PORT.NOC II
Valutazione di portainnesti per la tolleranza/resistenza a Phytophthora e black-line e valorizzazione di varietà di Juglans regia compatibili
Muriel Gaudet
CNR-IRET, Istituto di Ricerca sugli Ecosistemi Terrestri, Porano (TR)
Incontro:
Noci italiane, un’eccellenza da tutelare
29 Novembre 2022 – Webinar
Obiettivi e attività PORTNOC - Sintesi
PORTNOC I
Ø Sviluppo di un set di 10 marcatori SSR
Ø Caratterizzazione genetica delle 23 piante madri selezionate per il progetto
Ø Caratterizzazione genetica e analisi di parentela di 405 progenie da libera impollinazione delle piante madri.
PORTNOC II
Ø Caratterizzazione genetica e analisi di parentela di progenie da libera impollinazione di 5 piante madri selezionate, 70 del primo anno e 66 del secondo anno.
Ø Realizzazione di un esperimento di trascrittomica (RNA-seq) per identificare geni associati alla tolleranza a Phytophthora cinnamomi.
Ø Messa a punto di marcatori molecolari neutrali microsatelliti (SSR) per la caratterizzazione genetica e analisi di parentela
OBIETTIVI
Ø Ricerca di marcatori funzionali associati alla tolleranza a Phytophthora cinnamomi
Materiali e Metodi
Caratterizzazione genetica – Analisi di parentela - 1
Elettroforesi capillare con sequenziatore ABI Prism 3130 (Applied Biosystems).
Dati analizzati mediante software Gene Mapper 4.0 à genotipizzazione.
Amplificazione del DNA (PCR) con il set di 10 marcatori SSR
Analisi dei profili genetici
programmi GenAlEx 6.5, STRUCTURE 2.3.4 e CERVUS 3.0.7
STRUCTURE
5 piante madri selezionate à semi da libera impollinazione à progenie di semenzali:
70 piante del primo anno, 66 del secondo anno
Per definire il profilo genetico delle progenie si parte dal DNA estratto da foglie (Dneasy 96 Plant Kit, Qiagen).
Risultati
Caratterizzazione genetica – Analisi di parentela - 2
J. major Ibridi di noce «nero» J. microcarpa J. hindsii J. paradoxJ. regiaJ. nigraJ. nigra x regia.
Madre ibridi di J. major
Caratterizzazione genetica delle madri ibride J. major
(PORTNOC I).
Ø Le piante madri selezionate hanno un profilo genetico più simile a J. nigra, eccetto la 6/22
Ø Quasi tutte le progenie hanno un profilo genetico più simile a J. nigra
Ø Qualche pianta somiglia geneticamente più a J. regia o J. nigra x regia.
Madri ibridi J. major selezionate J. nigra J. regia J. nigra x regia Madri ibridi J. major
Progenie del anno 1 Progenie del anno 2
PCoA basata sulle distanze genetiche
J. regia J. nigra
J. nigra x regia
madri ibride J. major
J. regia J. nigra J. nigra x regia.
Madre ibridi di J. major
Risultati
Caratterizzazione genetica – Analisi di parentela - 3
Il raggruppamento delle progenie in base all’analisi Bayesiana STRUCTURE conferma i risultati della PCoA.
Conclusione :
le madri sono state fecondate
maggiormente da polline di piante del gruppo dei noci
“neri” dello
Juglandeto CREA-FL
Risultati
Caratterizzazione genetica – Analisi di parentela - 4
Ø La genotipizzazione ha evidenziato 6 piante triploidi nelle progenie, 3 nel primo anno e 3 nel secondo anno.
Analisi di parentela
Per l’analisi di maternità è stato utilizzato il programma Cervus.
SSR WGA9 SSR WGA1
à 3 picchi osservati invece di 1 o 2 come atteso
Progenie anno I
Progenie anno II
Assegnazione madre 93% 97%
Assegnazione madre attesa 76% 64%
Conclusione
Il set di 10 SSR messo a punto è efficace per:
• Differenziare le diverse specie di Juglans
• Fare le analisi di parentela
• Caratterizzare geneticamente le piante
a b
a
a
b
a b
a
b
Madre
Progenie
Progenie
Progenie
Madre
Progenie
Progenie
SSR WGA256 SSR WGA276
Esperimento di trascrittomica RNA-seq - 1 Materiale Vegetale
Ottobre 2019: prelievo 14 cimali di un anno presso CREA-FL
J. regia 76 (JR76)
suscettibilea P. cinnamomi
J. microcarpa 12 (JM12) tollerantea P. cinnamomi
Disegno sperimentale
• 3 punti di inoculazione con P. cinnamomi (T)
• 3 punti di inoculazione con acqua (C)
• 3 repliche biologiche
• 2 tempi dopo inoculazione: 24h (T1) e 5 giorni (T5)
Prelievi del tessuto ai bordi delle necrosi, pool dei 3 punti di inoculazione
Messa punto protocollo purificazione RNA totale
Esperimento
Esperimento di trascrittomica RNA-seq - 2
Metodi
Preparazione dei campioni
Sequenziamento
Controllo Trattamento
Estrazione RNA Preparazione libraries
Analisi bioinformatiche
Allineamento reads Genoma di riferimento J. regia (NCBI: wgs.5d).
