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TRADUZIONE DEL TESTO DEL BREVETTO EUROPEO N. 2465542 DAL TITOLO:
“CONIUGATI DI OLIGOSACCARIDE-PROTEINA ”
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Descrizione CAMPO DELL’INVENZIONE
[0001] Questa domanda rivendica il beneficio di priorità della Domanda Provvisoria U.S. No. 61/122851.
[0002] La presente divulgazione si riferisce generalmente a coniugati di oligosaccaride-proteina che comprendono particolari oligosaccaridi, ed a composizioni che comprendono tali coniugati. La presente divulgazione si riferisce inoltre a metodi di trattamento di disordini da accumulo lisosomiale che utilizzano coniugati di oligosaccaride-enzima lisosomiale.
[0003] I disordini da accumulo lisosomiale (LSD) sono una classe di disordini metabolici rari che comprende oltre quaranta malattie genetiche che comportano una carenza nell'attività di idrolasi lisosomiali. Una caratteristica distintiva degli LSD è l’accumulo anormale di metaboliti lisosomiali, cosa che porta alla formazione di un grande numero di lisosomi dilatati.
[0004] Gli LSD possono essere trattati mediante la somministrazione della versione attiva dell'enzima carente nel soggetto, un processo chiamato terapia enzimatica sostitutiva (ERT). L'enzima sostitutivo somministrato che reca un mannosio-6-fosfato (M6P)
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terminale viene assimilato dalle cellule bersaglio attraverso l’endocitosi mediata dal recettore di M6P indipendente dai cationi associato alla superficie cellulare (CI-MPR), e diretto al lisosoma.
[0005] In generale, gli enzimi di sostituzione scarsamente fosforilati non vengono interiorizzati in modo efficiente dal recettore di M6P sulla superficie cellulare, e di conseguenza non possono essere diretti al lisosoma dove essi funzionano. Di conseguenza, un basso grado di fosforilazione del mannosio può avere un effetto significativo e deleterio sulla efficacia terapeutica di un enzima di sostituzione.
[0006] Sono stati sviluppati metodi per aumentare il contenuto di M6P degli enzimi di sostituzione. Per esempio i Brevetti U.S. No. 6 534 300; 6 670 165; e 6 861 242 descrivono la fosforilazione enzimatica di residui di mannosio terminali. In un altro esempio, il Brevetto U.S. No.
7 001 994 descrive un metodo per l’accoppiamento di oligosaccaridi comprendenti M6P con glicoproteine. Un coniugato dell'enzima lisosomiale α-glucosidasi acida (GAA), con un oligosaccaride di bis- M6P preparato mediante questo metodo è stato riscontrato essere più efficace nella riduzione del glicogeno di muscolo cardiaco e scheletrico rispetto alla GAA umana ricombinante in un modello murino di malattia di Pompe, una malattia muscolare autosomica recessiva derivante da una carenza metabolica di GAA, e caratterizzata da un accumulo di glicogeno lisosomiale. Analogamente, Zhu et al., descrivono l’accoppiamento di un oligosaccaride di bis-M6P sintetico (Formula A) con GAA. Zhu et al., Biochem. J. 389: 619-628 (2005). La Formula A è
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stata disegnata dalla struttura di Man9 triantennaria naturale di glicani N-collegati (Formula B) rimuovendo un ramo, accorciando un altro ramo, e fosforilando i residui di mannosio terminali.
[0007] Il coniugato risultante si è legato a CI-MPR con affinità aumentata, è stato interiorizzato in modo più efficiente da parte di mioblasti L6, e ha avuto una attività enzimatica approssimativamente normale. Nonostante questo successo, tuttavia, rimane importante identificare nuovi oligosaccaridi che possono avere come risultato una affinità migliorata per CI-MPR e/o una internalizzazione cellulare più efficiente quando coniugati ad enzimi lisosomiali, pur mantenendo una attività enzimatica normale o quasi normale. Una assimilazione migliorata da sola, tuttavia, non ha come risultato necessariamente un migliore risultato terapeutico. Alcune strategie di coniugazione e alcuni oligosaccaridi hanno come risultato coniugati con attività enzimatica più
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bassa. Di conseguenza è desiderabile identificare oligosaccaridi e coniugati che possono migliorare i risultati terapeutici per i soggetti con LSD.
[0008] In aggiunta, alcuni oligosaccaridi come quelli mostrati nelle Formule A e B possono essere difficili e costosi da sintetizzare.
Inoltre, fabbricare saccaridi β-collegati in maniera stereoselettiva è stato un problema difficile nella chimica dei carboidrati. Oligosaccaridi e metodi di sintesi alternativi possono essere più pratici per l'uso su una scala commerciale. Esiste una necessità aggiuntiva di ottimizzare i metodi utilizzati per preparare i coniugati di oligosaccaride-proteina. In particolare, ai fini terapeutici, le preparazioni di coniugato non dovrebbero essere altamente eterogenee, siccome questo può avere come risultato una funzione biologica incongruente. Molteplici aspetti dei coniugati possono influenzare l'efficacia terapeutica, includendo gli oligosaccaridi e i linker utilizzati, i metodi di coniugazione, i metodi di purificazione, e le formulazioni.
[0009] Di conseguenza, alcuni casi della presente divulgazione forniscono coniugati di oligosaccaride-proteina comprendenti (1) una proteina e (2) un oligosaccaride di Formula I:
5 in cui:
a = α1,2; α1,3; α1,4; o α1,6;
b = α1,2; α1,3; o α1,4;
c = α1,2; α1,3; α1,4; o α1,6; e d = α, β, o una miscela di α e β.
[0010] Altri casi della presente divulgazione forniscono coniugati di oligosaccaride-proteina comprendenti (1) una proteina e (2) un oligosaccaride di Formula II:
in cui:
e = α1,2; α1,3; α1,4; o α1,6 e f = α, β, o una miscela di α e β,
con la condizione che f = α o una miscela di α e β quando e = α1,6.
[0011] Ancora altri casi della presente divulgazione forniscono coniugati di oligosaccaride-proteina comprendenti (1) una proteina e (2) un oligosaccaride di Formula III:
6 in cui:
g = α1,2; α1,3; o α1,4;
h = α1,2; α1,3; α1,4; o α1,6; e i = α, β, o una miscela di α e β.
[0012] Altri casi della presente divulgazione forniscono coniugati di oligosaccaride-proteina comprendenti (1) una proteina e (2) un oligosaccaride di Formula IV:
in cui:
j è α1,2;
k viene selezionato da α, β, e una miscela di α e β;
x è 1, 2, o 3; e
quando x è 2 o 3, il collegamento tra ciascun mannosio viene selezionato da α1,2; α1,3; α1,4; e α1,6.
[0013] Altri casi forniscono coniugati di oligosaccaride-proteina comprendenti (1) una proteina e (2) un oligosaccaride di Formula V:
in cui:
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I viene selezionato da α, β, e una miscela di α e β.
[0014] Casi aggiuntivi forniscono coniugati di oligosaccaride- proteina comprendenti (1) una proteina e (2) un oligosaccaride di Formula VI:
in cui:
Rx e Ry vengono selezionati ciascuno indipendentemente da glicole polietilenico e C1-C10 alchile facoltativamente sostituito con osso, nitro, alogeno, carbossile, ciano, o alchile inferiore, e facoltativamente interrotto con uno o più eteroatomi selezionati da N, O, o S;
z viene selezionato da 0, 1, 2, 3, o 4;
m viene selezionato da α, β, e una miscela di α e β; e
quando y è 2, 3 o 4, il collegamento tra ciascun mannosio viene selezionato da α1,2; α1,3; α1,4; e α1,6.
[0015] In ulteriori casi, la presente divulgazione fornisce coniugati di oligosaccaride-proteina comprendenti (1) una proteina e (2) un oligosaccaride di Formula A.
[0016] In alcuni casi, il coniugato comprende almeno 2, 3, 4, o 5 moli di oligosaccaride di Formula A per mole della proteina.
[0017] In alcuni casi, i coniugati di oligosaccaride-proteina della presente divulgazione comprendono un linker tra i componenti di oligosaccaride e proteina del coniugato.
