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3.
APPLICAZIONI TERAPEUTICHE
Nonostante siano state riscontrate alcune problematiche, ancora da risolvere, attualmente si stanno sviluppando diverse terapie basate su RNAi tanto che recentemente sono stati riportati i successi di numerosi esperimenti pilota. Questi sviluppi recenti nelle applicazioni terapeutiche di RNAi sono senza dubbio imputabili al superamento di problematiche correlate con la veicolazione. Ad esempio, il rilascio sistemico di quantità terapeutiche dei siRNA diretti contro la ApoB negli scimpanzè, è stato recentemente realizzato attraverso l’uso di liposomi a doppio strato.
Questa ed altre importanti prove, hanno dunque aperto la strada al possibile impiego sistemico di RNAi in terapia. Infatti, il potenziale terapeutico degli RNAi è stato ormai messo in evidenza in numerosi esperimenti che ne mostrano l’efficacia nei confronti di diverse patologie fra cui la sclerosi laterale amiotrofica, la degenerazione maculare dell’anziano od il cancro. Molto interessante e promettente è lo studio che ha evidenziato l’efficacia di RNAi anche nei confronti dell’infezione del virus dell’HIV in cellule in coltura. Inoltre, sono in corso alcuni “trials” clinici che usano strategie già basate su RNAi per quanto riguarda l’infezione da virus respiratorio sinciziale (RSV).
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Nella tabella 1 sono riportate alcune patologie che rappresentano possibili “targets” terapeutici per RNAi, e le industrie farmaceutiche che hanno realizzato gli studi sullo sviluppo di tali terapie (2).
Patologia Stadio di sviluppo Reagente di RNAi Veicolazione Industria Farmaceutica MALATTIE OCULARI AMD Stadio preclinico Trial clinico fase I Trial clinico fase II siRNA siRNA siRNA Iniezione diretta intravitreale Iniezione diretta intravitreale Iniezione diretta intravitreale Quark Biotech Sirna Acuity INFEZIONI VIRALI Epatite B e C Stadio preclinico shRNA Nanoparticelle rivestite da ligandi Nucleonics/Intr adigm RSV Trial clinico fase I
siRNA Aerosol Alnylam HIV Trial clinico
fase I
shRNA Lentivirus Benitec/City of Hope
CANCRO
Carcinoma epatico Stadio preclinico
siRNA Nanoparticelle rivestite da
ligandi
Calando
Carcinomi solidi Stadio preclinico siRNA Nanoparticelle rivestite da ligandi Intradigm ALTRI TIPI DI MALATTIE ALS Stadio preclinico
siRNA N/A CytRx MALATTIE
INFIAMMATORIE
Stadio preclinico
siRNA Peptide Nastech
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Specifiche applicazioni terapeutiche di RNAi
3.1.
Malattie genetiche e neurodegenerative
Una potenziale applicazione terapeutica per RNAi è il trattamento di malattie genetiche e neurodegenerative. Un promettente passo in questa direzione è stato compiuto attraverso studi preliminari che dimostrano che polimorfismi trascritti in un allele mutato di un singolo nucleotide possono essere usati come “targets” selettivi per RNAi. In molte malattie di natura neurodegenerativa viene riscontrata spesso una condizione patologica che genera estensioni di poliglutammine (poliQ) in proteine codificate attraverso trascritti contenenti la sequenza CAG. Le sequenze ripetitive CAG rappresentano “targets” competitivi, in quanto le ripetizioni di CAG sono comuni anche a molti trascritti normali, e pertanto non possono essere selettivamente bersagliate dai siRNA. In alternativa, i polimorfismi di un singolo nucleotide sono molto spesso trovati in trascritti di un allele mutato e rappresentano potenziali “targets” selettivi. La sfida consiste nel cercare una combinazione siRNA/SNP che sia altamente selettiva. Questo è stato realizzato attraverso un’analisi sistematica dei siRNA in cui il nucleotide
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polimorfo è complementare alla regione centrale del siRNA. In alcuni casi i siRNA hanno mostrato di essere in grado di dirigere la degradazione selettiva dei trascritti mutati, lasciando intatti i trascritti di tipo “selvaggio”, nonostante possiedano solamente un singolo non appaiamento con la sequenza di tipo “selvaggio” (1).
