MATERIALI E METODI

MATERIALI E METODI MICROSPORUM CANIS ISOLAMENTO E IDENTIFICAZIONE

Per effettuare le prove in vitro sono stati selezionati 121 campioni positivi per dermatofitosi di cui 97 (86 gatti, 10 cani e 1 cavia) positivi per Microsporum canis.

L'isolamento delle colonie è stato effettuato seminando su terreno selettivo agar Mycobiotic®

(peptone 1; destrosio 1%, agar 1,5%, cicloeximide 0,04% e cloramfenicolo 0,005%) di pelo e altro materiale (scaglie, croste, unghie) prelevato direttamente dall'animale oppure tramite spazzola secondo la tecnica McKenzie. Le piastre sono state incubate a 25°C e controllate giornalmente per una settimana.

Il riconoscimento della colonia fungina è stato effettuato sia macroscopicamente valutando le caratteristiche di crescita, sia microscopicamente tramite la tecnica dello scotch-test: una piccola porzione di nastro adesivo viene appoggiata delicatamente sul micelio, trasferita su un vetrino porta oggetti e osservata al microscopio: il rinvenimento delle caratteristiche strutture (ife, macroconidi e microconidi) ha consentito di attribuire l'esatta identificazione di specie ad ogni isolato. M. canis inizia a svilupparsi verso il 3° o 4° giorno e acquisisce l'aspetto caratteristico dopo 7-10 giorni: disco cotonoso o lanoso con una parte centrale bianco crema, e margine periferico giallo limone brillante. Il verso appare giallo-arancione, tendente a scurirsi con il tempo; microscopicamente si osserva la presenza di ife settate; i numerosi macroconidi sono con parete spessa, echinulati, settati, con estremità ricurve (a rostro). I microconidi, lisci o clavati, originanti dalle ife, sono rari. Per ottenere la colonia in purezza e per allestire le prove sono stati effettuati dei passaggi su terreno PDA (Potato Dextrose Agar: 20% patate, 2% glucosio e 1,5% agar) più nutriente e capace di stimolare la sporulazione e preservare la produzione dei pigmenti (Robert, 2008) ed a 25°C per una settimana; quindisi è potuto procedere con l'allestimento delle prove in vitro.

PROVE IN VITRO I: OLI ESSENZIALI

È stata valutata l'attività fungistatica o fungicida efficacia di una serie di oli essenziali verso miceli di M. canis isolati da gatti.

Gli oli saggiati sono anice stellato (Illicium verum), basilico (Ocimum basilicum), bergamotto (Citrus bergamia), cannella (Cinnamomum zeylanicum), cedro (Citrus atlantica), elicriso (Helichrysum italicum), eucalipto (Eucalyptus globulus) finocchio dolce (Foeniculum vulgare); geranio (Pelargonium graveolens), incenso (Boswelia sacra), limone (Citrus lemon), litsea (Litsea cubeba); maggiorana (Origanum majorana); menta spicata (Mentha spicata), origano (Origanum vulgare), rosmarino (Rosmarinus officinalis), sandalo (Santalum album), santoreggia (Santureja montana) e timo serpillo (Thymus serpillum).

Gli oli essenziali sono poco idrosolubili, mentre molto solubili in alcool, etere, cloroformio e nei grassi, per questo motivo è stato utilizzato l’olio di mandorle dolci (Prunus dulcis Mill). Le diluizioni sono state allestite in agar malto semisolido (AMss: estratto di malto 3% e agar 0,3%); la

scelta di utilizzare un terreno semisolido è stata effettuata considerando il fatto che l’olio di mandorle e l’olio essenziale in esame tendono a separarsi in fasi rispetto al terreno liquido, rendendo più difficoltoso e meno preciso l’allestimento delle varie diluizioni; per questo è stato deciso di utilizzare una maggiore quantità di agar così da rendere più omogenea la sospensione delle componenti oleose nel terreno.

Inizialmente è stata allestita una soluzione madre degli oli essenziali al 10% in olio di mandorle dolci, dalla quale sono state poi allestite le varie diluizioni. L'olio di mandorle dolci è risultato un diluente inerte già in studi precedenti e anche nelle nostre prime prove usato nei pozzetti di controllo da solo con terreno AMss, in quanto non impedisce la crescita del micelio. Quindi, partendo dalla soluzione madre al 10%, sono state effettuate varie diluizioni nel terreno, comprese tra 10% e 0,001%. Per le prove sono state utilizzate Piastre per le colture cellulari sterili da 24 pozzetti, contenenti per ogni pozzetto 2 mL di liquido e l’inoculum del fungo. Ogni diluizione è stata eseguita in doppio; accanto a queste sono stati posti i controlli sia per il terreno che per l’olio di mandorle dolci: i pozzetti sono stati inoculati con l’isolato fungino, ottenuto sezionando la colonia con un bisturi, in modo da ottenere dei cubetti di circa 1mm di lato. La piastra è stata messa ad incubare a 25°C per 7 giorni, al termine dei quali è possibile leggere il risultato della prova, sulla base dello sviluppo o meno della colonia fungina nei pozzetti di controllo.