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[0018] la presente divulgazione fornisce composizioni farmaceutiche comprendenti coniugati di oligosaccaride-proteina di Formula I, II, III, IV, V, o VI e un riempitivo, agente volumizzante, disgregante, tampone, stabilizzante o eccipiente. La presente divulgazione fornisce inoltre metodi di trattamento di un disordine da accumulo lisosomiale, come, per esempio, quelli descritti nella Tabella 1 sotto, con un coniugato di oligosaccaride-proteina di Formula I, II, III, IV, V, o VI o una composizione farmaceutica comprendente un tale coniugato di oligosaccaride-proteina. Il disordine da accumulo lisosomiale può essere selezionato da, per esempio, malattia di Fabry, malattia di Pompe, malattia di Niemann-Pick A, malattia di Niemann- Pick B, e mucopolisaccaridosi I. In altri casi, la presente divulgazione fornisce l'uso di un coniugato di oligosaccaride-proteina comprendente (1) una proteina e (2) un oligosaccaride di Formula I, II, III, IV, V, VI e nella fabbricazione di un medicinale per il trattamento di un disordine da accumulo lisosomiale in un soggetto che ne ha necessità.
[0019] Sulla base della divulgazione che è contenuta qui, la presente invenzione fornisce un metodo di preparazione di un composto avente la Formula VIIA:
in cui:
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R1 viene selezionato da idrogeno, idrossile, un gruppo alchile facoltativamente sostituito avente da 1 a 4 atomi di carbonio, fosfato, solfato, -OR7, un gruppo di protezione, e un saccaride;
R2, R3, R4, e R5 vengono selezionati, ciascuno, indipendentemente da idrogeno, solfato, idrossile, -OR8, un gruppo di protezione e un saccaride;
R6 viene selezionato da idrogeno, idrossile, carbossile, alcossicarbonile, ammino, ammide, alchilammino, amminoalchile, amminossi, idrazide, idrazina, alchenile facoltativamente sostituito, e alchile C2-C6 facoltativamente sostituito;
R7 e R8 vengono selezionati ciascuno indipendentemente da acetile e un gruppo alchile facoltativamente sostituito avente da 1 a 4 atomi di carbonio; e
n è un intero da 1 a 10; comprendente:
a) il trattamento di un composto avente la Formula VIIIA:
in cui:
da R1 fino a R5 sono come definiti sopra; e
R9 e R10 vengono selezionati da idrogeno e idrossile, in modo tale che quando uno di R9 e R10 è idrossile, l'altro è idrogeno;
con un composto avente la Formula R11R12(Sn=O) per formare un composto avente la Formula IXA:
10 in cui:
da R1 fino a R5 sono come definiti sopra; e
R11 e R12 vengono selezionati, ciascuno, indipendentemente da alchile non sostituito, o R11 e R12, presi insieme, vengono selezionati da alchilene non sostituito;
e
b) il trattamento del composto di Formula IXA, facoltativamente in presenza di un alogenuro di metallo, con un composto avente la Formula R6-(CH2)n-L,
in cui:
R6 ed n sono come definiti sopra; e
L è un alogeno; per formare il composto di Formula VIIa.
[0020] Ulteriori forme di realizzazione dell'invenzione vengono discusse in tutta questa domanda. Altri scopi, caratteristiche, e vantaggi della presente invenzione risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata. Qualsiasi forma di realizzazione discussa rispetto ad un aspetto della presente invenzione si applica anche ad altri aspetti dell'invenzione e viceversa. Le forme di realizzazione nella sezione Esempio sono intese essere forme di realizzazione dell'invenzione che sono applicabili a tutti aspetti dell'invenzione.
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[0021] Dovrebbe essere compreso, tuttavia, che la descrizione dettagliata e gli esempi specifici, pur indicando forme di realizzazione specifiche dell'invenzione, vengono dati solamente a titolo di illustrazione, dal momento che svariati cambiamenti e modificazioni all’interno dello spirito e dell'ambito di applicazione dell'invenzione risulteranno evidenti ai tecnici competenti nell’arte da questa domanda.
Breve descrizione delle Figure
[0022] La Figura 1 illustra uno schema retrosintetico esemplificativo che espone le fasi per la sintesi di Oligosaccaride 82.
[0023] La Figura 2 illustra una sintesi esemplificativa del blocco di costruzione di monosaccaride 2a che può essere impiegato nella sintesi di oligosaccaridi descritti qui.
[0024] La Figura 3 illustra sintesi esemplificative di blocchi di costruzione di monosaccaridi 1, 2, 3, e 4 che possono essere impiegati nella sintesi di oligosaccaridi descritti qui.
[0025] La Figura 4 illustra uno schema di sintesi per la preparazione di un linker di etilene.
[0026] La Figura 5 illustra uno schema sintetico per l'assemblaggio di un precursore di trisaccaride all’oligosaccaride 82 usando i blocchi di costruzione 2, 3, e 4.
[0027] La Figura 6 illustra uno schema sintetico per l'assemblaggio di un eptasaccaride protetto dal precursore di trisaccaride descritto in Figura 4.
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[0028] La Figura 7 illustra uno schema sintetico per lo sbloccaggio dell’eptasaccaride protetto descritto nella Figura 5, per dare l’Oligosaccaride 82.
[0029] Le Figure 8A-E rappresentano uno schema sintetico per la preparazione di un esasaccaride β-collegato di Formula A utilizzando dibutilstagno a formare un intermedio stereoselettivo, e una forma alternativa con un gruppo tiolo-reattivo.
[0030] La Figura 9 mostra l'effetto del livello di ossidazione sulla coniugabilità di βSAM6 di NeoGAA. La Fig. 9A mostra la quantità di oligosaccaridi di SAM2, SAM3, SAM4, SAM4 lineare, αSAM6, e βSAM6 coniugati con GAA in svariati rapporti molari. La Fig. 9B mostra la quantità di esasaccaride (glicano) coniugato con rhGAA ossidato utilizzando differenti quantità di periodato.
[0031] La Figura 10 mostra l'ossidazione di acido sialico, fucosio, galattosio, e mannosio con quantità variabili di periodato. La Fig. 10A mostra l’ossidazione come monitorata mediante l’analisi della composizione di monosaccaride (ossidazione dedotta sulla base della riduzione nelle quantità di monosaccaride quantificate). La Fig. 10B mostra il rilevamento in LTQ MS di oligosaccaride di SAM6 etichettato con AA in modalità positiva. Le Figg. 10C e 10D mostrano uno spettro di MS/MS corrispondente ad oligosaccaridi ossidati etichettati con AA.
La Fig. 10E mostra una analisi di monosaccaride di coniugato di GAM titolato con svariate quantità di GAO.
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[0032] La Figura 11 mostra l'analisi di HPLC di oligosaccaridi rilasciati da rhGAA e NeoGAA.
[0033] La Figura 12 mostra l’analisi in LC/MS di mappatura di peptide di rhGAA trattata con periodato 2 e 22,5 mM. Nei riquadri sono evidenziate le posizioni di eluizione di peptide triptico T13 (contenente le metionine 172 e 173) non ossidato, e singolarmente e doppiamente ossidato.
[0034] La Figura 13 mostra l’analisi di legame di Biacore di NeoGAA e rhGAA a sCIMPR. Fig. 13A Sensorgramma che mostra le fasi di associazione, dissociazione, eluizione di M6P, e rigenerazione per ciascuna iniezione del campione. Fig. 13B Adattamento a 4 parametri esemplificativo dei dati del sensorgramma per campioni di NeoGAA e campione di controllo di rhGAA. Fig. 13C affinità di recettore di M6P di campioni di NeoGAA preparati utilizzando periodato 2 mM contro 7,5 mM, tra i differenti livelli di coniugazione per ciascuna preparazione.
[0035] La Figura 14 mostra l'attività specifica di svariati coniugati di NeoGAA.
[0036] La Figura 15A-E mostra l’eluizione di coniugati di NeoGAA da una colonna di recettore di M6P. La Fig. 15F mostra i livelli di glicogeno di tessuto in topi GAAKO dopo la somministrazione di 4 dosi settimanali di coniugati di SAM6.
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[0037] La Figura 16 mostra i risultati da un saggio di assorbimento di mioblasti L6, che dimostrano l’interiorizzazione di svariati coniugati di NeoGAA.
[0038] La Figura 17 mostra la clearance del glicogeno dal cuore, dai quadricipiti, e dai tricipiti di topi con abbattimento di GAA dopo il trattamento con SAM2.
[0039] La Figura 18 mostra la clearance del glicogeno dal cuore e dai quadricipiti di topi con abbattimento di GAA dopo il trattamento con SAM4.
[0040] La Figura 19 mostra la clearance del glicogeno dal cuore e dai quadricipiti di topi con abbattimento di GAA dopo il trattamento con SAM6.
[0041] La Figura 20 mostra la clearance del glicogeno dal cuore e dai quadricipiti di topi con abbattimento di GAA dopo il trattamento con SAM6 e GAM6.
