScript (Invitrogen). 2. Reagenti Concentrazione della soluzione stock Concentrazione finale Volume a reazione (µl) Master Mix 2 x 2 x 1 x 12,50 primer HAV 1Q 20 uM 0,3 uM 0,375 primer HAV 2Q 20 uM 0,3 uM 0,375 H20 6,75 Estratto cDNA 5 Volume totale (µl) 25 3. Protocollo termico:

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Protocollo qPCR Rotavirus

Il protocollo attualmente in uso (Pant et al., 2007), a seguito dei problemi avuti con la sonda, utilizza i primer esterni dell’amplicone e il Sybr Green. I primer hanno le seguenti sequenze:

Primer AmpRV F (100 uM) 5’- GGAAGGCGGCTTTAAAAGAG -3’ Primer AmpRV R (100 uM) 5’- CAGCTGTGGGTCAACAGAAA -3’ 1. Reverse Trascription:

Reazione di retrotrascrizione come da protocollo Vilo SuperScript (Invitrogen). 2. Reagenti Concentrazione stock Concentrazione working Solution Concentrazione finale Volume a reazione (µl) Master Mix 2 x 2 x 1 x 12,5 Amp RV F 100 μM 20 μM 300 nM 0,375 Amp RV R 100 μM 20 μM 300 nM 0,375 H2O 6,75 cDNA 5 Volume totale (µl) 25 3. Protocollo termico:

Step 3 (45 cicli) 95°C 60°C 15 secondi 1 minuto Amplificazione e rilevazione dati Protocollo qPCR E.Coli STX1

Il protocollo scelto è quello relativo agli articoli di Guion et al.(2008) Bellin et al (2001) che hanno come target la regione Stx1 di E. Coli che è stata utilizzata per il disegno delle sonde per DNA microarray. I primer e la sonda utilizzati hanno le seguenti sequenze:

Primer Sense CTGGATTTAATGTCGCATAGCG Primer Antisense AAGAACGCCCACTGAGATCATC BHQ probe 5’ FAM CTGACGCAGTCTGTGG MGB 3’

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1. Reagenti: Concentrazione stock Concentrazione finale Volume a reazione (µl) Master Mix 2 x 2 x 1 x 12,5 Primer Fw 10 μM 900 nM 2.25 Primer Rv 10 μM 900 nM 2.25 Probe 10 μM 200 nM 0.50 H2O 2.5 DNA 5 Volume totale (µl) 25 2. Protocollo termico:

Step 3 (45 cicli) 95°C 60°C 15 secondi 1 minuto Amplificazione e rilevazione dati Protocollo qPCR E.Coli STX2

Il protocollo scelto è quello relativo agli articoli di Guion et al.(2008) e Bellin et al. (2001) che hanno come target la regione Stx2 di E. Coli che è stata utilizzata per il disegno delle sonde per DNA microarray. I primer e la sonda utilizzati hanno le seguenti sequenze:

Primer Forward GTTCCGGAATGCAAATCAGTC Primer Reverse CTCTGTATCTGCCTGAAGCGTAAG MGB Probe 5’ FAM-CAGAGCAGTTCTGCGTTT –MGB 3’ 1. Reagenti: Concentrazione stock Concentrazione finale Volume a reazione (µl) Master Mix 2 x 2 x 1 x 12,5 Primer Fw 10 μM 900 nM 2.25 Primer Rv 10 μM 900 nM 2.25 Probe 10 μM 200 nM 0.50 H2O 2.5 DNA 5

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Volume totale (µl) 25 2. Protocollo termico:

Step 3 (45 cicli) 95°C 60°C 15 secondi 1 minuto Amplificazione e rilevazione dati Protocollo qpCR Salmonella

Il protocollo scelto è quello relativo all’articolo di Nam et al (2005), Hoorfar et al. (2000), che ha come target la regione invA di Salmonella che è stata utilizzata per il disegno delle sonde per DNA microarray. I primer e la probe utilizzati hanno le seguenti sequenze:

Primer Forward 5’ AGGAAACGTTGAAAAACTGAGGA 3’ Primer Reverse 5’ TCGTCATTCCATTACCTACC 3’

Taq Man probe 5’ FAM-TCTGGTTGATTTCCTGATC-TAMRA 3’ 1. Reagenti:

Concentrazione stock Concentrazione finale Volume a reazione (µL) Master Mix 2x 2x 1x 12.50 Primer Fw 10 µM 900 nM 2.50 Primer Rv 10 µM 900 nM 2.50 Sonda 10 µM 200 nM 0.50 H2O 2.5 Estratto DNA 5 Volume totale 25 2. Protocollo termico:

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Protocolli Microarray

Di seguito sono riportati i protocolli utilizzati per la fabbricazione dei microarray da parte dell’azienda “Nanofab” di Mestre. Mediante questa piattaforma si sono ricercati i target batteri e virali precedentemente illustrati.