Successivamente per verificare il tipo di attività degli oli, gli isolati che apparentemente non sono cresciuti, sono stati riseminati su Mycobiotic agar® _{dopo essere stati lavati in soluzione fisiologica,}

in questo modo si è potuto procedere alla determinazione delle MIC (Minimum Inhibitory Concentration) e delle MFC (Minimum Fungicidal Concentration): la MIC è data dal pozzetto in non si osserva macroscopicamente la crescita del micelio, mentre la MFC è data dalla concentrazione a cui oltre a non crescere macroscopicamente nel pozzetto, una volta riseminata su terreno selettivo la colonia inoculata, questa non determina la formazione di un nuovo micelio, dimostrando che l'olio ha svolto un'azione fungicida.

Tale procedura è stata effettuata anche per testare i componenti (allegato I) degli oli saggiati. Con i dati raccolti in questa prima fase del lavoro sono state formulate una serie di miscele idroalcoliche con oli essenziali da poter utilizzare negli ambienti contaminati da artrospore di M. canis. Gli oli sono stati scelti in base alla loro attività in vitro su micelio: sono stati selezionati gli oli che hanno mostrato azione fungicida a concentrazioni inferiori al 3%(limite massimo di concentrazione della miscela idroalcolica affinché l’odore non provochi disagio né ai proprietari né agli animali); sono state formulate delle miscele idroalcoliche con alcol etilico a 95° al 9% contenenti massimo di 3-4 oli essenziali, tenendo conto anche della profumazione risultante, ma alla fine ne è stata selezionata una e testata in vitro sui miceli di M. canis e sulle artrospore presenti sui peli contaminati e infine in ambienti casalinghi frequentati da animali infetti; questa è costituita da litsea all'1%, anice, finocchio e geranio allo 0,5%.

A questo punto la miscela è stata testata sui miceli con la stessa tecnica usata per gli oli essenziali con l’unica differenza che la soluzione madre è stata allestita in alcol 95° e acqua invece che in olio

di mandorle dolci. La miscela idroalcolica è stata testata sia tal quale che diluita fino alla diluizione di 1:30 e sono stati trovati i valori di MIC e MFC per i singoli ceppi di M. canis anche per la miscela con la stessa procedura utilizzata precedentemente.

Per valutare la reale efficacia della miscela idroalcolica, questa è stata testata sulle artrospore, forme di resistenza ambientale che si trovano negli ambienti contaminati e sull'animale. Sono stati utilizzati i peli infetti di gatti affetti da microsporiasi ed è stato simulato il protocollo che poi sarebbe stato applicato negli ambienti: i peli sono stati nebulizzati con 200 μL della miscela a circa 10-15 cm di distanza, lasciati asciugare e posti in piastre Petri vuote. Tale trattamento è stato effettuato una volta al giorno per tre settimane consecutive. Per valutare la vitalità delle spore i peli sono stati seminati su pistre Petri con terreno selettivo agar Mycobiotic®_{, incubate a 25°C e}

controllate giornalmente il primo, il terzo, il quinto, quattordicesimo e ventunesimo giorno di trattamento.

PROVE IN VITRO II: ANTIMICOTICI CONVENZIONALI

Gli stessi ceppi utilizzati per le prove con gli oli essenziali sono stati testati con antimicotici di uso tradizionale in medicina umana e veterinaria: itraconazolo, griseofulvina, terbinafina, posaconazolo e voriconazolo seguendo il protocollo di microdiluizione consigliato dal CLSI nel documento M38A del 2002. Tutti i farmaci sono stati forniti dalla Sigma-Aldrich, Milano.

Inizialmente è stata preparata una soluzione stock a concentrazione 200 volte superiore quella di utilizzo sciogliendo dli antifungini in DMSO, poi sono state fatte diluizioni intermedie con DMSO e infine diluizioni 1:100 nel terreno agar malto semisolido per ottenere le concentrazioni da testare: per tutti i principi attivi il range testato è compreso tra 16 e 0,0156 mg/L. Quindi le piastre multipozzetto da 96 celle sono state inoculate con 100 μl di terreno agar malto semisolido addizionato con gli antifungini a diversa concentrazione e 100 μl di inoculum di spore fungine ottenuto raschiando delicatamente con un ansa la superficie miceliale delle colonie isolate in purezza su PDA dopo averle ricoperte di acqua distillata sterile. La soluzione ottenuta è stata omogeneizzata e poi sono state effettuate delle diluizioni seriali per ottenere una concentrazione di conidi pari a 0,4-5x104 _{ufc/mL tramite conta con camera contaglobuli di Thoma (Rodrigues Araújo}

Mota et al., 2009). Ogni determinazione è stata eseguita in triplicato.