DESCRIZIONE DELLE FORME DI REALIZZAZIONE
[0042] Per aiutare nella comprensione della presente divulgazione, includendo la presente invenzione, vengono prima definiti alcuni termini. Ulteriori definizioni vengono fornite in tutta la domanda.
[0043] Come utilizzato in questa descrizione specifica e nelle rivendicazioni allegate, le forme singolari "un", "uno" e "il" includono i riferimenti plurali a meno che il contenuto dica chiaramente il contrario.
Pertanto, per esempio, il riferimento ad un metodo contenente "un composto" include una miscela di due o più composti. Il termine "o"
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viene generalmente impiegato nel suo senso che include "e/o" a meno che il contenuto dica chiaramente il contrario.
I. Coniugati di oligosaccaride-proteina
[0044] In un caso, la presente divulgazione fornisce coniugati di oligosaccaride-proteina, i quali possono comprendere inoltre un linker.
Oligosaccaridi, proteine, linker, metodi di coniugazione, e coniugati esemplificativi vengono divulgati.
A. Oligosaccaride
[0045] L'oligosaccaride può essere selezionato da derivati di oligosaccaridi biantennari di Formula B o Formula VI, come raffigurato sopra, o derivati di oligosaccaridi lineari come mostrato nelle Formule IV e V. Gli oligosaccaridi biantennari, in generale, hanno due residui di M6P terminali, e possono, in alcuni casi, comprendere inoltre uno o più penultimi residui di M6P. Gli oligosaccaridi lineari hanno almeno un residuo di M6P, e possono comprendere un residuo di M6P terminale.
In generale, i residui di M6P terminali possono essere collegati da un collegamento α1,2. (Vedere Distler et al., J. Biol. Chem. 266: 21687- 21692 (1991), che osserva che un collegamento α1,2 al M6P terminale ha avuto come risultato un legame maggiore a CI-MPR ed a MPR dipendente da catione (CD-MPR) rispetto ai collegamenti α1,3 o α1,6).
In alcuni casi i residui di M6P terminali sono collegati, alle rispettive estremità riducenti, al residuo adiacente da un collegamento α1,2. In alcuni casi, due residui di M6P terminali sono distanti più di 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, o 40 Å, come determinato mediante, per esempio,
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cristallografia a raggi X, NMR, e/o modellistica molecolare. Per esempio, la modellistica molecolare può essere effettuata come descritto in Balaji et al., Glycobiology 4: 497-515 (1994). In alcuni casi, l'oligosaccaride viene selezionato in modo tale che i residui di M6P terminali abbiano un ingombro sterico relativamente piccolo. In alcuni casi, gli oligosaccaridi in cui i residui di M6P terminali sono relativamente non ostacolati si sono legati a CI-MPR con affinità maggiore rispetto agli oligosaccaridi in cui i residui di M6P terminali sono ostacolati.
[0046] In generale, l'oligosaccaride si legherà a CI-MPR. Per esempio, l'oligosaccaride può legarsi a CI-MPR con una costante di dissociazione inferiore a, per esempio, 500, 100, 50, 10, 5, 1, o 0,1 nM o inferiore a, per esempio, 100, 50, 10, 5, 2, o 1 µM. La struttura cristallina dei domini N-terminali 1-3 di CI-MPR è conosciuta, in entrambe le forme, legato e non legato al ligando. Olson et al., J. Biol.
Chem. 279: 34000-34009 (2004); Olson et al., EMBO J. 23: 2019-2028 (2004). Inoltre, il CD-MPR strutturalmente correlato è anche conosciuto in entrambe le forme, legato e non legato al ligando. Olson et al., J.
Biol. Chem. 274: 29889-29886 (1999); Olson et al., J. Biol. Chem. 277:
10156-10161 (2002). Di conseguenza, il tecnico competente dovrebbe essere in grado di utilizzare queste informazioni strutturali dei recettori per selezionare un oligosaccaride appropriato.
[0047] L'oligosaccaride può essere selezionato, per esempio, da uno qualsiasi degli oligosaccaridi di Formule I, II, III, IV, V, o VI,
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come illustrato sopra e includendo gli Oligosaccaridi 1-127 descritti di seguito. Gli oligosaccaridi di Formule I-III sono formalmente derivati dalla Formula B mediante la rimozione di un ramo, la rimozione e/o la sostituzione di un residuo di monosaccaride, e/o la modificazione del collegamento (per esempio, α1,2; α1,3, α1,4, o α1,6) tra residui di monosaccaridi adiacenti. In alcuni casi, l'oligosaccaride può avere, per esempio, 1, 2, o 3 residui di mannosio addizionali in uno o entrambi i rami, collegati attraverso un collegamento α1,2; α1,3; o α1,6, rispetto a uno qualsiasi delle Formule I-VI.
[0048] L'oligosaccaride può avere, per esempio, uno, due o tre residui di M6P. L’oligosaccaride può avere, per esempio, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residui di monosaccaride in tutto. In altri casi, l'oligosaccaride può avere 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residui di mannosio, ciascuno dei quali può essere fosforilato o non fosforilato.
[0049] In alcuni casi, l'oligosaccaride viene selezionato dagli Oligosaccaridi 1-96, che sono specie di Formula I:
Oligosaccaride A B C D
1 α1,2 α1,2 α1,2 α
2 α1,2 α1,2 α1,2 β
3 α1,2 α1,2 α1,3 α
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Oligosaccaride A B C D
4 α1,2 α1,2 α1,3 β
5 α1,2 α1,2 α1,4 α
6 α1,2 α1,2 α1,4 β
7 α1,2 α1,2 α1,6 α
8 α1,2 α1,2 α1,6 β
9 α1,2 α1,3 α1,2 α
10 α1,2 α1,3 α1,2 β
11 α1,2 α1,3 α1,3 α
12 α1,2 α1,3 α1,3 β
13 α1,2 α1,3 α1,4 α
14 α1,2 α1,3 α1,4 β
15 α1,2 α1,3 α1,6 α
16 α1,2 α1,3 α1,6 β
17 α1,2 α1,4 α1,2 α
18 α1,2 α1,4 α1,2 β
19 α1,2 α1,4 α1,3 α
20 α1,2 α1,4 α1,3 β
21 α1,2 α1,4 α1,4 α
22 α1,2 α1,4 α1,4 β
23 α1,2 α1,4 α1,6 α
24 α1,2 α1,4 α1,6 β
25 α1,3 α1,2 α1,2 α
26 α1,3 α1,2 α1,2 β
27 α1,3 α1,2 α1,3 α
28 α1,3 α1,2 α1,3 β
29 α1,3 α1,2 α1,4 α
30 α1,3 α1,2 α1,4 β
31 α1,3 α1,2 α1,6 α
32 α1,3 α1,2 α1,6 β
33 α1,3 α1,3 α1,2 α
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Oligosaccaride A B C D
34 α1,3 α1,3 α1,2 β
35 α1,3 α1,3 α1,3 α
36 α1,3 α1,3 α1,3 β
37 α1,3 α1,3 α1,4 α
38 α1,3 α1,3 α1,4 β
39 α1,3 α1,3 α1,6 α
40 α1,3 α1,3 α1,6 β
41 α1,3 α1,4 α1,2 α
42 α1,3 α1,4 α1,2 β
43 α1,3 α1,4 α1,3 α
44 α1,3 α1,4 α1,3 β
45 α1,3 α1,4 α1,4 α
46 α1,3 α1,4 α1,4 β
47 α1,3 α1,4 α1,6 α
48 α1,3 α1,4 α1,6 β
49 α1,4 α1,2 α1,2 α
50 α1,4 α1,2 α1,2 β
51 α1,4 α1,2 α1,3 α
52 α1,4 α1,2 α1,3 β
53 α1,4 α1,2 α1,4 α
54 α1,4 α1,2 α1,4 β
55 α1,4 α1,2 α1,6 α
56 α1,4 α1,2 α1,6 β
57 α1,4 α1,3 α1,2 α
58 α1,4 α1,3 α1,2 β
59 α1,4 α1,3 α1,3 α
60 α1,4 α1,3 α1,3 β
61 α1,4 α1,3 α1,4 α
62 α1,4 α1,3 α1,4 β
63 α1,4 α1,3 α1,6 α
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Oligosaccaride A B C D
64 α1,4 α1,3 α1,6 β
65 α1,4 α1,4 α1,2 α
66 α1,4 α1,4 α1,2 β
67 α1,4 α1,4 α1,3 α
68 α1,4 α1,4 α1,3 β
69 α1,4 α1,4 α1,4 α
70 α1,4 α1,4 α1,4 β
71 α1,4 α1,4 α1,6 α
72 α1,4 α1,4 α1,6 β
73 α1,6 α1,2 α1,2 α
74 α1,6 α1,2 α1,2 β
75 α1,6 α1,2 α1,3 α
76 α1,6 α1,2 α1,3 β
77 α1,6 α1,2 α1,4 α
78 α1,6 α1,2 α1,4 β
79 α1,6 α1,2 α1,6 α
80 α1,6 α1,2 α1,6 β
81 α1,6 α1,3 α1,2 α
82 α1,6 α1,3 α1,2 β
83 α1,6 α1,3 α1,3 α
84 α1,6 α1,3 α1,3 β
85 α1,6 α1,3 α1,4 α
86 α1,6 α1,3 α1,4 β
87 α1,6 α1,3 α1,6 α
88 α1,6 α1,3 α1,6 β
89 α1,6 α1,4 α1,2 α
90 α1,6 α1,4 α1,2 β
91 α1,6 α1,4 α1,3 α
92 α1,6 α1,4 α1,3 β
93 α1,6 α1,4 α1,4 α
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Oligosaccaride A B C D
94 α1,6 α1,4 α1,4 β
95 α1,6 α1,4 α1,6 α
96 α1,6 α1,4 α1,6 β
[0050] In alcuni casi d è una miscela di α e β (vale a dire, l'oligosaccaride è una miscela di, per esempio, Oligosaccaridi 1 e 2, 3 e 4, o 95 e 96).