Il rilascio di RNAi nel cervello di topo è stato efficacemente usato per il trattamento dell’atassia spinocerebellare di tipo 1 (SCA1), una malattia ereditaria a trasmissione dominante che fa parte di un gruppo di patologie neurodegenerative, che comprende la corea di Huntington. SCA 1 è causato dall’estensione di ripetizione dei trinucleotidi CAG nelle forme mutanti del gene SCA 1 (Sca1; anche noto come Atxn1) che genera estensione di poliglutammine (poliQ). L’accumulo dei prodotti dei geni difettivi poliQ risulta tossico per le cellule neuronali, rendendo questo un “target” ideale per il silenziamento mediato da RNAi. In uno studio interessante, il silenziamento dei prodotti poliQ nei topi è stato ottenuto usando vettori AAV shRNA iniettati nel cervello di topi SCA1; questo ha prodotto un miglioramento nella patologia neuronale, anche in condizioni di scarsa efficienza della transfezione (2). I risultati ottenuti da questo silenziamento e la relativa inibizione della produzione della proteina neurotossica suggeriscono che tale tecnologia possa essere utile anche contro altre patologie neurodegenerative causate da proteine neurotossiche, come ad esempio il morbo di Alzheimer (3). Infatti, diversi studi si sono
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rivolti all’applicazione di RNAi in altri tipi di malattie neurodegenerative come la sclerosi laterale amiotrofica (ALS), in cui l’uso di RNAi agirebbe sostanzialmente sia sulle fasi iniziali che sulla percentuale di morte progressiva dei motoneuroni.
Ding et al. (8) hanno riportato un’interessante applicazione di siRNA diretti verso il SNP, nello studio di ALS causata da mutazioni del gene che codifica per l’enzima superossido dismutasi 1 (Sod1). Inoltre, Schwarz et al. (9) recentemente hanno testato sistematicamente i siRNA per le loro capacità di discriminare la sequenza di tipo “selvaggio” dagli alleli mutati per Sod1. Le loro scoperte supportano la teoria che i polimorfismi di un singolo nucleotide possono essere sufficienti a rendere il siRNA specifico per il mutante, se i non-accoppiamenti vengono sistemati in modo razionale.
È stato osservato che i non-accoppiamenti particolari come purina-
purina in posizione 10 e 16 dell’estremità 5′ del filamento guida, conferiscono una interessante selettività. Molte mutazioni di Sod1 consistono infatti in cambiamenti di singoli nucleotidi. Questi ricercatori sono stati in grado di ottenere la degradazione selettiva del prodotto dell’allele mutante codificante per Sod1, suggerendo così una potenziale applicazione terapeutica per il trattamento della ALS.
Altri studi (2) sulla sclerosi laterale amiotrofica, condotti su modelli murini, hanno evidenziato che il rilascio di RNAi contro il Sod1 dal vettore
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lentivirale porta ad un silenziamento stabile a lungo termine; questo fenomeno è associato ad una maggiore sopravvivenza dei neuroni e soprattutto all’eliminazione del fenotipo patologico.
Poiché la veicolazione dei siRNA e dei vettori virali che esprimono i siRNA alle regioni affette del cervello è ormai tecnicamente possibile, la prospettiva dell’uso clinico di RNAi per il trattamento di altre malattie neurodegenerative (come ad esempio il morbo di Parkinson o la corea di Huntington) può rappresentare un approccio realistico in tempi molto rapidi.
In conclusione, le strategie terapeutiche basate su RNAi per il trattamento di SCA1 e ALS mostrano efficacia nei metodi di rilascio virale
in vivo, senza effetti tossici correlati con l’uso di tali vettori.
3.2.
Malattie virali
La prima dimostrazione dell’efficacia dell’uso di RNAi in vivo ha coinvolto, nel topo, la veicolazione idrodinamica combinata del replicone dell’epatite B e di una unità di espressione di polimerasi III codificante un shRNA diretto contro il virus dell’epatite B (HBV). Questi studi (10) hanno messo in evidenza che dal shRNA espresso poteva essere abbattuto notevolmente (99%) l’antigene del core di HBV negli epatociti, fornendo
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così importanti prove di principio per successive applicazioni antivirali di RNAi nel fegato. In un altro studio (11), il rilascio di siRNA in vivo usando SNALP è stato impiegato per ridurre la replicazione virale nel topo affetto da HBV. In questo studio, notevoli modificazioni chimiche del siRNA hanno prevenuto la risposta dell’interferone e stabilizzato il siRNA a livello sierico, e l’effetto terapeutico di una singola dose di siRNA si è mantenuto per più di una settimana.