Fabbricazione dei vetrini microarray

La piattaforma microarray è stata disegnata in modo da alloggiare 2 sonde (ciascuna indicata con I - sonda uno – e II – sonda due) per ciascuno dei patogeni selezionati e delle sonde di allineamento e di controllo. Nella prima parte del vetrino sono state collocate le sonde per i virus, sonda I e II per ciascuno e nella seconda parte quelle per i batteri, sonda I e II. Vi sono inoltre spazi di vuoto, evidenziati in grigio; gli spazi evidenziati in bianco rappresentano invece la sonda di controllo negativo e quelli in giallo acceso la sonda di allineamento, indispensabili per il collocamento finale della griglia e l’individuazione di ciascuno spot. Lo schema è rappresentato nella figura 10:

Figura 10: schema della griglia di collocazione delle sonde per ciascuno spot del microarray.

Il design della piattaforma ha consentito di depositare su un unico vetrino 12 repliche identiche del medesimo schema, in modo da poter eseguire fino a 12 diverse prove su un unico vetrino, come illustrato in figura 11.

Figura 11: griglia degli spot all’interno del vetrino microarray

In fase di ibridazione è stato infatti possibile isolare fisicamente ciascun sub-array grazie a una griglia in plastica e silicone (ProPlate multi-array slide module – Grace BioLabs), che viene fatta aderire alla superficie dell’array. I sub-array saranno stampati con dei parametri tali da farli alloggiare

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esattamente all’interno della griglia. Il supporto di deposizione scelto è il seguente: LifeLineLab vetrini e-surf. Tali vetrini sono sviluppati per legare covalentemente DNA amino modificato per applicazioni su microarray. Le sonde (oligonucleotidi) sono state acquistate con una modifica 5’ terminale (NH3). Le sonde presentano modificazione amino-C6 in 5’ e sono state risospese in ddH2O

alla concentrazione di 100uM, per poi essere conservate a -20°C.

Per la deposizione su vetrino, le sonde sono state diluite ad una concentrazione finale di 20uM in buffer di spottaggio 1.5X, e ciascuna sonda è stata caricata nella piastra multiwells 384. La piastra viene poi conservata sigillata a -20°C.

Deposizione sonde, bloccaggio e lavaggio vetrini

La piastra multiwells con le sonde opportunamente caricate nei rispettivi pozzetti è stata sottoposta allo strumento VersArray Chip Writer – BioRad (spotter) per la stampa dei vetrini (LifeLineLab). I vetrini ottenuti sono stati successivamente sottoposti a incubazione, bloccaggio e lavaggio come da protocollo LifeLineLab. Infine si sono conservati in ambiente buio e dessicato fino al loro utilizzo finale.

Protocolli di estrazione e marcatura

Gli acidi nucleici dei campioni inviati a “Nanofab” sono stati estratti con i seguenti kit:

- Campioni di “tipo 2” (1mL di pellet risospeso in PBS, derivante da centrifuga a 5000 rpm per 13 minuti, a partire da 40 mL di ultrafiltrato): FAST STOOL KIT QIAGEN, estraendo a partire da 200 ul di campione.

- Campioni di “tipo 3” (1 mL di pellet risospeso in PBS, derivante da ultracentrifugazione a 200000xg per 2 ore a partire dal sopranatante dei campioni di “tipo 2”): VIRAL RNA MINIKIT QIAGEN, estraendo a partire da 280 ul di campione.

Gli acidi nucleici così estratti sono stati marcati fluorescentemente con i seguenti kit:

- BioPrime Plus Array CGH Genomic Labeling System (Invitrogen) per gli estratti di “tipo 2” - SuperScript Plus Direct cDNA Labeling System (Invitrogen) per i campioni di “tipo 3”. Di seguito vengono brevemente riassunti i due protocolli di marcatura:

- Neosintesi del filamento di cDNA a partire dal genoma virale ad RNA e concomitante marcatura fluorescente del filamento neosintetizzato

Kit utilizzato: SuperScript Plus Direct cDNA Labeling System (Invitrogen)

o Retrotrascrizione: sintesi del filament di cDNA, come da protocollo, concomitante marcatura del filamento neosintetizzato grazie all’incorporazione di un nucleotide fluorescente.