[0051] In alcuni casi, l'oligosaccaride viene selezionato dagli Oligosaccaridi 97-103, che sono specie di Formula II:
Oligosaccaride E f 97 α1,2 α 98 α1,2 β 99 α1,3 α 100 α1,3 β 101 α1,4 α 102 α1,4 β 103 α1,6 α Formula B α1,6 β
[0052] In alcuni casi f è una miscela di α e β (vale a dire, l'oligosaccaride è una miscela di, per esempio, Oligosaccaridi 97 e 98, 99 e 100, oppure 101 e 102).
[0053] In alcuni casi, l'oligosaccaride viene selezionato dagli Oligosaccaridi 104-127, che sono specie di Formula III:
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Oligosaccaride G h i 104 α1,2 α1,2 α 105 α1,2 α1,2 β 106 α1,2 α1,3 α 107 α1,2 α1,3 β 108 α1,2 α1,4 α 109 α1,2 α1,4 β 110 α1,2 α1,6 α 111 α1,2 α1,6 β 112 α1,3 α1,2 α 113 α1,3 α1,2 β 114 α1,3 α1,3 α 115 α1,3 α1,3 β 116 α1,3 α1,4 α 117 α1,3 α1,4 β 118 α1,3 α1,6 α 119 α1,3 α1,6 β 120 α1,4 α1,2 α 121 α1,4 α1,2 β 122 α1,4 α1,3 α 123 α1,4 α1,3 β 124 α1,4 α1,4 α 125 α1,4 α1,4 β 126 α1,4 α1,6 α
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Oligosaccaride G h i 127 α1,4 α1,6 β
[0054] In alcuni casi i è una miscela di α e β (vale a dire, l'oligosaccaride è una miscela di, per esempio, Oligosaccaridi 104 e 105, 106 e 107, oppure 126 e 127).
[0055] In alcuni casi, l'oligosaccaride viene selezionato dagli Oligosaccaridi 128-133, che sono specie di Formula IV:
Oligosaccaride K
128 A
129 B
130 A
131 B
132 A
133 B
[0056] In alcuni casi k è una miscela di α e β (vale a dire, l'oligosaccaride è una miscela di, per esempio, Oligosaccaridi 128 e 129, 130 e 131, oppure 132 e 133).
[0057] In alcuni casi, l'oligosaccaride viene selezionato dagli Oligosaccaridi 134 e 135, che sono specie di Formula V:
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[0058] In alcuni casi l’oligosaccaride è una miscela di oligosaccaridi 134 e 135.
[0059] In alcuni casi, l'oligosaccaride è l’Oligosaccaride 136, che è una specie di Formula VI:
[0060] In alcuni casi, l'oligosaccaride può essere isolato da una fonte naturale. Un oligosaccaride isolato da una fonte naturale può essere omogeneo oppure può essere una miscela eterogenea di oligosaccaridi correlati.
[0061] In alcuni casi, l'oligosaccaride viene preparato mediante sintesi chimica e/o enzimatica. In alcuni casi, un oligosaccaride può essere preparato mediante modificazione chimica o enzimatica di un oligosaccaride isolato da una fonte naturale ("semi-sintesi").
[0062] Gli oligosaccaridi possono essere sintetizzati chimicamente e/o enzimaticamente come insegnato in, per esempio, Figure 1-7, Osborn et al., Oligosaccharides: Their Synthesis and Biological Roles, Oxford University Press, 2000; Wang et al. (eds), Synthesis of Carboidrates through Biotechnology, American Chemical Society, 2004; Seeberger, Solid Support Oligosaccharide Synthesis and Combinatorial Carboidrate Libraries, Wiley-Interscience, 2001; Driguez et al., Glycoscience: Synthesis of Oligosaccharides and
25
Glycoconjugates, Springer, 1999; Düffels et al., Chem. Eur. J. 6: 1416- 1430 (2000); Hojo et al., Current Prot. Peptide Sci. 1: 23-48 (2000);
Seeberger et al., Nature 446: 1046-1051 (2007); Seeberger et al., Nature Rev. Drug Discov. 4: 751-763 (2005); Srivastana et al., Carboidrate Res. 161: 195-210 (1987); e Hagihara et al., Chem. Rec. 6:
290-302 (2006), e in Brevetti U.S. No. 5 324 663; 6 156 547; 6 573 337;
6 723 843; 7 019 131; 7 160 517.
[0063] In alcuni casi, un oligosaccaride può essere sintetizzato mediante l’aggiunta sequenziale di monosaccaridi. In alcuni casi, i monosaccaridi possono essere aggiunti ad una posizione specifica (per esempio, 2-O, 3-O, 4-O, o 6-O) di un saccaride esistente mediante protezione e deprotezione selettive. Per esempio, l’oligosaccaride 82 può essere sintetizzato come descritto nell’analisi retrosintetica in Figura 1, e negli schemi sintetici esposti nelle Figure 2-7. In alcuni casi, il blocco di costruzione 2a può essere sostituito dal blocco di costruzione 2 negli schemi sintetici delle Figure 3, 5 e 6. Se viene usato il blocco di costruzione 2a, la rimozione del gruppo di benzilidene del blocco di costruzione 2 allo stadio di eptasaccaride può essere evitata.
[0064] I residui di mannosio possono essere fosforilati enzimaticamente come insegnato in, per esempio, Brevetto U.S: No. 6 905 856. In alcuni casi, 1, 2 o 3 residui di M6P possono essere sostituiti da imitatori di M6P resistenti ad idrolasi quali, per esempio, eteri di malonile, malonati, e fosfonati, come insegnato in Berkowitz et al., Org.
Lett. 6: 4921-4924 (2004).
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[0065] In alcuni casi, un linker può essere attaccato ad un saccaride attraverso un collegamento α o β. In alcuni casi, un collegamento β può essere formato mediante i metodi descritti in Crich et al., Tetrahedron, 54: 8321-8348 (1998); Kim et al., J. Am. Chem.
Soc., 130: 8537-8547 (2008); Srivasta et al., Tetrahedron Letters, 35:
3269-3272 (1979); Hodosi et al., J. Am. Chem. Soc., 119: 2335-2336 (1997); Nicolaou et al., J. Am. Chem. Soc., 119: 9057-9058 (1997). In un caso, un collegamento β può essere formato utilizzando un ossido di dibutilstagno per formare un intermedio che può essere fatto reagire con un linker contenente un gruppo uscente disattivato.
