Dipartimento di Ricerca Traslazionale e delle Nuove Tecnologie
in Medicina e Chirurgia
Dottorato di Ricerca in
SCIENZE CLINICHE E TRASLAZIONALI
Coordinatore Prof. Stefano Del Prato
ANALISI ULTRASTRUTTURALE DEGLI EFFETTI
DELLA RAPAMICINA IN CELLULE DI
GLIOBLASTOMA UMANO (U87MG)
Relatori: Candidata:
Prof. Francesco Fornai Dott.ssa Larisa Ryskalin
Dott.ssa Paola Lenzi
INDICE
RIASSUNTO ... I
ABSTRACT ... III
1 INTRODUZIONE ... 1
1.1 EPIDEMIOLOGIA DEI GLIOMI ... 1
1.2 FATTORI DI RISCHIO ... 3
1.3 CLASSIFICAZIONE DEI GLIOMI ... 4
1.3.1 Grado I ... 5 1.3.2 Grado II ... 6 1.3.3 Grado III ... 9 1.3.4 Grado IV ... 9 1.4 IL GLIOBLASTOMA ... 11 1.4.1 Cenni storici ... 11
1.4.2 Epidemiologia e cenni clinici ... 12
1.4.3 Caratteristiche istopatologiche e molecolari ... 14
1.4.4 Sottotipi molecolari ... 19
1.4.5 Principali alterazioni genetiche ... 21
1.4.6 Principali alterazioni nelle vie di "signaling" intracellulare ... 23
1.4.7 Terapia standard, "targeted therapies" e nuovi approcci terapeutici ... 28
1.5 LA CELLULA DI ORIGINE DEL GLIOBLASTOMA ... 32
1.5.1 L'ipotesi delle cellule cancerogene staminali e il glioblastoma ... 32
1.5.2 GSPCs: Glioblastoma Stem/Progenitor Cells ... 35
BOX1:L'AUTOFAGIA ... 39
1.6 IL COMPLESSO MOLECOLARE MTOR ... 41
1.6.1 mTOR: mammalian Target Of Rapamycin ... 41
1.6.2 mTOR signaling e tumorigenesi ... 44
1.6.3 mTOR come target terapeutico nel glioblastoma ... 46
1.6.4 Gli inibitori di mTOR: rapamicina e rapalogs ... 48
2 SCOPO DELLO STUDIO ... 52
3 MATERIALI E METODI ... 53
3.1 COLTURE CELLULARI DI GLIOBLASTOMA UMANO (U87MG) ... 53
3.2 TRATTAMENTO CON RAPAMICINA ... 53
3.3 CONTA CELLULARE IN MICOSCOPIA OTTICA ... 54
3.4 ANALISI IN MICROSCOPIA ELETTRONICA A TRASMISSIONE (TEM) ... 55
3.4.1 Processazione dei campioni per il TEM e inclusione in resina epossidica 55 3.4.2 Taglio all'ultramicrotomo di sezioni ultrafini ... 55
3.4.3 Immunocitochimica (ICC) ... 56
3.4.4 Analisi dell'ultrastruttura cellulare e dell'espressione di nestina, βIII-tubulina e LC3 in microscopia elettronica ... 57
3.4.5 Dettagli sulle tecniche di fissazione, post-fissazione e post-inclusione... 58
3.5 CONTA DELLE PARTICELLE DI ORO (IMMUNOGOLD PARTICLES) ... 59
3.6 VALUTAZIONE DEGLI "AUTOPHAGY-LIKE VACUOLES" E DEI VACUOLI LC3 POSITIVI... 60
3.7 VALUTAZIONE E CONTA DEI MITOCONDRI ... 60
3.8.1 Gruppi sperimentali e trattamenti farmacologici ... 61
3.8.2 Sacrificio e processazione dei campioni per la microscopia ottica ... 62
3.8.3 Colorazioni istologiche con Ematossilina-Eosina ... 62
3.8.4 Immunoistochimica ... 63
3.9 ANALISI STATISTICA ... 64
4 RISULTATI ... 65
4.1 LA RAPAMICINA RIDUCE IL NUMERO DI CELLULE U87MG IN MODO DOSE -DIPENDENTE ... 65
4.2 LARAPAMICINA MODIFICA L'ESPRESSIONE DELLA NESTINA E DELLA ΒIII -TUBULINA NELLE CELLULE U87MG IN MODO DOSE-DIPENDENTE ... 65
4.3 LARAPAMICINA AUMENTA IL NUMERO DEI VACUOLI ATG-LIKE E DEI VACUOLI AUTOFAGICI LC3 POSITIVI IN MODO DOSE-DIPENDENTE ... 66
4.4 LARAPAMCINA AUMENTA IL NUMERO DEI MITOCONDRI IN MODO DOSE -DIPENDENTE ... 67
4.5 EFFETTI DELLA RAPAMICINA NEL MODELLO IN VIVO DI GLIOBLASTOMA ... 68
4.6 FIGURE RISULTATI ... 70
5 DISCUSSIONE E CONCLUSIONI ... 81
6 BIBLIOGRAFIA ... 89
7 LISTA DELLE PUBBLICAZIONI ... 107
8 ELENCO DELLE COMUNICAZIONI A CONGRESSI NAZIONALI ED INTERNAZIONALI ... 108