Le piastre sono poi state messe in termostato a 25°C e le letture effettuate dopo 48 ore e poi ogni 24 ore fino al settimo giorno di incubazione; la MIC dell'isolato corrisponde alla concentrazione più bassa di antifungino in cui non si osserva crescita nel pozzetto.

PROVE AMBIENTALI

La miscela infine è stata testata in ambienti casalinghi infetti: inizialmente è stata valutata la carica fungina contaminante attraverso prelievi ambientali con contact plates, cioè piastre Petri in cui viene inserito terreno agar Mycobiotic® _{in quantità tale da ottenere una superficie convessa così da}

facilitare i prelievi permettendo il contatto del terreno di coltura sulle superfici; inoltre sono stati fatti anche prelievi delle spore presenti nell’aria tramite campionatore d’aria (Sas super-100, PBI International, Milano) che aspira volumi fissi di aria sulla contact plate con terreno selettivo posta sulla parte superiore dello strumento (Mancianti et al., 2003).

Le contact plates ottenute sono state incubate a 25°C per 7 giorni, al momento della lettura, se positive sono state contate le colonie di M. canis.

Ai proprietari sono state fornita la miscela ambientale di litsea all'1%, anice, finocchio e geranio allo 0,5% preparate in contenitori spray con pareti oscurate per proteggere gli oli fotosensibili dalla luce. Il protocollo standard prevede di nebulizzare le superfici più delicate che non possono essere trattate con i consueti prodotti come ipoclorito di sodio (ad esempio poltrone, tappeti, tende) per due volte al giorno, tutti i giorni per tre settimane consecutive. Quindici giorni dopo la fine del trattamento sono stati effettuati campionamenti di controllo nell’ambiente.

PROVE IN VIVO

Alla luce dei risultati ottenuti con le prove in vitro è stata allestita una miscela di oli essenziali da utilizzare a livello topico. Gli oli scelti sono il timo (Thymus serpillum), l'origano (Origanum vulgare) e il rosmarino (Rosmarinum officinalis) miscelati con olio di mandorle dolci (Prunus dulcis Mill.) così da ottenere una una miscela con 2% di timo e 5% di origano e rosmarino (Mugnaini et al., 2012). Lo scopo dello studio clinico è stato quello di valutare l’efficacia di un trattamento con una miscela di oli essenziali associata al trattamento convenzionale con itraconazolo (Itrafungol®_{Janssen-Cilag), rispetto al solo trattamento convenzionale, in gatti risultati}

positivi al M. canis all’esame colturale e sintomatici. Nello studio sono stati arruolati 19 gatti e sono stati divisi in due gruppi omogenei per età sesso e tipo di lesioni: il primo gruppo di controllo, in cui sono stati arruolati 9 gatti, ha ricevuto terapia convenzionale a cui è stato somministrato itraconazolo alla dose di 5 mg/kg/sid a settimane alterne per un totale di tre settimane di terapia e soluzione topica di econazolo (Amyco®_{shampoo, ATI) da utilizzare una o due volte a settimana; il}

secondo gruppo, in cui sono stati arruolati 10 gatti, ha ricevuto lo stesso trattamento sistemico con itraconazolo e la miscela a base di oli essenziali (M3) da applicare due volte al giorno per tutta la durata del trattamento sistemico.

Spazzole di controllo sono state eseguite sui gatti 15 giorni dopo l'inizio della terapia, 15 giorni dopo la fine e regolarmente una volta al mese per i tre mesi successivi la fine del trattamento e poi con cadenza annuale.

Per ogni soggetto è stata compilata una scheda clinica (allegato II), sulla quale sono stati annotati i dati anamnestici utili, i sintomi rilevati, il trattamento con i risultati di tutti i controlli, e il follow

up. I proprietari sono stati debitamente informati sui trattamenti proposti ed è stato fatto firmare loro il consenso informato (allegato III). I 19 gatti arruolati nello studio avevano un’età compresa tra 1 mese e 8 anni ed erano 7 maschi e 12 femmine. La maggior parte dei gatti presentava lesioni localizzate soprattutto su capo, contorno occhi, bocca e orecchie; seguivano, per frequenza, localizzazioni su zampe e tronco, mentre un solo gatto presentava segni di dermatite sulla coda. I sintomi riscontrati alla visita clinica sono stati: alopecia (12 casi), eritema (5 casi), forfora e scaglie (4 casi), prurito (2 casi), croste (5 casi), seborrea (1 caso).

MALASSEZIA PROVE IN VIVO

Malacalm® _{(Flora srl; Pisa) è un prodotto commerciale a base di oli essenziali utilizzato come}

adiuvante nel trattamento di varie patologie dermatologiche; in questo studio è stato proposto e valutato il suo impiego in monoterapia in cani affetti da dermatite da Malassezia spp.

Allo scopo sono stati selezionati 25 cani di varie razze e meticci, di entrambi i sessi (15 femmine e 10 maschi), di età compresa tra 1 e 12 anni con sintomi riferibili alla dermatite da Malassezia spp recidivanti, quindi soggetti che presentavano con vario grado di gravità alopecia, eritema localizzato o diffuso, forfora, prurito, pustole, odore rancido, papule e macule, lichenificazione e iperpigmentazione (Maynard et al., 2011).