[0066] Un aspetto della presente divulgazione fornisce un metodo di preparazione di un composto avente la Formula VII:
in cui:
R1 viene selezionato da idrogeno, idrossile, alchile inferiore facoltativamente sostituito, fosfato, solfato, -OR7, un gruppo di protezione e un saccaride;
R2, R3, R4, e R5 vengono selezionati, ciascuno, indipendentemente da idrogeno, solfato, idrossile, -OR8, un gruppo di protezione e un saccaride;
R6 viene selezionato da idrogeno, idrossile, carbossile, alcossicarbonile, ammino, ammide, alchilammino, amminoalchile,
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amminossi, idrazide, idrazina, alchenile facoltativamente sostituito ed alchile C2-C6 facoltativamente sostituito;
R7 e R8 vengono selezionati ciascuno indipendentemente da acetile e alchile inferiore facoltativamente sostituito; e
n è un intero da 1 a 10;
comprendente:
a) il trattamento di un composto avente la Formula VIII:
in cui:
da R1 fino a R5 sono come definiti sopra; e
R9 e R10 vengono selezionati da idrogeno e idrossile, in modo tale che
quando uno di R9 e R10 è idrossile, l'altro è idrogeno;
con un composto avente la Formula R11R12(Sn=O) per formare un composto avente la Formula IX:
in cui:
da R1 fino a R5 sono come definiti sopra; e
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R11 e R12 vengono selezionati ciascuno indipendentemente da alchile non sostituito o R11 e R12, nel loro insieme, vengono selezionati da alchilene non sostituito;
e
b) il trattamento del composto di Formula IX, facoltativamente in presenza di un alogenuro di metallo, con un composto avente la Formula R6-(CH2)n-L,
in cui:
R6 ed n sono come definiti sopra; e
L è un alogeno; per formare il composto di Formula VII.
[0067] Il metodo della presente invenzione, come esposto nelle rivendicazioni allegate, è basato su questo aspetto della presente divulgazione.
[0068] Con "facoltativo" o "facoltativamente" viene inteso che l'evento o la circostanza successivamente descritto può verificarsi o può non verificarsi, e che la descrizione include casi in cui l'evento o la circostanza si verifica e casi in cui non si verifica. Per esempio, "alchile facoltativamente sostituito" comprende entrambi "alchile" e "alchile sostituito" come definito di seguito. Sarà compreso dai tecnici competenti nell’arte, in relazione ad un qualsiasi gruppo contenente uno o più sostituenti, che tali gruppi non sono intesi introdurre una qualsiasi sostituzione o schema di sostituzione che è stericamente impraticabile, sinteticamente non fattibile e/o intrinsecamente instabile.
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[0069] "Alchile" comprende catena lineare e catena ramificata avente il numero di atomi di carbonio indicato, di solito da 1 a 20 atomi di carbonio, per esempio da 1 a 8 atomi di carbonio, come da 1 a 6 atomi di carbonio. Per esempio C1-C6 alchile comprende alchile a catena lineare e ramificata avente da 1 a 6 atomi di carbonio. Esempi di gruppi di alchile includono metile, etile, propile, isopropile, n-butile, sec- butile, tert-butile, pentile, 2-pentile, isopentile, neopentile, esile, 2-esile, 3-esile, 3-metilpentile, e simili. Alchilene è un altro sottoinsieme di alchile, che fa riferimento agli stessi residui di alchile, ma che ha due punti di attacco. I gruppi di alchilene di solito hanno da 2 a 20 atomi di carbonio, per esempio da 2 a 8 atomi di carbonio, come da 2 a 6 atomi di carbonio. Per esempio, C0 alchilene indica un legame covalente e C1
alchilene è un gruppo di metilene. Quando un residuo di alchile avente un numero specifico di carboni viene nominato, tutti gli isomeri geometrici aventi questo numero di carboni sono intesi essere compresi; pertanto, per esempio, "butile" viene inteso includere n-butile, sec-butile, isobutile e t-butile; "propile" include n-propile e isopropile.
"Alchile inferiore" si riferisce a gruppi di alchile aventi da 1 a 4 atomi di carbonio.
[0070] "Alchenile" indica un gruppo alchile ramificato o a catena lineare insaturo avente almeno un doppio legame carbonio-carbonio derivato dalla rimozione di una molecola di idrogeno da atomi di carbonio adiacenti dell’alchile parentale. Il gruppo può essere nella configurazione cis o trans per quanto riguarda il(i) doppio(i) legame(i).
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Gruppi di alchenile tipici includono, ma non sono limitati a, etenile;
propenili come prop-1-en-1-ile, prop-1-en-2-ile, prop-2-en-1-ile (allile), prop-2-en-2-ile; butenili come but-1-en-1-ile, but-1-en-2-ile, 2-metil- prop-1-en-1-ile, but-2-en-1-ile, but-2-en-1-ile, but-2-en-2-ile, buta-1,3- dien-1-ile, buta-1,3-dien-2-ile; e simili. In alcuni casi della presente divulgazione, per esempio, in alcune forme di realizzazione della presente invenzione, un gruppo di alchenile ha da 2 a 20 atomi di carbonio e in altri casi, per esempio, in altre forme di realizzazione, da 2 a 6 atomi di carbonio.
[0071] Il termine "sostituito", come utilizzato qui, significa che uno qualsiasi o più atomi di idrogeno sull'atomo o gruppo designato sono sostituiti con una selezione dal gruppo indicato, a condizione che la valenza normale dell'atomo designato non sia superata. Quando un sostituente è osso (vale a dire, =O), vengono sostituiti 2 idrogeni sull'atomo. Combinazioni di sostituenti e/o variabili sono ammesse solamente se tali combinazioni hanno come risultato composti stabili o intermedi di sintesi utili. Un composto stabile o una struttura stabile sono intesi implicare un composto che è sufficientemente robusto da superare un isolamento da una miscela di reazione, e una successiva formulazione come un agente avente almeno una utilità pratica. Se non diversamente specificato, i sostituenti sono nominati nella struttura di nucleo. Per esempio, deve essere inteso che quando (cicloalchil)alchile è elencato come un possibile sostituente, il punto di attacco di questo sostituente alla struttura di nucleo è nella porzione di alchile.
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[0072] Il termine "alchile sostituito", se non diversamente definito in maniera esplicita, si riferisce ad alchile in cui uno o più atomi di idrogeno sono sostituiti da un sostituente selezionato indipendentemente da:
-Ra, -ORb, -O(C1-C2 alchile)O- (per esempio, metilenediossi-), - SRb, -NRbRc, alogeno, ciano, osso, nitro, solfato, fosfato, -CORb, - CO2Rb, -CONRbRc, -OCORb, -OCO2Ra, -OCONRbRc, -NRcCORb, - NRcCO2Ra, -NRcCONRbRc, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRbRc, -NRcSO2Ra, glicole etilenico, glicole polietilenico (PEG).
dove Ra viene selezionato da alchile C1-C6 facoltativamente sostituito, arile facoltativamente sostituito, ed eteroarile facoltativamente sostituito;
Rb viene selezionato da idrogeno, -NH2, -NHRc, alchile C1-C6
facoltativamente sostituito, arile facoltativamente sostituito, ed eteroarile facoltativamente sostituito; e
Rc viene selezionato da idrogeno e alchile C1-C4
facoltativamente sostituito; o
Rb e Rc, e l'azoto al quale essi sono attaccati, formano un gruppo di eterocicloalchile facoltativamente sostituito; e
dove ciascun gruppo facoltativamente sostituito può essere non sostituito o sostituito indipendentemente con uno o più sostituenti selezionati indipendentemente da C1-C4 alchile, arile, eteroarile, arile- C1-C4 alchile-, eteroarile-C1-C4 alchile-, C1-C4 aloalchile-, -O-C1-C4
alchile, -O-C1-C4 alchilefenile, -C1-C4 alchile-OH, -O-C1-C4 aloalchile,
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alo, -OH, -NH2, -C1-C4 alchile-NH2, -N(C1-C4 alchile)(C1-C4 alchile), - NH(C1-C4 alchile), -N(C1-C4 alchile)(C1-C4 alchilfenile), -NH(C1-C4
alchilfenile), ciano, nitro, osso (come un sostituente per eteroarile), - CO2H, -C(O)OC1-C4 alchile, -CON(C1-C4 alchile)(C1-C4 alchile), - CONH(C1-C4 alchile), -CONH2, -NHC(O)(C1-C4 alchile), - NHC(O)(fenile), -N(C1-C4 alchile)C(O)(C1-C4 alchile), -N(C1-C4
alchile)C(O)(fenile), -C(O)C1-C4 alchile, -C(O)C1-C4 fenile, -C(O)C1-C4
aloalchile, -OC(O)C1-C4 alchile, -SO2(C1-C4 alchile), -SO2(fenile), - SO2(C1-C4 aloalchile), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C4 alchile), - SO2NH(fenile), -NHSO2(C1-C4 alchile), -NHSO2(fenile), e -NHSO2(C1-C4
aloalchile).
