Quindi per concentrare i campioni ambientali si è scelto di utilizzare l’ultrafiltrazione seguita

Riassunto

Le carenze riscontrate nell’ambito dell’approvvigionamento idrico rendono sempre più evidente l’importanza del riuso delle acque reflue per differenti fini: irrigazione di colture destinate al consumo umano, di pascoli, di parchi e aree ricreative come espresso nel D.Lgs n°152/99. Non si può però ignorare la presenza in queste acque di organismi potenzialmente patogeni (virus, batteri, protozoi), responsabili di gravi infezioni a trasmissione oro-fecale. Per questo motivo è fondamentale il controllo della qualità igienica dei reflui e le pratiche di disinfezione, il cui scopo è prevenire la diffusione dei patogeni nei corpi idrici. E’ inoltre essenziale monitorare il rischio di trasmissione di malattie sia per gli operatori del settore, sia per tutti quelli che, direttamente o indirettamente, vengono a contatto con tali matrici. La normativa vigente prevede la valutazione dell’efficacia dei trattamenti degli impianti di depurazione dei reflui mediante la sola ricerca di batteri indicatori di contaminazione fecale (E. Coli e Enterococchi), ma non di protozoi e virus. In particolare, per i virus ciò è dovuto principalmente alla difficoltà del rilevarli nell’ambiente, in seguito alla mancanza di metodiche innovative e standardizzate che siano adattabili a tutti i virus enterici. Tramite metodiche molecolari è possibile ricercare e identificare patogeni direttamente dalla matrice ambientale. Una metodica molto utilizzata per questo tipo di ricerca è la qPCR (Real Time PCR), in quanto presenta un’elevata sensibilità. Allo stesso tempo però non è in grado di rilevare l’infettività e può presentare problemi d’interferenza, dovuti per esempio alla presenza di eventuali inibitori. Inoltre i patogeni potenzialmente presenti sono molteplici e quindi è necessario eseguire più reazioni. Tramite PCR- multiplex si possono analizzare diversi target con la stessa reazione di PCR, ma dalla letteratura è emerso che anche questa metodica presenta delle problematiche. Una tecnologia alternativa per l’analisi di matrici ambientali contaminate da svariati patogeni potrebbe essere quella che si avvale dei microarray, i quali utilizzano oligonucleotidi di sequenza nota a singolo filamento per cercare una sequenza complementare (sempre a singolo filamento), in una sequenza molto lunga di DNA (oppure in un genoma) opportunamente marcato, dando così alta specificità di riconoscimento. L’uso di microarray è consolidato in campo clinico ma raramente applicato a campioni ambientali a causa della scarsa sensibilità. Tuttavia nei liquami, vista l’alta concentrazione di patogeni enterici è possibile ipotizzarne l’applicazione. In un precedente lavoro sono stati messi a punto i protocolli RT-PCR e microarray per rilevare microrganismi patogeni nei liquami. I target analizzati sono stati: Human Adenovirus, Hepatits A virus, Human Enterovirus, Human Rotavirus e Norovirus GGII per i virus, per quanto riguarda i batteri: Salmonella Enterica ed E. Coli Enteroemorragici (STX1 e STX2). L’applicazione di tali metodi a campioni artificialmente contaminati ha indicato la necessità di aumentare la purificazione del campione per migliorare la resa della PCR e, contemporaneamente, di aumentare la concentrazione del campione per ottimizzare la risposta del microarray. In una prima fase di questo lavoro di tesi le metodiche di purificazione e concentrazione del campione sono state implementate su campioni artificialmente contaminati, confrontando due diverse tecniche di concentrazione: precipitazione con il PEG e ultracentrifuga. Successivamente i protocolli messi a punto sono stati applicati a campioni di liquami, prelevati con cadenza mensile per un anno all’ingresso di un impianto di depurazione di liquami urbani. Questa seconda fase ha previsto una concentrazione del campione mediante ultrafiltrazione a flusso tangenziale, seguita da ultracentrifugazione. Campioni artificialmente contaminati (1L), sono stati dapprima ultrafiltrati, successivamente concentrati con i due metodi messi a confronto e sottoposti ad estrazione degli acidi nucleici. In tal modo si è ottenuta una concentrazione di 10

CG/µL (per i campioni trattati con ultrafiltrazione + precipitazione con PEG in 5 mL finali) e di 10

CG/µL (per i campioni trattati con ultrafiltrazione + ultracentrifuga in 1 mL finale).

Quindi per concentrare i campioni ambientali si è scelto di utilizzare l’ultrafiltrazione seguita

dall’ultracentrifugazione. Con questo protocollo, nei 13 campioni di liquami analizzati con la Real

Time PCR, sono stati evidenziati Adenovirus (mediamente 3.82*10

CG/µL), Norovirus GGII

(mediamente 2.37*10

CG/µL), HAV (mediamente 1.16*10

CG/µL), Enterovirus Coxsackievirus B2

(mediamente 3,34+10

CG/ µL), mentre gli altri target sono risultati negativi. Per quanto riguarda il

microarray, nei campioni del monitoraggio la presenza di patogeni è stata rilevata quando le

concentrazioni misurate con qPCR risultavano uguali o maggiori di 10

CG/µL.