Nell'ambito di un vasto numero di molecole prodotte dall'epitelio delle vie aeree, svolgono un ruolo fondamentale molecole di adesione e mediatori solubili coinvolti nel reclutamento di leucociti infiammatori.

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RIASSUNTO

L'infiammazione delle vie aeree è una caratteristica comune a molte malattie dell'apparato respiratorio, tra cui la polmonite, la broncopneumopatia cronica ostruttiva, l'asma, e la sindrome da distress respiratorio acuto. Questa reazione infiammatoria è caratterizzata dal reclutamento di leucociti di origine ematica all'interno delle vie aeree. Sebbene sia stato per molto tempo considerato come una barriera passiva, l'epitelio delle vie aeree, posto all'interfaccia tra l'ambiente esterno ed il corpo, partecipa in realtà attivamente alla risposta infiammatoria.

Nell'ambito di un vasto numero di molecole prodotte dall'epitelio delle vie aeree, svolgono un ruolo fondamentale molecole di adesione e mediatori solubili coinvolti nel reclutamento di leucociti infiammatori.

Tra i mediatori solubili coinvolti nel reclutamento di leucociti, un ruolo centrale è svolto da interleuchina-8 (IL-8) e dalla proteina chemotattica per i monociti-1 (MCP-1), rispettivamente membri della famiglia di chemochine denominate CXC e CC, e coinvolte rispettivamente nel reclutamento di polimorfonucleati (PMN) e monociti. Numerosi agonisti stimolano la sintesi di queste molecole da parte delle cellule epiteliali delle vie aeree svolgono quindi un ruolo pro-infiammatorio.

Le microparticelle (MP), chiamate anche ectosomi e microvescicole, sono

frammenti di membrana liberati virtualmente da tutte le cellule eucariote a seguito

di attivazione o durante apoptosi. Sebbene i meccanismi intracellulari che portano

alla liberazione delle MP non siano ben conosciuti, si ritiene che sia implicata la

mobilizzazione del calcio intracellulare. Considerate originariamente artefatti

legati alla manipolazione in vitro delle cellule o, al più, frammenti cellulari

liberati durante la necrosi e privi di significato fisiologico, le MP sono state

recentemente coinvolte in vari processi, tra cui la coagulazione del sangue e

l'infiammazione. Per le loro caratteristiche le MP possono rappresentare un nuovo

elemento subcellulare, in grado di promuovere la liberazione dei mediatori pro-

infiammatori. In studi precedenti, svolti nel nostro laboratorio, è stato dimostrato

che i monociti/macrofagi umani, stimolati con calcio ionoforo A23187 e istamina,

liberano MP capaci di aumentare l’espressione di IL-8 ed MCP-1 a livello

dell’epitelio delle vie aeree.

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Questo risultato ha diretto la mia tesi verso l’individuazione dei possibili meccanismi di trasduzione del segnale indotti dalle MP nelle cellule epiteliali delle vie aeree, nell’ambito della loro azione pro-infiammatoria. Per raggiungere questo obbiettivo abbiamo condotto una prima serie di esperimenti per ricercare un possibile fattore di trascrizione indotto dalle MP nelle cellule epiteliali delle vie aeree; abbiamo individuato come possibile fattore di trascrizione attivato dalle MP il fattore NF-κB. Questo mio primo obiettivo è stato ottenuto mediante la tecnica EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) che viene utilizzata per studiare le interazioni DNA-proteina, nel mio caso DNA-NF-κB. L’ EMSA si basa sulla capacità che hanno i complessi DNA-proteina, in un gel di poliacrilammide, di migrare più lentamente del DNA non legato producendo uno

“shift” nella migrazione delle bande di DNA marcato. In questo esperimento è stato usato come controllo positivo il TNF-α che è noto avere un meccanismo NF- κB dipendente.

Dimostrata la dipendenza dal fattore di trascrizione NF-κB dell’azione pro- infiammatoria delle MP nelle cellule epiteliali delle vie aeree, abbiamo effettuato un'altra serie di esperimenti per meglio caratterizzare i meccanismi intracellulari indotti dalle MP che portano al rilascio di citochine. A questo proposito abbiamo indagato sul ruolo di agonisti PPAR-γ come il Rosiglitazone e il 15-deoxi-∆

- PGJ

(15d-PGJ

) sulla modulazione dell’ espressione di IL-8 ed MCP-1 indotta da MP sull’epitelio delle vie aeree. I PPAR sono fattori di trascrizione attivati da ligando appartenenti alla superfamiglia dei recettori ormonali nucleari. Se ne conoscono solo tre isoforme: α, β, γ. Conosciuti principalmente per il loro ruolo nella regolazione del metabolismo glucidico e lipidico, oggi sono coinvolti anche nella regolazione di altri fenomeni, come l’infiammazione. E’ stato dimostrato, infatti, che agonisti dei PPAR-γ inibiscono il rilascio di mediatori pro- infiammatori da parte dei monociti e delle cellule dell’epitelio sia alveolare che bronchiale; questi effetti sono stati principalmente attribuiti ad antagonismo del fattore nucleare di trascrizione NF-κB.

Nella seconda serie di esperimenti da me svolti, le MP sono state generate con

calcio ionoforo da monociti/macrofagi ed incubate con le cellule dell’epitelio

delle vie aeree pretrattate con agonisti dei recettori PPAR-γ, Rosiglitazone e 15d-

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PGJ

. Le concentrazioni di IL-8 ed MCP-1 nel sovranatante delle cellule epiteliali sono state misurate mediante kit ELISA commercialmente disponibili. Come modello delle vie aeree sono stati usati due diversi tipi di cellule: le A549 e le BEAS-2B. Le prime sono cellule tumorali alveolari, le seconde sono cellule di epitelio bronchiale derivanti da un soggetto sano deceduto per cause traumatiche e immortalizzate. Da studi precedenti fatti nel nostro laboratorio si è osservato che dopo incubazione delle cellule A549 e BEAS-2B con MP, la sintesi di IL-8 e MCP-1 da parte di queste cellule aumenta rispetto alla loro concentrazione basale.

Questo dato dimostra il ruolo modulatorio che hanno le MP nell’induzione di fattori pro-infiammatori. Nei miei esperimenti, invece, è stata osservata una riduzione nella sintesi di IL-8 e MCP-1 in cellule pretrattate con l’agonista PPAR- γ, Rosiglitazone, e successivamente incubate con MP. La riduzione osservata nella sintesi di queste due citochine è pari a circa il 50%. Nelle cellule pretrattate con l’agonista 15d-PGJ

prima di essere incubate con MP si è verificata una diminuzione dell’espressione di MCP-1 superiore al 50%. I risultati ottenuti mediante tecnica ELISA sono stati affiancati a indagini di biologia molecolare allo scopo di confermare che le variazioni di concentrazioni delle chemochine riflettono variazioni a livello trascrizionale.

Possiamo concludere che le MP mostrano un meccanismo d’azione NF-κB

dipendente; inoltre i recettori PPAR-γ attivati modulano l’azione pro-

infiammatoria delle MP probabilmente attraverso inibizione funzionale del

fattore di trascrizione NF-κB. I due agonisti dei recettori PPAR-γ

Rosiglitazone e 15d-PGJ

mostrano un ruolo inibitorio nei confronti

dell’infiammazione.