[0073] In alcuni casi, R1 viene selezionato da idrogeno, alchile inferiore facoltativamente sostituito, fosfato, solfato, -OR7, un gruppo di protezione, e un saccaride. In casi addizionali, R2, R3, R4, e R5 vengono selezionati, ciascuno, indipendentemente da idrogeno, solfato, idrossile, -OR8, un gruppo di protezione ed un saccaride. In alcuni casi, R7 e R8
vengono selezionati, ciascuno, indipendentemente da acetile e alchile inferiore facoltativamente sostituito. In alcuni casi, uno o tutti R1, R2, R3, R4, e R5 possono essere selezionati da gruppi di protezione che possono essere rimossi selettivamente, includendo eteri ed esteri di benzile, silile, e tritile diversi da acetato. In alcuni casi, due di da R1 fino a R5 presi insieme formano un gruppo di protezione. In un esempio,R1
viene selezionato da -O-benzile e -OCPh3. In un altro caso, almeno uno di da R2 fino a R5 è -O-benzile. In alcuni casi, R1, R2, e R4 sono
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ciascuno -O-benzile. In un ulteriore caso, R1 è -OCPh3 e R4 è -O- benzile. In un caso, R11 e R12, presi insieme, formano esametilene. In un altro caso, R11 e R12 sono ciascuno isopropile. In ancora un altro caso, R11 e R12 sono ciascuno esile.
[0074] In casi aggiuntivi, il composto di Formula VIII è selezionato da mannosio, ramnosio, idosio, e altrosio facoltativamente protetto. In un caso, il composto di Formula VIII è mannosio facoltativamente protetto. In alcune circostanze, il mannosio può essere protetto a una o più delle posizioni C-3, C-4 o C-6. In alcuni casi, un singolo gruppo di protezione può essere attaccato a due posizioni. Per esempio, un gruppo di benzilidene può essere utilizzato per proteggere entrambe le posizioni C-4 e C-6.
[0075] In generale, può essere utilizzato un qualsiasi gruppo di protezione sullo zucchero che non è fortemente elettrofilo o che non ha una reazione incrociata con composti di Formula IX. I gruppi di protezione adeguati includono eteri come etere di benzile, etere di tritile, etere di allile o etere di silile facoltativamente sostituito; esteri come acetato, benzoato, cloroacetato, pivalato, o levulinato facoltativamente sostituito; e acetali includendo benzilidene, isopropilidene, e diacetale di butano, tra gli altri. In aggiunta, gruppi di protezione possono essere selezionati da carbammati e uretani. In alcuni casi, i gruppi di protezione possono essere selettivamente rimossi, come, per esempio, eteri ed esteri di benzile, silile, e tritile diversi da acetato. Le posizioni e le identità dei gruppi di protezione
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possono essere variate a seconda dei prodotti finali desiderati. Altri gruppi di protezione conosciuti dai tecnici competenti nell’arte possono essere utilizzati secondo i casi descritti qui.
[0076] In un caso, il composto di Formula VIII viene trattato con un composto avente la Formula R11R12(Sn=O), in cui R11 e R12 vengono selezionati ciascuno indipendentemente da alchile non sostituito, oppure R11 e R12, presi insieme, vengono selezionati da alchilene non sostituito. In alcuni casi, R11 e R12 sono butile. In un caso, il composto avente la Formula R11R12(Sn=O) viene fatto reagire con il composto di Formula VIII in un solvente come toluene, benzene, dimetilformammide, isopropanolo, metanolo o xilene. In alcuni casi, la reazione viene eseguita a temperatura elevata, facoltativamente sotto riflusso, per formare il composto di Formula IX. In alcuni casi, la miscela di reazione viene riscaldata ad almeno 40, 50, 60, 70, o 80°C. In casi aggiuntivi, il composto avente la Formula R11R12(Sn=O) viene fatto reagire con il composto di Formula VIII per almeno 1, 2, 5, 10, 15, o 20 ore.
[0077] In un caso, il composto di Formula IX viene trattato con un composto avente la Formula R6-(CH2)n-L, facoltativamente in presenza di un alogenuro di metallo. In alcuni casi, R6 viene selezionato da idrogeno, idrossile, carbossile, alcossicarbonile, ammino, ammide, alchilammino, amminoalchile, amminossi, idrazide, idrazina, alchenile facoltativamente sostituito, e alchile C2-C6 facoltativamente sostituito. In casi addizionali, n è un intero da 1 a 10. In alcuni casi, n è 2, 3, 4, 5, o 6, e R6 è un C1-C4 alcossicarbonile. In un caso, n è 3, e R6 è
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metossicarbonile. In alcuni casi, L è un gruppo uscente che è non attivato. Esempi di gruppi uscenti attivati includono triflati, solfonati, tosilati, e altri gruppi simili attivati. In alcune circostanze, un gruppo uscente meno reattivo può essere attivato da gruppi confinanti come gruppi di allile. In alcuni casi, R6 non contiene un sostituente che attiva il gruppo uscente. In alcuni casi, L è bromuro, cloruro, o ioduro. In un caso, L è bromuro. In casi aggiuntivi, il composto di Formula R6-(CH2)n- L è 4-bromobutirrato di metile.
[0078] In un caso, il composto di Formula VIII è mannosio facoltativamente protetto, e il composto di Formula R6-(CH2)n-L è 4- bromobutirrato di metile. In un altro caso, il composto di Formula VIII è selezionato da 3,4,6-tri-O-benzil-D-mannosio e 3-O-allil-6-O-tritil-D- mannosio.
[0079] In alcuni casi, il composto di Formula IX viene trattato con un composto avente la Formula R6-(CH2)n-L in presenza di un alogenuro di metallo. Alcune forme di realizzazione di alogenuri di metallo includono fluoruri di metallo. In alcuni casi, il fluoruro di metallo viene selezionato da fluoruro di cesio, fluoruro di sodio, fluoruro di calcio, fluoruro di magnesio, fluoruro di litio, e fluoruro di potassio. In un caso, il fluoruro di metallo è fluoruro di cesio. In alcuni casi, il trattamento del composto di Formula IX con il composto di Formula R6- (CH2)n-L comprende inoltre l'aggiunta di alogenuro di tetraalchilammonio. In alcuni casi, l'alogenuro di tetraalchilammonio è ioduro di tetrabutilammonio. In casi addizionali, nella reazione può
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essere utilizzato un alogenuro di metallo. Esempi di alogenuri di metallo includono ioduri di metalli alcalini come ioduro di sodio.
[0080] In un caso, il composto di Formula IX può essere combinato con il composto di Formula R6-(CH2)n-L in un solvente aprotico polare. Tali solventi includono dimetilformammide, dimetilacetammide, dimetilsolfossido, nitrometano, esametilfosforammide, N-metilpirrolidone, acetone, acetonitrile, acetato di etile, e chetone di metil etile, tra gli altri conosciuti dai tecnici competenti nell’arte.
[0081] In alcuni casi, il composto di Formula IX può essere combinato con il composto di Formula R6-(CH2)n-L a temperatura ambiente. In altri casi, i reagenti vengono combinati e riscaldati ad almeno 50, 60, 70, o 80°C per formare un composto di Formula VII. In altri casi, la miscela viene riscaldata per almeno 1, 2, 5, 10, 15, o 20 ore.
[0082] In alcuni casi, i metodi descritti qui hanno come risultato almeno il 50, 60, 70, 80, 90, 95, o 99% di prodotto stereospecifico. In casi addizionali, la resa del prodotto stereospecifico è almeno il 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 99% della resa massima possibile. In alcuni casi, il rapporto di prodotto beta-collegato su alfa-collegato è almeno 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, o 100:1.
[0083] In un esempio, un composto di Formula VII può essere preparato su larga scala. In alcuni casi, "larga scala" si riferisce all'uso di almeno 50, 100, 500, o 1000 grammi di un materiale di partenza,
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intermedio o reagente. In casi aggiuntivi, "larga scala" include l'uso di almeno 10, 25, 50, 100, 250, o 500 kg di materiale di partenza, intermedio, o reagente.
[0084] Uno schema di sintesi esemplificativo per la preparazione di un composto di Formula A usando un reagente di ossido di dibutilstagno viene mostrato nella Figura 8.
B. Proteina
[0085] I coniugati di oligosaccaride-proteina descritti qui possono comprendere una qualsiasi proteina pura, proteina parzialmente purificata, o suo frammento, includendo proteine isolate e proteine prodotte in maniera ricombinante o in maniera sintetica. I termini "puro", "purificato" e "isolato" si riferiscono a una molecola che è sostanzialmente libera dal suo ambiente naturale. Per esempio, una proteina pura è sostanzialmente priva di materiale cellulare e/o di altre proteine dalla sorgente di cellule o di tessuto da cui essa è derivata. Il termine si riferisce a preparazioni che sono, per esempio, almeno dal 70% all’80%, dall’80% al 90%, dal 90% al 95%; o almeno al 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% (in peso/peso) pure.