Oltre ai segni clinici e ai dati anamnestici i criteri di inclusione nello studio sono stati la positività microscopica e colturale a Malassezia spp e che gli animali non ricevessero nessun trattamento da almeno 3-4 mesi.

Prima di iniziare la terapia ai proprietari è stato proposto un modulo di consenso informato da firmare per il trattamento (allegato III). È stato inoltre raccomandato al proprietario di non somministrare, durante la terapia, alcun tipo di soluzione topica diversa dalla miscela o farmaci ad uso sistemico che potessero influenzare l’evoluzione clinica.

Gli animali sono stati divisi in due gruppi: il primo (gruppo I) di 20 soggetti ha ricevuto la terapia col solo Malacalm®_{, il prodotto è stato direttamente applicato sulle aree interessate per due volte al}

giorno per un mese, mentre il secondo (gruppo II) di 5 soggetti è stato trattato con la terapia convenzionale con shampoo a base di miconazolo e clorexidina rispettivamente al 2% (Malaseb®₎

per due volte a settimana per una durata totale di trattamento di tre settimane.

Alla prima visita, cosi come alle visite di controllo, effettuate per tutti e due i gruppi dopo uno e tre mesi dalla sospensione della terapia, oltre alla valutazione clinica è stato effettuato un esame colturale e citologico per un riscontro di tipo sia qualitativo che quantitativo da tamponi prelevati da precise localizzazioni tipiche di Malassezia: rima buccale, orecchie, ascelle, inguine, spazi interdigitali anteriori e posteriori e spazi ungueali anteriori e posteriori. Tutto è stato registrato su un'apposita scheda clinica (allegato IV e allegato V).

Infine si è considerato migliorato il caso clinico che presentava un miglioramento delle lesioni alla visita post-trattamento pari al 50%; parzialmente migliorato quando i sintomi presenti alla visita post-trattamento erano circa il 10% di quelli presenti alla prima visita e irrisolto nei casi in cui non c'era stato miglioramento o era inferiore al 10%.

PROVE IN VITRO I: ISOLAMENTO E IDENTIFICAZIONE

Per ogni paziente arruolato nelle prove in vivo è stata valutata esclusivamente la risposta ai test di laboratorio, citologici e colturali, dei tamponi effettuati in: rima buccale, inguine, orecchie, ascelle, spazi interdigitali anteriori e posteriori e spazi ungueali anteriori e posteriori.

L’esame citologico ha permesso di poter stimare il numero di lieviti presenti prima e dopo il trattamento: per ogni tampone effettuato è stato fatto uno striscio sul vetrino e poi colorato con Diff Quick®_{, su 10 campi visivi del vetrino con un ingrandimento a 400x sono stati contati i lieviti di}

Malassezia e se queste superavano la media di 10 unità si considerava positivo per la diagnosi di dermatite da Malassezia.

Le Malassezie sono lieviti estremamente esigenti e difficili da coltivare e mantenere in vitro: necessitano di terreni ricchi di lipidi dove anche altri funghi e batteri possono trovare facile substrato di crescita comportandosi da contaminanti.

Per l'isolamento è stato utilizzato il terreno selettivo Dixon modificato (mDixon: estratto di malto 3.6%, peptone 0.6%, estratto di bile bovina 2%, Tween 40 1%, glicerolo 0.2%, acido oleico 0.2%, agar 1.2%) in cui il supplemento lipidico (acido oleico, Tween 40, lipidi contenuti nei sali biliari e glicerolo monostearato) è incorporato in forma di emulsione; tale terreno è ottimale per distinguere le varie specie su base morfologica.

M. pachydermatis non necessita, a differenza delle altre specie, di lipidi in aggiunta al terreno colturale come unica fonte energetica, ma il suo sviluppo è comunque stimolato dalla loro presenza (Blanco et al., 2000; Guého e Guillot, 1999); per tale specie possono quindi essere utilizzati i terreni di isolamento standard; nel presente studio è stato utilizzato agar Mycobiotic®._(soytone

10%, glucosio 10%, cloramfenicolo 0.05%, cicloeximide 0.4%, agar 15%).

La maggior parte delle specie di Malassezia è in grado di crescere a 37°C, tuttavia la temperatura raccomandata per non avere inibizione della crescita è compresa tra i 30-35°C; inoltre per ottenere una crescita ottimale è preferibile utilizzare terreno fresco e mantenere un'atmosfera umida così da evitare la disidratazione dello stesso: per questo motivo al momento dell'incubazione le piastre sono poste in contenitori di plastica.

Le colonie su mDixon dopo una settimana in termostato a 30°C appaiono opache, pallide, spesse, color crema, con superficie a cupola liscia; la tessitura è friabile e difficile da emulsionare vista la tendenza delle cellule a formare agglomerati compatti; microscopicamente le cellule sono di forma sferica o cilindrica, misurano da 2 a 7 micrometri di lunghezza. La riproduzione è asessuata per gemmazione unipolare a base larga, determinando la formazione di un colletto cicatriziale molto prominente sulla cellula madre che conferisce alla cellula il tipico aspetto ad arachide.