Un’altra recente ricerca (12) ha messo in evidenza che basse dosi dei vettori di espressione AAV, che trasportano shRNA anti-HBV, sono in grado di inibire nei topi l’infezione da HBV in maniera persistente per un periodo di 5 mesi, dimostrando che l’uso di RNAi risulta stabile ed efficace nei confronti delle infezioni virali.
L’epatite C (HCV) è un virus che infetta circa il 3% della popolazione mondiale e rappresenta oggi la maggiore causa di malattia cronica epatica, che può portare allo sviluppo di cirrosi epatica e carcinoma epatocellulare; per tale motivo è la principale causa di trapianti di fegato negli Stati Uniti. Il genoma di HCV è una molecola a filamento positivo di RNA con un singolo frammento codificante una poliproteina deputata alla produzione di almeno 10 proteine.
L’unica terapia correntemente disponibile utilizza interferoni ricombinati (IFN) e ribavirina. La risposta al trattamento risulta però poco soddisfacente per alcuni ceppi di HCV. Sono stati usati, per studiare la
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replicazione virale e gli effetti di vari farmaci antivirali, repliconi subgenomici e di lunghezza completa di HCV, che si replicano ed esprimono le proteine di HCV in cellule Huh-7 derivate da cellule di epatoma umano transfettate. In diversi studi (13, 14, 15), è stata valutata l’efficacia dell’inibizione mediata da siRNA della funzione del replicone
in vitro, usando tali sistemi di repliconi. È stato dimostrato che siRNAs,
che hanno come obiettivo mRNAs codificati per il sito interno di entrata del ribosoma (IRES) e le proteine non strutturali NS3 e NS5b, inibiscono la funzione del replicone HCV in colture cellulari. Inoltre, è stato dimostrato che siRNA anti-HCV inducono la guarigione di cellule Huh-7,5 che trasportano i repliconi HCV in persistente replicazione. McCaffrey et
al. (16) hanno impiegato iniezioni idrodinamiche nella vena della coda per
dimostrare che il siRNA anti-HCV sia sintetico che quello espresso dal promotore della polimerasi III, sostenevano un’efficiente degradazione delle sequenze di HCV negli epatociti murini in vivo.
Un diverso studio (17) nei topi in vivo ha utilizzato alcuni siRNA per il trattamento dell’epatite fulminante indotta da anticorpi Fas-specifici. Questi siRNA venivano iniettati idrodinamicamente in topi trattati precedentemente con l’anticorpo, con il risultato che l’82% di essi sopravviveva per i 10 giorni di osservazione, mentre in assenza di siRNA i topi morivano entro 3 giorni. Il metodo di iniezione intravenosa idrodinamica utilizzato nei topi, non è però facile da applicare al
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trattamento dell’epatite umana; infatti, nel caso dell’uomo, il rilascio dei siRNA potrebbe anche avvenire, ma le procedure di induzione rappresentano sicuramente, ancora una volta, un grande ostacolo da superare. Risulta interessante e promettente uno studio recente (18) che mostra la possibilità di introdurre materiale genetico negli epatociti utilizzando cateteri o procedure idrodinamiche localizzate.