[0086] In altri casi, la proteina può essere un enzima che ha un'attività ottimale, come misurata mediante un saggio di attività, ad un pH che varia da 1-7 come, per esempio, 1-3, 2-5, 3-6, 4-5, 5-6, o 4-6.
Per esempio, l'enzima può avere un pH ottimale ad un pH che varia da 4-6.
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[0087] In alcuni casi, la proteina può essere un enzima che ha un punto isoelettrico (pl), che varia da 1 a 8, come, per esempio, da 1- 3, 2-5, 3-8, 4-5, 5-6, 4-6, 5-8, 6-8, o 7-8. Il pl di una proteina può essere misurato utilizzando, per esempio, elettroforesi su gel a focalizzazione isoelettrica.
[0088] In alcuni casi, la proteina stessa ha almeno un oligosaccaride (vale a dire, essa è una glicoproteina). In casi particolari, la proteina è una glicoproteina terapeutica. Per esempio, la glicoproteina terapeutica può essere un enzima lisosomiale, includendo un enzima di ERT come, per esempio, una delle idrolasi lisosomiali elencate nella Tabella 1. In alcuni casi, l'enzima lisosomiale viene selezionato da, per esempio, α-glucosidasi (GAA), α-galattosidasi A, sfingomielinasi acida, e α-L-iduronidasi. In casi particolari, l'enzima lisosomiale è GAA.
Tabella 1: Esempi di LSD e corrispondenti idrolasi lisosomiali Disordine da accumulo
lisosomiale Enzima difettivo
Fabry α-galattosidasi A
Farber Ceramidasi acida
Fucosidosi α-L-fucosidasi acida Gaucher tipi 1, 2, e 3 β-glucosidasi acida GM1 gangliosidosi β-galattosidasi acida Hunter
(Mucopolisaccaridosi (MPS) II)
Iduronato-2-solfatasi Hurler-Scheie, Hurler,
Scheie (MPS I) α-L-Iduronidasi
Krabbe Galattocerebrosidasi
39 Disordine da accumulo
lisosomiale Enzima difettivo α-Mannosidosi α-mannosidasi acida β-Mannosidosi β-mannosidasi acida Maroteaux-Lamy (MPS
VI) Arilsolfatasi B
Leucodistrofia
metacromatica Arilsolfatasi A Morquio A (MPS IV)
N-Acetilgalattosammina-6-solfato solfatasi (N-acetilgalattosammina-6-solfatasi) (galattosio-6-solfatasi)
Morquio B (MPS IV) β-galattosidasi acida Niemann-Pick A e B sfingomielinasi acida
Pompe α-glucosidasi acida (α-glucosidasi)
Sandhoff β-esosamminidasi B
Sanfilippo A (MPS III) eparan N-solfatasi
Sanfilippo B (MPS III) α-N-Acetilglucosamminidasi Sanfilippo C (MPS III) Acetil-CoA:α-glucosamminide N-
acetiltransferasi
Sanfilippo D (MPS III) N-Acetilglucosammina-6-solfato solfatasi Schindler-Kanzaki α-N-acetilgalattosamminidasi
Sialidosi Sialidasi
Sly (MPS VII) β-Glucuronidasi
Tay-Sachs β-esosamminidasi A
[0089] In alcuni casi, la proteina può essere una glicoproteina avente almeno 1, 2, 3, 4, 5, o più oligosaccaridi N-collegati o O- collegati. In altri casi, la proteina può avere 1, 2, 3, 4, 5 o più siti di consenso per una glicosilazione N-collegata o O-collegata, almeno uno dei quali è glicosilato.
[0090] In alcuni casi, la proteina può essere un ligando per un recettore. Per esempio, in alcuni casi la proteina può essere una
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glicoproteina che si lega ad un recettore che riconosce uno zucchero come, per esempio, mannosio o mannosio-6-fosfato. In casi particolari, la glicoproteina può legarsi a, per esempio, il recettore di asialoglicoproteina, CI-MPR, CD-MPR, o il recettore di mannosio.
[0091] Le sequenze di proteina adeguate sono ben conosciute nell’arte. Un tecnico competente può facilmente identificare le regioni conservate e il(i) motivo(i) funzionale(i) significativo(i) mediante il confronto di sequenze correlate, includendo, per esempio, sequenze da specie differenti. Gli amminoacidi conservati hanno una probabilità maggiore di essere importanti per l'attività; viceversa, gli amminoacidi che non sono conservati indicano regioni del polipeptide che hanno maggiori probabilità di tollerare variazioni. Seguendo queste linee guida, il tecnico competente può identificare varianti funzionali attraverso non più di uno sforzo ordinario. Inoltre, quando la struttura cristallina è conosciuta, un tecnico competente può esaminare la struttura cristallina e identificare gli amminoacidi che possono essere importanti per la struttura e/o la funzione, e pertanto meno tolleranti alla mutazione. Il tecnico esperto sarebbe anche in grado di identificare gli amminoacidi che possono tollerare una variazione. Inoltre, il tecnico competente può valutare le possibili mutazioni in considerazione delle relazioni di struttura-funzione conosciute.
[0092] Per esempio, la sequenza e la struttura di α-galattosidasi sono ben conosciute. Vedere, per esempio, Garman et al., J. Mol. Biol., 337: 319-335 (2004); Garman et al., Mol. Genet. Metabol., 77: 3-11
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(2002); Matsuzawa et al., Hum. Genet. 117: 317-328 (2005). Vedere anche GenBank numero di accessione X05790. In un altro esempio, la sequenza di GAA è ben conosciuta (vedere, per esempio, Martiniuk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9641-9644 (1986); Hoefsloot et al., Biochem. J. 272: 493-497 (1990); Moreland et al., J. Biol. Chem. 280:
6780-6791 (2005). Vedere anche GenBank numero di accessione NM_000152. Inoltre, la struttura cristallina di una α-glicosidasi omologa da E. coli è stata determinata, e può fornire intuizioni strutturali in altre α-glicosidasi. Vedere Lovering et al., J. Biol. Chem. 280: 2105-2115 (2005). In un terzo esempio, la sequenza di sfingomielinasi acida è ben conosciuta (vedere, per esempio, Lansmann et al., Eur. J. Biochem.
270: 1076-1088 (2003)), come lo sono le caratteristiche chiave della sequenza e della struttura di sfingomielinasi acida. Vedere, per esempio, Seto et al., Protein Sci. 13: 3172-3186 (2004); Qiu et al., J.
Biol. Chem. 278: 32744-32752 (2003); Takahashi et al., Tokohu J. Exp.
Med. 206: 333-340 (2005) Vedere anche GenBank numero di accessione AI587087. In un altro esempio ancora, la sequenza di α-L- iduronidasi è ben conosciuta (vedere, per esempio, Scott et al., Proc.
Natl. Acad. Sci USA 88: 9695-9699 (1991); Scott et al., Genomics 13:
1311-1313 (1992)), come lo sono le caratteristiche chiave di α-L- iduronidasi. Vedere, per esempio, Scott et al., Hum. Mutat. 6: 288-302 (1995); Rempel et al., Mol. Genet. Metab. 85: 28-37 (2005); Durand et al., Glycobiology 7: 277-284 (1997); Beesley et al., Hum. Genet. 109:
503-511 (2001); Brooks et al., Glycobiology 11: 741-750 (2001);
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Nieman et al., Biochemistry 42: 8054-8065 (2003). In un ulteriore esempio, la sequenza di iduronato-2-solfatasi è ben conosciuta, come lo sono le mutazioni che causano malattie. Vedere, per esempio, Flomen et al., Hum. Mol. Genet. 2: 5-10 (1993); Roberts et al., J. Med.
Genet. 26: 309-313 (1989); Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:
8531-8535 (1990); Wilson et al., Genomics 17: 773-775 (1993);
Sukegwa-Hayasaka et al., J. Inherit. Metab. Dis 29: 755-761 (2006) e riferimenti in essi. La struttura di iduronato-2-solfatasi è stata modellata.
Vedere, per esempio, Kim et al., Hum. Mutat. 21: 193-201 (2003). In un altro esempio, la sequenza e la struttura di N-acetilgalattosammina-4- solfatasi (arilsolfatasi B) sono conosciute, come lo sono le mutazioni che causano malattie. Vedere, per esempio, Litjens et al., Hum. Mut. 1:
397-402 (1992); Peters et al., J. Biol. Chem. 265: 3374-3381 (1990);
Schuchman et al., Genomics 6: 149-158 (1990); Bond et al., Structure 15: 277-289 (1997).