Le Malassezie sono state identificate morfologicamente e poi il riconoscimento è stato confermato tramite PCR-RFLP (Mirhendi et al., 2005) che consente di identificare 11 diverse specie: M. dermatis, M. furfur, M. globosa, M. japonica, M. nana, M. obtusa, M. pachydermatis, M. restricta, M. slooffiae, M. sympodialis e M. yamatoensis. L'estrazione del DNA è stata eseguita con il kit ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM_{(ZymoResearch, Euroclone) secondo le istruzione riportate, poi}

2 μl del DNA estratto è stato sottoposto ad amplificazione con 5 pmol di ciascun primer, forward (5'-TAA CAA GGA TTC CCC TAG TA-3') e reverse (5'-ATT ACG CCA GCA TCC TAA G-3') 20 μl di GoTaq®_{Colorless MasterMix (Promega) per un totale di 40 μl e sottoposti al seguente ciclo di}

45 secondi e 72°C per 1 minuto ed infine 7 minuti ulteriori di estensione finale così da amplificare il segmento 26S del rDNA; metà del prodotto di amplificazione è stato sottoposto a corsa elettroforetica in TAE buffer su gel di agarosio marcato con GelRedTM _{(Biotium, Società Italiana}

Chimici) all'1,5% a 100V per 30 minuti per verificare la presenza di DNA risultante in una banda di 580 bp e l'altra metà è stata suddivisa in due aliquote e digerita rispettivamente con 10U degli enzimi di restrizione CfoI e BstF51 (New England BioLabs, Euroclone) a 37°C per 3 ore e poi sottoposto a corsa elettroforetica su gel di agarosio all'2% a 100V per 60 minuti.

PROVE IN VITRO II: OLI ESSENZIALI

La valutazione in vitro è stata effettuata non solo per la conferma diagnostica, ma anche al fine di verificare l’efficacia in vitro del prodotto commerciale a base di oli essenziali Malacalm®_{, dei}

singoli oli essenziali costituenti il prodotto e dei componenti degli stessi oli essenziali; ottenendo la loro MIC con la tecnica delle microdiluizioni scalari, come descritto da Nascente et al, del 2009 e nel documento M27-A2 della National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS del 2002.

Oltre al Malacalm® _{in toto sono stati testati gli oli essenziali suoi componenti (allegato I): Citrus}

aurantium 1%, Lavandula officinalis 1%, Origanum vulgare 0,5%, Origanum majorana 0,5%, Mentha piperita 0,5% e Helichrysum italicum 0,5%; tutti oli provenienti da agricoltura biologica o biodinamica sempre forniti dalla Flora srl.

Di ogni olio è sempre stato utilizzato lo stesso numero di lotto in quanto vari fattori come il tipo genetico (ibridazioni), pedoclimatici (natura del terreno, esposizione al sole, piovosità, temperatura), momento balsamico, fattori agro-colturali, e alcuni fattori post-raccolta quali procedure di estrazione e conservazione possono far variare la composizione chimica: in questo modo è stata garantita la riproducibilità delle prove.

Per ogni olio sono stati testati 7 diversi isolati clinici di Malassezia che sono stati precedentemente identificati. A tale scopo sono stati effettuati una serie di passaggi seriali del lievito su mDixon per ottenere colonie isolate in purezza; successivamente è stato possibile preparare l’inoculum diluendo in fisiologica sterile le colonie fino a raggiungere un grado di torbidità corrispondente al grado 2 McFarland (1x106 _ufc/ml).

Sono state allestite soluzioni madri al 10% degli oli essenziali in terreno mDixon semisolido (0,6% di agar) e con queste sono state inoculate piastre multipozzetto da 96 celle così da ottenere concentrazioni variabili dal 10% allo 0,1%: 100 μl di mDixon semisolido miscelato all'olio alle diverse concentrazioni e 100 μl di inoculum; nei pozzetti di controllo sono stati immessi 100 μl di mDixon semisolido senza oli e 100 μl di inoculum; inoltre sono stati allestiti altre due serie di controlli, alle stesse diluizioni degli altri oli, con olio di mandorle dolci (Prunus dulcis Mill.) e olio di cocco (Cocos nucifera) che rientrano nella composizione del Malacalm® _{ma non interferiscono}

con la crescita di Malassezia. Tali prove sono state eseguite in triplicato.

impedire agli oli essenziali volatili di disperdersi, la piastra è stata messa in incubazione a 30°C; le letture delle piastre venivano effettuate dopo 48 ore e ogni 24 ore fino al settimo giorno di incubazione.