Gli RNA virali e gli intermedi di replicazione sono dunque ormai noti bersagli potenziali delle terapie basate su RNAi ed attualmente, anche la maggior parte dei trascritti virali in cellule infettate dal virus dell’HIV, sono stati efficacemente trattati con RNAi. HIV, infatti, rappresenta uno dei primi agenti infettanti che è stato bersagliato mediante l’uso di RNAi, probabilmente a causa del fatto che sia il suo ciclo vitale sia la sua espressione genica sono ormai noti. Sono stati utilizzati siRNA sia sintetici che espressi diretti contro gli RNA codificati da HIV, incluso gli elementi TAR (19), tat (20, 21, 22), rev (20, 21), gag (23,-24), env (24), vif (19), nef (19) e transcriptasi inversa (22) . I cofattori cellulari, richiesti o per far accedere il virus dell’HIV nella cellula o per la sua replicazione, sono stati scelti come bersaglio in una strategia alternativa (25), in quanto si evita il problema della variabilità genetica nell’HIV (uno o due errori nei siti di scissione dell’siRNA diminuiscono drasticamente la potenza dell’RNAi). Cofattori cellulari, come ad esempio NFκB, il recettore CD4 per HIV e i co-recettori CXCR4 e CCR5 sono stati sottoposti, con
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successo, a down-regulation da parte di RNAi con conseguente inibizione della replicazione del virus HIV. Il recettore CC 5 delle chemochine (CCR5), co-recettore dell’HIV, è dunque un bersaglio particolarmente promettente per la terapia basata sugli RNAi, in quanto individui omozigoti per una delezione di 32 coppie di basi in questo gene, sono resistenti all’infezione da HIV e non soffrono degli effetti dannosi sulla funzione immunitaria.
Sequenze altamente conservate nel genoma virale rappresentano promettenti candidati per la terapia con RNAi. E’ stato recentemente riportato (26) che un approccio combinatoriale, utilizzando un singolo shRNA, un tipo di RNA dell’elemento TAR dell’HIV trovato nei trascritti virali, ed un ribozima a testa di martello, è dotato di una efficacia a lungo termine nei confronti dell’infezione da HIV in cellule primarie. Questa terapia tripla ad RNA sarà veicolata in cellule progenitrici emopoietiche ex
vivo, usando vettori lentivirali in un prossimo trial clinico dell’HIV.
Il rilascio di siRNA o di shRNA diretti contro geni codificanti del HIV in cellule infette rappresenta un problema da superare. Le cellule bersaglio sono principalmente linfociti T, monociti e macrofagi. Dal momento che i siRNA sintetici non persistono per lungo tempo nelle cellule, il loro rilascio dovrebbe essere indotto per anni al fine di poter ottenere buoni risultati nel trattamento dell’infezione.
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Il rilascio sistemico dei siRNA verso linfociti T rappresenta il maggior ostacolo. L’altro approccio consiste infatti nell’utilizzo di vettori virali per il rilascio di geni shRNA codificanti per anti-HIV; con i vettori virali, la veicolazione sistemica non è attualmente possibile, dal momento che l’immunogenicità dei vettori stessi precluderebbe l’uso di iniezioni multiple. Pertanto, l’isolamento delle cellule T dai pazienti seguito da transfezione, espansione delle cellule transfettate e dalla re-infusione costituiscono al momento la via preferenziale.
Il rilascio intranasale di siRNA è risultato un metodo altamente efficace per inibire l’infezione da virus respiratorio sinciziale (RSV) nei topi e l’efficacia di questo metodo di rilascio è evidenziata dai “trials” clinici in corso nell’uomo. In uno studio iniziale (27), siRNA rilasciati per via intranasale, usando nanoparticelle del polimero nanochitosano od un reagente per la transfezione o somministrato da solo, è risultato efficace nell’indurre l’RNAi senza provocare alcuna risposta dell’interferone.
Un secondo studio (6) di rilascio intranasale di siRNA che aveva come bersaglio sia il virus parainfluenzale sia quello dell’RSV ha dimostrato che esiste una competizione tra siRNA diretto verso i due “targets” virali differenti. Il meccanismo esatto da cui deriva tale competizione non è ancora del tutto chiaro; è evidente che deriva da un fenomeno di saturazione, ma non è chiaro se a carico dei complessi
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effettori RISC o di un altro componente coinvolto nelle fasi iniziali della via del RNAi.
Studi (28) sull’infezione vaginale con il virus herpes simplex 2 (HSV-2) nei topi hanno mostrato che l’infezione può essere bloccata usando un siRNA microbicida. L’applicazione vaginale di lipidi incapsulati contenenti siRNA non modificati il cui bersaglio è rappresentato dai geni del HSV-2, è stata testata nei topi e l’effetto terapeutico del siRNA somministrato prima e dopo l’esposizione al virus è stato stimato per un periodo di 15 giorni. Sei giorni dopo l’infezione, il 70% dei topi trattati con un tipo di siRNA prima dell’esposizione al virus non mostravano segni di infezione da HSV-2. Tuttavia, dopo l’esposizione al virus, una combinazione di due siRNA con distinti “targets” virali si è resa necessaria per proteggere dall’infezione da HSV-2. Tali risultati indicano che i siRNA incapsulati con lipidi possono essere impiegati come un efficace microbicida a livello della superficie mucosa, con una tossicità
in vivo non evidente.