C. Linker
[0093] In alcuni casi, i coniugati di oligosaccaride-proteina della presente divulgazione comprendono un linker tra i componenti di oligosaccaride e proteina del coniugato. In altri casi, i coniugati non includono un linker. In casi comprendenti un linker, può essere utilizzato un qualsiasi linker adeguato conosciuto da un tecnico competente nell’arte, a condizione che esso non interferisca con il legame dell’oligosaccaride a CI-MPR e/o blocchi l'attività (includendo, per esempio, l'attività enzimatica) della proteina. Per esempio, il linker può
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essere uno dei linker divulgati nei Brevetti U.S. No. 4 671 958; 4 867 973; 5 691 154; 5 846 728; 6 472 506; 6 541 669; 7 141 676; 7 176 185; o 7 232 805 o nella Pubblicazione di Domanda di Brevetto U.S.
No. 2006/0228348. In alcuni casi, il linker viene selezionato dai linker divulgati in WO2008/089,403.
[0094] In alcuni casi della divulgazione, il linker può avere la formula:
in cui Z viene selezionato da alchile, alchenile, alchinile, arile, glicole etilenico, glicole polietilenico (PEG) eteroarile, e eterociclile facoltativamente sostituito, e P viene selezionato da idrogeno o un gruppo di protezione amminico. Come usato qui, un qualsiasi gruppo chimico sul composto di amminoossi (come, per esempio, alchile, alchenile, alchinile, arile, eteroarile, eterociclile, acilossi, alcossi, arilossi, e eterociclilossi) può essere sostituito o non sostituito, e può essere interrotto da uno o più eteroatomi o gruppi chimici, se non indicato diversamente. Gli eteroatomi di interruzione includono azoto, ossigeno e zolfo. Sostituenti e gruppi chimici di interruzione possono essere selezionati da, per esempio, acile, acilammino, acilossi, alchenile, alcossi, alchile, alchinile, ammido, ammino, arile, arilossi, azido, carbamoile, carboalcossi, carbossi, ciano, cicloalchile, formile, guanidino, aloheno, eteroarile, eterociclile, idrossi, imminoammino, nitro, osso, fosfonammino, solfinile, solfonammino, solfonato, solfonile, tio, tioacilammino, tioureido, e ureido. I sostituenti possono essere essi
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stessi sostituiti o non sostituiti, e possono essere interrotti o terminati da uno o più eteroatomi come, per esempio, azoto, zolfo e ossigeno.
[0095] In un caso, il linker può essere formato mediante reazione con:
[0096] In casi addizionali, il linker può avere la formula:
-Z-NH-P
in cui Z e P sono come definiti sopra.
[0097] In un altro caso, il linker può contenere un collegamento di disolfuro. Linker di disolfuro possono essere utilizzati per attaccare oligosaccaridi ad uno scheletro di proteina, per esempio attraverso una cisteina. In un caso, il linker può comprendere o essere formato dalla reazione con:
[0098] In generale, il linker può essere di una lunghezza adeguata in modo tale che esso eviti l’ingombro sterico tra i componenti di oligosaccaride e proteina del coniugato, e non interferisca con il legame dell’oligosaccaride a CI-MPR e/o con l'attività (includendo, per esempio, l'attività enzimatica) della proteina. Per esempio, il linker può comprendere 1-100, 1-60, 5-60, 5-40, 2-50, 2-20, 5-10, o 5-20 atomi lineari, in cui il linker è attaccato alla proteina ed all’oligosaccaride per mezzo di un collegamento di estere, ammide, idrazone, ossime,
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semicarbazone, etere, tioetere, fosforotioato, fosfonato, tioestere, e/o disolfuro. I restanti atomi lineari nel linker sono, per esempio, selezionati da carbonio, ossigeno, azoto e zolfo, uno qualsiasi dei quali atomi facoltativamente può essere incluso in un anello carbociclico, eterociclico, di arile, o eteroarile. Gli atomi di carbonio lineari nel linker facoltativamente possono essere sostituiti con un sostituente selezionato da alogeno, idrossi, nitro, aloalchile, alchile, alchilarile, arile, aralchile, alcossi, arilossi, ammino, acilammino, alchilcarbamoile, arilcarbamoile, amminoalchile, alcossicarbonile, carbossi, idrossialchile, alcanosolfonile, arenesolfonile, alcanosolfonammido, arenesolfonammido, aralchilsolfonammido, alchilcarbonile, acilossi, ciano, e ureido. Un atomo di azoto lineare nel linker può essere facoltativamente sostituito con acile, solfonile, alchile, alcarile, arile, aralchile, alcossicarbonile. Un atomo di zolfo lineare nel linker può facoltativamente essere ossidato.
[0099] In alcuni casi, il linker può essere tagliabile, come divulgato in, per esempio, Pubblicazione di Domanda di Brevetto U.S.
No. 2006/0228348 e Brevetti U.S. No. 4 867 973; 7 176 185; 7 232 805.
In alcuni casi, il linker può essere tagliabile in condizioni lisosomiali.
D. Metodi di preparazione di un coniugato di oligosaccaride-proteina
[00100] I coniugati della presente divulgazione, come, per esempio, i coniugati comprendenti oligosaccaridi di Formula I, II, III, IV, V, o VI possono essere preparati mediante uno qualsiasi dei metodi
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conosciuti dai tecnici competenti nell’arte. In uno qualsiasi di questi metodi, un linker adeguato può essere presente in uno o entrambi l’oligosaccaride e la proteina. Per esempio, i coniugati possono essere preparati come descritto in, per esempio, Zhu et al., Biochem. J. 389:
619-628 (2005); Zhu et al., J. Biol. Chem. 279: 50336-50341 (2004);
Brevetti U.S. No. 5 153 312; 5 212 298; 5 280 113; 5 306 492; 5 521 290; 7 001 994; Domanda di Brevetto Provvisorio U.S. No. 60/885457, o 60/885471.
[00101] In alcuni casi, l'oligosaccaride può essere coniugato ad un amminoacido di una proteina, come una cisteina o una lisina. Per esempio, il saccaride può essere coniugato tramite una lisina mediante la modificazione dei residui di lisina nella proteina con 4-formilbenzoato di succinimidile. In aggiunta, il saccaride può essere coniugato attraverso una lisina mediante la trasformazione delle lisine con il reagente di Traut o linker che includono disolfuri come N-succinimidil-3- (2-piridilditio)propionato (SPDP) o tioli protetti come N-succinimidil-S- acetiltioacetato (SATA).
[00102] In casi aggiuntivi, l’oligosaccaride può essere coniugato ad un glicano su una glicoproteina. In un caso, l'oligosaccaride può essere coniugato ad un residuo di acido sialico su un glicano. In altri casi, l'oligosaccaride può essere coniugato a residui di mannosio, fucosio, galattosio, e/o acido sialico su un glicano. Per la coniugazione attraverso il galattosio, la glicoproteina può essere prima trattata con
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sialidasi per rimuovere i residui di acido sialico, quindi trattata con galattosio ossidasi prima della reazione con l'oligosaccaride.
[00103] Per esempio, il coniugato di oligosaccaride-proteina può essere preparato mediante la reazione di un qualsiasi gruppo funzionale che può essere presente (includendo, per esempio, una ammina, un tiolo, un acido carbossilico, un idrossile) e/o introdotto in una proteina con un secondo gruppo funzionale adeguato su un oligosaccaride. Metodi per l'introduzione di gruppi funzionali sono ben conosciuti nell'arte. Per esempio, una glicoproteina avente almeno un gruppo di carbonile può essere ottenuta mediante l’ossidazione di questa glicoproteina con, per esempio, periodato (per esempio, periodato di sodio) o con galattosio ossidasi. In un altro esempio, un gruppo di carbonile può essere introdotto mediante l'uso di un sistema di espressione avente un codice genetico espanso, come descritto in, per esempio, Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 56-61 (2003). Vedere anche, per esempio, Pubblicazione di Domanda di Brevetto U.S. No. 2006/0228348, che descrive l'introduzione di gruppi reattivi in una glicoproteina.
[00104] In alcuni casi, la glicoproteina viene ossidata con periodato prima della coniugazione con un oligosaccaride modificato con un linker contenente un gruppo carbonil-reattivo. Esempi di gruppi carbonil-reattivi includono amminossi, idrazina, o idrazide, tra gli altri. In alcuni casi, la glicoproteina è ossidata con periodato circa 1, 2, 3, 4, 5, 7,5, 10, o 22,5 mM. In alcuni casi, la glicoproteina viene ossidata in