La lettura delle piastre è stata effettuata tramite stereomicroscopio ed è stata compilata al momento una semplice scheda seguendo dei parametri predefiniti, che denotano una crescita significativa o meno del lievito: i pozzetti in cui si formavano colonie ben evidenti, segno di una crescita incontrastata sono stati indicati con un “++”; in caso di una crescita moderata “+” e in caso di mancanza totale di colonie “-”: la MIC dell'isolato corrisponde alla concentrazione più bassa di antifungino in cui non si osserva crescita nel pozzetto. Una volta testati gli oli singolarmente, è stato preso in esame il Malacalm® _{in toto, allestendo una soluzione madre a doppia concentrazione}

rispetto a quella di utilizzo con i singoli oli a disposizione per poi diluirla agevolmente con l'inoculum.

Stessa procedura è stata effettuata per i principali componenti degli oli essenziali: α-pinene, β-pinene, carvacrolo, ρ-cimene, 1,8-cineolo, limonene, linalolo, mentofurano, mentolo, mentone, sabinene, γ-terpinene e timolo.Tutti questi principi sono statiforniti da Sigma-Aldrich, Milano. PROVE IN VITRO III: ANTIMICOTICI CONVENZIONALI

Gli stessi ceppi utilizzati per le prove con gli oli essenziali sono stati testati con antimicotici di uso tradizionale in medicina umana e veterinaria: ciclopirox olamina, terbinafina, chetoconazolo, clotrimazolo e miconazolo. Tutti i farmaci sono stati forniti dalla Sigma-Aldrich, Milano.

Inizialmente è stata preparata una soluzione stock a concentrazione 200 volte superiore quella di utilizzo sciogliendo dli antifungini in DMSO, poi sono state fatte diluizioni intermedie con DMSO e infine diluizioni 1:100 nel terreno mDixon semisolido per ottenere le concentrazioni da testare: per tutti i principi attivi il range testato è compreso tra 16 e 0,0156 mg/L. Quindi le piastre multipozzetto da 96 celle sono state inoculate con 100 μl di terreno mDixon semisolido addizionato con gli antifungini a diversa concentrazione e 100 μl di inoculum di colonie di Malassezia in fisiologica sterile con torbidità di 2 McFarland;ogni determinazione è stata eseguita in triplicato. Le piastre sono poi state messe in termostato a 30°C e le letture effettuate dopo 48 ore e poi ogni 24 ore fino al settimo giorno di incubazione; la MIC dell'isolato corrisponde alla concentrazione più bassa di antifungino in cui non si osserva crescita nel pozzetto.

ISOLAMENTO E IDENTIFICAZIONE

Sono stati prelevati 101 campioni fecali da cani sani residenti nelle regioni Toscana (72%), Calabria (25%) e Puglia (4%) e 50 campioni fecali di psittaci appartenenti a diverse specie (Amazona, Agapornis, Pionites, Poicephalus) tutti provenienti da allevamenti amatoriali in Toscana. La raccolta è stata affiancata da un'indagine concernente le condizioni di vita degli animali, in particolare è stato proposto ai proprietari un questionario al fine di conoscere l'ambiente di provenienza, il contatto con altri animali, eventuali patologie concomitanti e il tipo di alimentazione (allegato VI).

I campioni sono stati posti in contenitori di plastica sterili, debitamente contrassegnati e conservati a 4°C per un periodo non superiore alle 48 ore prima di essere processati.

Da ciascun campione è stata prelevata una quantità di circa 2 gr di feci la quale è stata stemperata con 2 ml di soluzione di gentamicina al 10% sterile, al fine di ridurre la carica microbica delle feci. La sospensione così ottenuta è stata seminata con l'ausilio di anse sterili in piastre Petri contenenti terreno agar malto a cui è stato aggiunto difenile al 10%, per limitare la crescita di funghi filamentosi: le piastre sono state incubate a 25°C e valutate giornalmente per una settimana.

Una volta cresciute le colonie di lievito sono state seminate più volte su agar malto difenile così da ottenere isolati in purezza e poterle poi trasferire su semplice agar malto per poi procedere con i test di identificazione.

Innanzitutto è stato effettuato un semplice esame morfologico prendendo con un ansa un piccolo quantitativo dalla colonia e stemperandolo su un vetrino porta-oggetto con una goccia di fisiologica e osservandolo al microscopio a 100x; sia per confermare l'effettiva natura della colonia stessa ed apprezzarne i caratteri distintivi peculiari.

I lieviti isolati sono stati identificati mediante l'impiego del sistema ID32C® _{(BioMèrieux), sistema}

che, attraverso il rilevamento dei carboidrati metabolizzati da tali microrganismi, permette il riconoscimento di genere e specie.