In conclusione, questi studi, messi insieme con quelli di rilascio intranasale, indicano che le membrane mucose possano rappresentare siti efficaci per il rilascio di siRNA, dal momento che presentano notevoli vantaggi sia in termini di accessibilità sia in termini di rapporto costo/efficacia.
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3.3.
Malattie oculari: RNAi e il trattamento della AMD
La AMD, degenerazione maculare dell’anziano, è una malattia cronica e progressiva della macula che rappresenta oggi la principale causa di cecità e di grave riduzione della visione centrale nella popolazione al di sopra dei 50 anni d’età, nei paesi sviluppati.
Si tratta di una patologia degenerativa che interessa principalmente la coriocapillare, la membrana di Bruch, l’epitelio pigmentato retinico ed i fotorecettori, le cui cause sono solo parzialmente note; probabilmente sono coinvolti sia fattori genetici che ambientali. Un’ipotesi ben documentata è che, a causa dell’invecchiamento fisiologico, l’epitelio pigmentato retinico perda efficacia nel suo compito di nutrire i fotorecettori e perciò porti all’accumulo di materiale di scarto. Proprio in risposta a tale accumulo sembra essere associata una reazione infiammatoria che causa il rilascio di sostanze tossiche in grado di danneggiare la retina.
In campo farmaceutico, risulta interessante il rilascio e l’accumulo nello spazio extracellulare di una specifica proteina, che è responsabile di una crescita neovascolare anomala, tipica della patologia: il VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). La ricerca infatti è stata indirizzata ad individuare farmaci in grado di bloccare tale proteina.
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In due trials clinici attualmente in corso relativi a RNAi per il trattamento della AMD (condotti da Acuity Pharmaceuticals e Sirna
Therapeutics), è stata effettuata l’iniezione intravitreale di siRNA che
hanno come obiettivo il VEGF od il suo recettore (VEGFR1) per testarne la sicurezza ed efficacia nell’occhio. Al momento l’uso di tali siRNA non ha mostrato nei pazienti trattati, alcun effetto dannoso. Pertanto, con tale approccio, invece di antagonizzare il VEGF prodotto e rilasciato nello spazio extracellulare, viene direttamente inibita la produzione del VEGF a livello intracellulare. Attualmente si trova in fase 2 il bevasiranib, un siRNA rivolto ad antagonizzare l’RNA messaggero del VEGF. Tali promettenti risultati incrementano le prospettive future di poter applicare questo approccio terapeutico anche per il trattamento di altre patologie a livello oculare (4, 5).
3.4.
Cancro
Gli oncogeni espressi a livelli abnormemente elevati rappresentano bersagli attraenti per terapie basate su RNAi nei confronti del cancro, ed in modelli murini sembra che inibiscano efficacemente la crescita tumorale in
vivo. È interessante sottolineare che l’uso di RNAi nella terapia
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devastante. Indubbiamente la sfida per la cura del cancro non è diversa da quelle di fronte alle quali ci troviamo per altre patologie, ed include la ricerca di ottimi “targets”, veicolazioni e minima tossicità.
Uno studio recente (29) ha coinvolto il rilascio liposomiale di siRNA il cui obiettivo era rappresentato dal gene del recettore tirosin chinasico EphA2, che è normalmente sovraespresso nelle cellule del tumore ovarico. Il risultato è stato positivo: dopo il rilascio bisettimanale di siRNA per 4 settimane, è stata osservata una riduzione fino al 50% delle dimensioni del tumore. Quando la terapia con RNAi è stata combinata con un agente chemioterapico, il paclitaxel, è stata osservata una riduzione della massa tumorale addirittura fino al 90%, indicando potenziamento ed aumento dell’efficacia nella combinazione tra RNAi e le forme convenzionali di terapia delle neoplasie. Come citato in precedenza, nelle cellule metastatiche del sarcoma di Ewing sono stati ottenuti dei buoni risultati utilizzando nanoparticelle di ciclodestrine che rilasciano in maniera sistemica siRNA che ha per obiettivo il gene fuso Ews-Fli1. La crescita tumorale in vivo è stata soppressa dopo rilascio sistemico di nanoparticelle contenenti siRNA. Di maggiore significato, è stata l’osservazione che l’elevata frequenza di ricaduta associata con i trattamenti chemioterapici convenzionali per queste cellule tumorali, non si verificava nei topi a cui erano state iniettate nanoparticelle di siRNA,
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indicando il potenziale beneficio terapeutico a lungo termine di questi approcci altamente selettivi di RNAi sistemici nel trattamento del cancro.