o Trattamento con RNAse H per la rimozione dell’RNA dagli ibridi RNA-cDNA

o Purificazione del cDNA fluorescente ottenuto tramite colonnine (Pure Link, Invitrogen), quantificazione dello stesso e ibridazione finale su array

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- Marcatura diretta del genoma (batterico o virale) a dsDNA tramite frammento exo-klenow della DNA Pol1 e concomitante marcatura fluorescente dei frammenti neosintetizzati Kit utilizzato: BioPrime Plus Array CGH Genomic Labeling System (Invitrogen)

o Marcatura del genoma a dsDNA tramite exo-Klenow fragment della DNA Pol 1 e concomitante marcatura fluorescente tramite l’utilizzo di random primers e dNTP mix fluorescenti (Alexa Fluor)

o Purificazione del campione marcato tramite colonnine (fornite dal kit), quantificazione dello stesso e ibridazione finale sull’array

Protocollo di ibridazione comune

Gli acidi nucleici estratti e marcati con le procedure sopra descritte, sono state ibridizzate su array mediante il seguente protocollo.

Reagente Concentrazione finale Volume a reazione (µL) DNA da ibridare X X SSC 4.5X 22.5 SDS 0.1% 1 BSA 0.2mg/mL 20 Allineamento 0.25 H2O A volume finale di 100 µL

Il vetrino viene incubato a 55°C overnight in stazione di ibridazione Advalytix e successivamente viene lavato utilizzando il seguente protocollo:

Fase Reagente Tempo

Primo lavaggio SSC 3X, SDS 0.1%

A temperatura di ibridazione

per 5 minuti Secondo lavaggio SSC 0.2X 2 minuti

Terzo lavaggio SSC 0.1X 2 minuti

Quarto lavaggio H2O 30 secondi

Spin dry del vetrino per pochi secondi e scansione finale

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Metodo di Spearmand-Karber per titolazione virale TCID50

Poiché le metodiche molecolari sopra citate non sono in grado di darci informazioni riguardo all’infettività dei target rilevati nei campioni, si è deciso di allestire una titolazione virale, utilizzando il metodo di Spearman-Karber. Il target virale per questa metodica è l’adenovirus, in quanto è risultato positivo in tutti i campioni analizzati. Questo metodo di titolazione biologica quantifica l’ammontare di virus richiesti per lisare il 50% delle cellule infettate o per produrre un effetto citopatico, sempre del 50%, sul tappeto cellulare dove è stato inoculato. Per la quantificazione si posizionano le cellule HeLa nei pozzetti di una 96 well plate, in modo da formare il monostrato, poi si aggiungono le diluizioni seriali della sospensione virale. Ogni diluizione dei campioni viene inoculata in 8 pozzetti, dopo 5 giorni d’incubazione si osserva manualmente e si registra, per ogni diluizione, in quanti pozzetti l’effetto citopatico è ≥ 50%. I risultati, che vengono espressi come: “positivo” (effetto citopatico nel pozzetto ≥ 50%) e “negativo” (effetto citopatico < 50%), vengono utilizzati per calcolare matematicamente la quantità di virus, espressa come TCID50/ml.

TCID50= Δ ̶ δ (S ̶ 0.5)

Δ = log10 della diluizione con il 100% di pozzetti che presentano effetto citopatico

δ = log10 del fattore di diluizione

S = somma dei pozzetti positivi per diluizione, inclusi quelli della diluizione con il 100% delle colture infette (questa diluizione ha valore 1 e tutte le altre sono frazioni di 1).

Protocollo:

- Preparare diluizioni seriali dei campioni che si vogliono titolare (il numero di diluizioni dipende dalla quantità di virus nel campione, più è alta la quantità di virus maggiori devono essere le diluizioni seriali). Nel nostro caso sono state fatte due diluizioni (-1, -2).

- Introdurre in ogni pozzetto della piastra a 96 wells:

o 75 µl di terreno di coltura + HEPES all’1% (indispensabile per mantenere stabile il pH); o 75 µl di tutti i campioni interi, per ogni diluizione fare 8 repliche; nei pozzetti di

controllo invece del campione si caricano 75 µl di H2O sterile; o 50 µl di sospensione contenente cellule HeLa e D-MEM + FBS al 50%

- Dopo 5 giorni osservare al microscopio ottico i pozzetti, confrontando l’effetto citopatico (figura 12) con il tappeto cellulare presente nei pozzetti di controllo.

Figura 12: effetto citopatico osservato in un pozzetto “positivo” della 96 well plate.