Il sistema è costituito da una galleria composta da 32 cupole, ognuna delle quali contiene un carboidrato disidratato: sorbitolo, D-xilosio, ribosio, glicerolo, ramnosio, palatinosio, eritritolo, melibiosio, glucoronato, melezitosio, gluconato, levulinato, glucosio, sorbosio, glucosamina, esculina, galattosio, actidione, saccrosio, N-acetil-glucosamina, DL-lattato, L-arabinosio, cellobiosio, raffinosio, maltosio, trealosio, 2-cheto.gluconato, α-metil-D-glucoside, mannitolo, lattosio e inositolo. Il protocollo prevede l'utilizzo di colonie di lievito pure seminate 48 ore prima dell'allestimento della prova: ciascun campione in esame è stato posto in acqua distillata sterile o soluzione fisiologica così da ottenere una sospensione con un grado di torbidità pari a 2 McFarland; 250 µl di tale soluzione sono stati inoculati in una fiala di terreno semi-solido (API C Medium) e 135 µl della sospensione ottenuta sono stati dispensati in ciascuna cupola del sistema. Le gallerie così allestite sono state accuratamente rivestite con carta d'alluminio per impedire l'evaporazione della sospensione ed incubate a 30°C per 48 ore.

di controllo e le cupole contenenti i substrati, considerando positive le cupole in cui si rilevava un aumentata torbidità. Ad ogni reazione positiva è stato assegnato un punteggio riportato su apposite schede di lettura, fino ad ottenere un codice numerico che interpretato tramite il manuale di riferimento corrisponde ad un determinato lievito.

I risultati ottenuti sono stati comunque confermati con tecniche molecolari (PCR, PCR-RFLP e sequenziamento) in collaborazione con l’Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie. Per quanto riguarda il riconoscimento delle sei principali specie di Candida (C. albicans, C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei, C. parapsilosis e C. tropicalis), importanti anche da un punto di vista medico in medicina umana, è stato applicato il protocollo di PCR-RFLP descritto da Mirhendi et al., 2006 che prevede l'amplificazione della regione ITS1-5.8S-ITS2 del rRNA fungino con i primer universali ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3') e ITS4 (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3') e la digestione del prodotto di amplificazione con l'enzima di restrizione MspI. Praticamente i lieviti identificati come una delle sei specie di Candida sopra riportate con la metodica dell'auxanogramma sono state nuovamente seminate su agar malto, poste a 25°C e dopo 48 ore di incubazione è stato estratto il DNA con il kit ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM_{(ZymoResearch, Euroclone) secondo le istruzione riportate, poi 1μl del DNA estratto è}

stato sottoposto ad amplificazione con 2 pmol di ciascun primer, 10 μl di GoTaq®_Colorless

MasterMix (Promega) per un totale di 20 μl e sottoposti al seguente ciclo di amplificazione: 5 minuti a 94°C di denaturazione iniziale, 25 cicli a 94°C per 30 secondi, 56°C per 45 secondi e 72°C per 1 minuto ed infine 7 minuti ulteriori di estensione finale; metà del prodotto di amplificazione è stato sottoposto a corsa elettroforetica in TAE buffer su gel di agarosio marcato con GelRedTM

(Biotium, Società Italiana Chimici) all'1,5% a 100V per 30 minuti per verificare la presenza di DNA e l'altra metà digerita con 10U di enzima MspI (New England BioLabs, Euroclone) a 37°C per 2 ore e poi sottoposto a corsa elettroforetica su gel di agarosio all'1,8% a 100V per 45 minuti. Le C. albicans identificate sono state ulteriormente sottoposte ad ulteriore protocollo di PCR per la differenziazione tra C. albicans, C. africana e C. dubliniensis usando il gene hwp1 come riportato in due lavori di Romeo et al del 2006 e di Romeo e Criseo del 2008: 3 μl del DNA estratto è stato sottoposto ad amplificazione con 10 pmol di ciascun primer CR-f (5'-GCT ACC ACT TCA GAA TCA TCA TC-3') e CR-r (5'-GCA CCT TCA GTC GTA GAG ACG-3'), 10 μl di GoTaq®_Colorless

MasterMix (Promega) per un totale di 20 μl e sottoposti al seguente ciclo di amplificazione: 5 minuti a 95°C di denaturazione iniziale, 30 cicli a 94°C per 45 secondi, 58°C per 40 secondi e 72°C per 55 secondi ed infine 10 minuti ulteriori di estensione finale; il prodotto di amplificazione è stato sottoposto a corsa elettroforetica in TAE buffer su gel di agarosio marcato con GelRedTM _(Biotium,

Società Italiana Chimici) all'1,5% a 100V per 30 minuti; approssimativamente C. albicans produce una banda di 941 bp, C. africana di 700bp e C. dubliniensis di 569 bp.

TEST DI SENSIBILITÀ AGLI ANTIMICOTICI

Una volta identificati i ceppi considerati patogeni o patogeni emergenti in medicina umana, sono state eseguite prove di sensibilità in vitro a 7 diversi antimicotici:















La valutazione della suscettibilità è stata effettuata attraverso l'Etest® _{(BioMèrieux), un metodo}

quantitativo per la determinazione della MIC quale strumento per valutare la sensibilità/resistenza dei microrganismi nei confronti di ogni singolo farmaco testato.