CONCLUSIONI E SVILUPPI FUTURI
La possibilità teorica di silenziare qualsiasi gene attraverso RNAi indotti da siRNA sta suscitando un grande interesse nella comunità scientifica, così come nell’industria farmaceutica e biotecnologica.
L’importanza della scoperta degli RNAi è stata infatti messa in evidenza dal fatto che nel 2006 il premio Nobel per la Medicina è stato assegnato agli scienziati che hanno studiato l’RNAi.
L’RNAi non ha solo un profondo effetto negli studi di regolazione genica, ma risulta fondamentale in quanto è stata generata una nuova classe di agenti terapeutici basati su piccoli dsRNA. Viste le potenzialità dell’intervento farmacologico sugli mRNA, hanno avuto inizio numerosi “screening” del trascrittoma, così come numerosi “tests” di funzionalità di numerosi siRNA. Dal momento che i processi patologici dipendono solitamente dall’espressione sregolata di diversi geni, ci si attende che la somministrazione di siRNA sia in grado di arrestare tale espressione, attraverso l’RNAi; ciò potrebbe comportare un sensibile miglioramento delle terapie attualmente utilizzate.
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Terapie basate su RNAi per AMD e RSV hanno già raggiunto il livello dei “trials” clinici (fase I) ed in pochi anni inizieranno “trials” per l’infezione da HIV, da HBV, epatite C e per la corea di Huntington. Questo indica, in effetti, che i siRNA sono ben tollerati e mostrano una buona efficacia.
Il rapido sviluppo dalla scoperta iniziale alle applicazioni in medicina, è senza precedenti ed è significativo dell’enorme potenziale terapeutico posseduto da RNAi. Nonostante lo sviluppo di nuove tecnologie, sono stati incontrati alcuni ostacoli alle applicazioni terapeutiche. Alcune di queste problematiche per l’uso di RNAi, includono le prove dell’induzione dell’interferone e degli OTE mediati dai siRNA.
Studi recenti (2) hanno mostrato che elevati livelli di espressione di shRNA basati sul promotore possono essere tossici ed addirittura fatali per i topi; per ovviare a tale inconveniente sono state sviluppate modificazioni strutturali nell’ossatura del siRNA ed è stata effettuata una appropriata scelta del promotore per gli shRNA.
Sebbene il rilascio sistemico sia stato il primo ostacolo che previene il rapido sviluppo di farmaci basati su RNAi, numerosi metodi di rilascio che erano stati sviluppati per gli oligonucleotidi e per il DNA plasmidico sono stati testati e si sono dimostrati utili per le terapie basate su RNAi.
Sviluppi recenti sul rilascio hanno, anche, facilitato l’obiettivo cellulo-specifico dei reagenti di RNAi attraverso l’uso di ligandi come
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aptameri o nanoparticelle. Tuttavia vi siano ancora grandi preoccupazioni e possibili impedimenti ad una ampia applicazione di RNAi per il trattamento di patologie umane. Ad esempio, le malattie croniche come l’epatite da virus C o l’infezione da HIV richiederanno trattamenti duraturi con RNAi. Non è però ancora ben chiaro quale sia l’effetto sul metabolismo cellulare di un prolungato o ripetitivo utilizzo di RNAi.
In termini di applicazioni a lungo termine dei siRNA è possibile che la tossicità non si manifesti per mesi o addirittura per anni. Inoltre esiste l’emergente area relativa a TGS mediata da siRNA. Poiché siRNA/shRNA che dirigono il silenziamento genico post-trascrizionale sono complementari sia al messaggio che al gene, è possibile che cambiamenti non desiderati nella cromatina si potrebbero verificare in seguito ad un trattamento a lungo termine con siRNA/shRNA che mediano il silenziamento genico post-trascrizionale. Approfondire tali problematiche, richiede studi a lungo termine di RNAi in modelli animali, che sono indubbiamente rilevanti da un punto di vista terapeutico.