Analisi statistiche
• Determinazione dei geni differenzialmente espressi (DEG)
• Selezione dei DEG con un fold-change ≥ 2
trattamento/controllo
Laboratorio Sequentia Laboratorio CNR IRET
Sequenziamento Produzione reads
«two paired-end x 150 bp»
Illumina
NovaSeq6000
Esperimento di trascrittomica RNA-seq - 3
Risultati
üInfezione con P. cinnamomi
ØL’inoculazione con P.
cinnamomi ha provocato infezione in ambedue i genotipi.
ØConferma della
suscettibilità della specie J. regia rispetto alla
tolleranza di J. microcarpa.
Esperimento di trascrittomica RNA-seq - 4
Risultati
ü Analisi dei geni differenzialmente espressi (DEG)
Ø Maggiore regolazione genica a T5 Ø Più geni down-regolati (quasi
60%) a T5 DEG significativi con fold-change ≥ 2.
Differenza tra:
• T1 e T5
• JM12 e JR76
JM12 JM12
JR76 JR76
T1 T5
Geni sopra espressi Geni sotto espressi
Ø JM12 presenta meno DEG che JR76 sia a T1 che T5.
Ø JR76 presenta più di 60 % di geni up-regolati a T1.
Ø JM12 ha un numero quasi uguale di geni up- e down-regolati a T1.
Confronto tra T1 e T5
Confronto tra JM12 e JR76
Esperimento di trascrittomica RNA-seq - 5 Risultati
T1 • 3 geni ↑ up-regolati in JM12 e ↓ down-regolati in JR76
• 8 geni ↑ up-regolati in JR76 e ↓ down-regolati in JM12 T5 • 53 geni ↑ up-regolati in JM12 e ↓ down-regolati in JR76
• 40 geni ↑ up-regolati in JR76 e ↓ down-regolati in JM12 ØGeni con regolazione
opposta tra i genotipi
ØGeni up- e down- regolati specifici di ciascun genotipo di noce.
Diagrammi di VENN
Esperimento di trascrittomica RNA-seq - 6 Risultati
Le vie metaboliche:
• Risposta agli stimoli esterni,
• Trasporto di soluti,
• Organizzazione della parete cellulare
• Azione fitormonale
sono coinvolte nella risposta agli stress e i geni presenti in queste vie sono dei buoni candidati per spiegare la differenza di tolleranza tra le due specie.
üAnalisi funzionale dei DEG regolati in maniera opposta tra JR76 e JM12
Classificazione in bin metabolici
Esperimento di trascrittomica RNA-seq - 7
Risultati
ü Geni candidati coinvolti nella toleranza a P. cinnamomi
Geni candidati di interesse
• Pathogenesis-related protein 1A-like
• Endochitinase like,
à intervengono nei meccanismi attivi di resistenza e nella degradazione della parete cellulare dei funghi.
• Glutamate receptor 2.8-like
à lo stesso pattern di regolazione è stato trovato in uno studio di confronto tra cultivar di frumento: sopra-espressione nella cultivar tollerante e forte repressione in quella sensibile allo stress idrico e salino. (Dugasa et al, 2021)
Ø Le piante selezionate e prodotte nel progetto sono caratterizzate geneticamente grazie al set di 10 marcatori molecolari SSR.
Ø La realizzazione dell’esperimento comparativo di inoculazione artificiale di P.
cinnamomi e analisi del trascrittoma ha evidenziato una differente regolazione genica:
o Tra le due specie J. microcarpa e J. regia
o Tra i due tempi di studio, 1 e 5 giorni dopo l’inoculazione
Ø La maggior regolazione genica è stata osservata dopo 5 giorni dall’inoculazione Ø E stato evidenziato un gruppo di geni con regolazione opposta tra le 2 specie che
possono spiegare la diversa tolleranza al patogeno.
Conclusioni
I geni identificati nell’esperimento RNA-seq sono dei buoni candidati per
la messa a punto preliminare di marcatori funzionali per la selezione di
piante tolleranti alla P. cinnamomi.
Ringraziamenti
Juglandeto del CREA-PLF