Un importante “target” potenziale per la terapia basata sull’uso di RNAi è rappresentato dal cancro, ma la sfida principale nella terapia del cancro è il bersagliare le cellule metastatiche che si sono diffuse a distanza dal tumore originario. Con altre forme di chemioterapia, queste cellule spesso diventano refrattarie al trattamento, provocando una ricaduta; gli
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RNAi possono essere efficacemente utilizzati per distruggere la popolazione metastatica.
Inoltre, le malattie neurodegenerative come l’Huntington o la ALS rappresentano interessanti bersagli per gli RNAi, in quanto ad oggi non esistono terapie efficaci per queste condizioni debilitanti. Per questo genere di malattie, la sfida principale è rappresentata dal rilascio di RNAi a livello di cellule specifiche nel sistema nervoso; è stato rilevato che i veicoli per il rilascio di siRNA non sono in grado di attraversare la barriera ematoencefalica. L’iniezione diretta a livello cerebrale presenta numerosi limiti legati all’invasività ed alla possibilità di continue applicazioni di siRNA, sebbene la veicolazione virale dei shRNA eviterebbe la richiesta di dosi multiple di siRNA. Vi sono, inoltre, numerose riserve e problematiche che possono ritardare o addirittura impedire terapie basate sugli RNAi per il trattamento di alcune condizioni; tuttavia questo rimane un promettente approccio principale per un ampio spettro di malattie.
Pertanto, studi futuri dovranno consentire di ottenere un rilascio efficace e di migliorare la comprensione degli effetti indesiderati per terapie basate sull’uso di RNAi. Dato il notevole interesse dell’RNAi da un punto di vista terapeutico, i prossimi studi saranno volti ad ampliare il “range” di applicazione per il trattamento basato sull’RNAi.
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BIBLIOGRAFIA
1. Lars Aagaard, John J. Rossi. RANi therapeutics: principles, prospects and challenges. Science Direct-Advanced Drug Delivery reviews. 2007, Vol. 59, 75-86.
2. Daniel H. Kim, John J. Rossi. Strategies for silencing human disease using RNA interference. Nature Reviews- Nature Publishing Group. 2007, Vol. 8, 173-184.
3. Lekha Dinesh Kumar, Alan R. Clarke. Gene manipulation through the use of small interfering RNA (siRNA): from in vitro to in vivo applications. Science Direct - Advanced Drug Delivery Reviews. 2007, Vol. 59, 87-100.
4. E., Check. A crucial test. Nature Med. 2005, Vol. 11, 243-244.
5. McFarland T.J., Zhang Y., Appukuttan B., Stout J.T. Gene therapy for proliferative ocular diseases. Expert Opin. Biol. Ther. 2004, Vol. 4, 1053-1058.
6. Bitko V., Musiyenko A., Shulyayeva O., Barik S. Inibition of respiratiry vuruses by nasally administered siRNA. Nature Med. 2005, Vol. 11, 50-55.
7. de Veer M.J., Sledz C. A., Williams B.R. Detection of foreign RNA: implications for RNAi. Immunol. Cell. Biol. 2005, Vol. 83, 224-228.
8. H. Ding, D.S. Schwarz, A. Keene, B. Affar el, L.Fenton, X. Xia, Y.
62
allele that causes amyotrophic lateral sclerosis. Aging Cell. 2003, Vol. 2, 209-217.
9. D.S. Schwarz, H. Ding, L. Kennington, J.T. Moore, J. Schelter, J.
Burchard, P.S. Linsley, N. Aronin, Z. Xu, P.D. Zamore. Designing
siRNA that distinguish between genes that differ by a single nucleotide.
PLoS Genet. 2006, Vol. 2.
10. A.P. McCaffrey, H. Nakai, K. Pandey, Z. Huang, F.H. Salazar, H.
Xu, S.F. Wieland, P.L. Marion, M.A. Kay. Inhibition of hepatitis B virus
in mice by RNA interference. Nat.Biotechnol. 2003, Vol. 21, 639-644. 11. Morissey, D.V. et al. Potent and persistent in vivo anti-HBV activity of chemically modified siRNAs. Nature Biotecnol. 2005, Vol. 23, 1002-1007.
12. Grimm, D. et al. Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature. 2006, Vol. 441, 537-541. 13. G. Randall, A. Grakoui, C.M. Rice. Clarence of replicating hepatitis C virus replicon RNAs in cell culture by small interfering RNAs. Poc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003, Vol.100, 235-240.
14. J.A Wilson, S. Jayasena, A. Khvorova, S. Sabatinos, I.G.
Rodrigue-Gervais, S. Arya, F. Sarangi, M. Harris-Brandts, S. Beaulieu, C.D. Richardson. RNA interference blocks gene expression and RNA synthesis
from hepatitis C replicons propagated in human liver cells. Poc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 2003, Vol. 100, 2783-2788.
15. S.B. Kapadia, A. Brideau-Andersen, F.V. Chisari. Interference of hepatitis C virus RNA replication by short interfering RNAs. Poc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 2003, Vol. 100, 2014-2018.
16. A.P. McCaffrey, L. Meuse, T.T. Pham, D.S. Conklin, G.J. Hannon,
63
17. E. Song, S.K. Lee, J. Wang, N.Ince, N. Ouyang, J. Min, J. Chen, P.
Shankar, J. Lieberman. RNA interference targeting Fas protects mice
from fulminant hepatitis. Nat Med. 2003, Vol.9, 347-351.
18. S.J. Eastman, K.M Baskin, B.L. Hodges, Q. Chu, A. Gates, R.
Dreusiscke, S. Anderson, R. K. Scheule. Development of catheter-based
procedures for transducing the isolated rabbit liver with plasmid DNA.
Hum. Gene Ther. 2002, Vol. 13, 2065-2077.
19. J.M. Jacque, K. Triques, M. Stevenson. Modulation of HIV-1 replication by RNA interference. Nature. 2002, Vol. 418, 435-438.
20. N.S. Lee, T. Dohyima, G. Bauer, H. Li, M.J. Li, A. Ehsani, P.
Salvaterra, J. Rossi. Expression of small interfering RNAs targeted
against HIV-1 rev trascripts in human cells. Nat.Biotchnol. 2002, Vol. 20, 500-505.
21. G.A. Coburn, B.R. Cullen. Potent and specific inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by RNA interference. J.Virol. 2002, Vol. 76, 9225-9231.
22. R.M. Surabhi, R.B. Gaynor. RNA interference directed against viral and cellular targets inhibits human immunodeficiency virus type 1 replication. J.Virol. 2002, Vol. 76, 12963-12973.
23. C.D. Novina, M.F. Murray, D.M. Dykxhoom, P.J. Beresford,
J.Riess, S.K. Lee, R.G. Collman, J. Lieberman, P. Shankar, P.A. Sharp. SiRNA-directed inhibition of HIV-1 infection. Nat. Med. 2002,
Vol. 8, 681-686.
24. W.S. Park, N. Miyano-Kurosaki, M. Hayafune, E. Nakayima, T.
Matsuzaki, F. Shimada, H. Takaku. Prevention of HIV-1 infection in
human peripheral blood mononuclear cells by specific RNA interference.
Nucleic Acids Res. 2002, Vol. 30, 4830-4835.
25. Martinez, J. & Tuschi, T. RISC is a 5’ phosphomonoester-producing RNA endonuclease. Genes Dev. 2004, Vol. 18, 975-980.
64
26. Li, M.J. et al. Long-term inhibition of HIV-1 infection in primary hematopoietic cells by lentiviral vector delivery of a triple combination of anti-HIV shRNA, anti-CCR5 ribozyme, and a nucleolar-localizing TAR decoy. Mol. Ther. 2005, Vol. 12, 900-909.
27. Zhang, W. et al. Inhibition of respiratory syncytial virus infection with intranasal siRNA nanoparticles targeting the viral NS 1 gene. Nature Med. 2005, Vol. 11, 56-62.
28. Palliser, D. at al. An siRNA-based microbicide protects mice from lethal herpes simplex virus 2 infection. Nature. 2006, Vol. 439, 89-94. 29. Landen, C.N. et al. Therapeutic EphA2 gene targeting in vivo using neutral liposomal small interfering RNA delivery. Cancer Res. 2005, Vol. 65, 6910-6918.