Il sistema consta di sottili strisce non porose, costituite in materiale plastico, che da un lato riportano la scala di lettura espressa in µg/mL sul retro contengono un gradiente predefinito e continuo di 15 diluizioni dell'agente antifungino, corrispondenti ai valori della scala. L'impiego dell'Etest® _{prevede la preparazione di un apposito terreno agarizzato RPMI 1640 con glutammina e}

supplementato con il 2% di glucosio, MOPS [3-(N-morpholino) propanesulfonic acid] alla concentrazione di 0,165 mol/L e 1,5% di agar a pH 7 allestito su piastre di Petri. L'inoculum è stato ottenuto da colonie pure seminate 48 ore prima dell'esecuzione del test sospese in soluzione fisiologica sterile in quantità tale da ottenere una torbidità di 1 McFarland per i lieviti mucillaginosi e 0,5 McFarland standard per gli altri. La sospensione così ottenuta è stata uniformemente distribuita sull'intera superficie della piastra attraverso l'impiego di un tampone sterile precedentemente imbevuto nella sospensione, ponendo attenzione ad eliminare l'eccesso di liquido. Dopo aver atteso il completo assorbimento del liquido, le strisce contenenti l'antimicotico specifico sono state deposte in superficie e le piastre così preparate sono state incubate a 30°C e la lettura dei risultati è stata effettuata dopo 48-72h per i lieviti mucoidi e dopo 24-48h per gli altri.

Per l'amfotericina B è stato considerato il valore della MIC nel punto corrispondente alla colonia più prossima alla striscia a partire dalla quale l'ellisse di inibizione appariva perfettamete limpido (100% di inibizione). Per il anidulafungina, micafungina, fluconazolo, il voriconazolo, il posaconazolo e la caspofungina è stato invece considerato il valore della MIC nel punto in cui il margine dell'ellisse di inibizione intersecava la striscia, corrispondente all'80% di inibizione. Tali linee guida interpretative sono approvate nel documento M27-A della National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS del 1997.

ASPERGILLI ISOLAMENTO E IDENTIFICAZIONE

Per l'isolamento degli aspergilli sono stati eseguiti 65 campionamenti ambientali in diverse aziende agricole e allevamenti delle provincie di Pisa, Livorno Siena, Pistoia e Siracusa.

I vari substrati (terreno, residui organici, mangimi e lettiere) sono stati posti in provette falcon sterili da 50 ml e processati entro 24 ore dal prelievo. I siti di prelievo sono stati selezionati allo scopo di cercare eventuali correlazioni con la gestione agronomica delle aziende locali e l'eventuale presenza di ceppi di aspergilli resistenti agli azoli. Allo scopo veniva compilata una scheda che teneva conto del tipo di coltivazione effettuata e di eventuali trattamenti anticrittogamici e dei principi impiegati (tabella 24 e tabella 25).

Altri campioni sono stati prelevati da 22 isolati clinici recuperati al CRUMA (Centro Recupero Uccelli Marini e Acquatici) di Livorno: in particolare in sede autoptica sono stati eseguiti dei campionamenti con tamponi sterili imbevuti di soluzione antibiotica con gentamicina al 10% da sacchi aerei, trachea e cloaca di un beccapesci (Thalasseus sandvicensis), un pappagallo cenerino (Psittacus erithacus) e 20 gabbiani zampegialle (Larus cachinnans michahellis), (tabella X). Tutti i volatili esaminati mostravano segni clinici compatibili con aspergillosi.

I campioni ambientali sono stati processati secondo la tecnica MARIEA (Medium Antifungal Resistence Itraconazole Enviromental Aspergillus): due grammi del materiale in esame sono stati disciolti in 8 ml di acqua distillata contenente l'1% di Tween20 e 0,05% di cloramfenicolo; il tutto è stato fatto riposare per 60 minuti e 100 μl del surnatatnte ottenuto è stato inoculato in quattro piastre Petri: due contenenti agar Sabouraud addizionato a 0,05% di cloramfenicolo 0,0004% di itraconazolo, le altre due della stessa composizione, ma priva di itraconazolo. Le piastre cosi preparate sono state contrassegnate come piastre “ITZ+” e piastre “ITZ-”. Dopo la semina ogni coppia di piastre ITZ+ e ITZ- è stata posta ad incubare a 37°C e a 42°C per valutare la termotolleranza dell’isolato.

Per quanto riguarda i campioni clinici, i tamponi sono stati seminati su piastre Petri con lo stesso terreno subito dopo il prelievo.

Il tempo di incubazione in entrambi i casi è stato fissato in 48 ore; le letture delle piastre sono state eseguite ogni 24 ore dalla semina.

Le colonie cresciute sono state identificate come appartenenti al genere Aspergillus sulla base delle caratteristiche macroscopiche e microscopiche. L’identificazione a livello di specie e stata effettuata su base fenotipica, utilizzando le chiavi fornite da Raper e Fennel, 1965, seminando i funghi su terreno Czapeck e mettendo le piastre in incubazione a 25°C. Il terreno Czapeck è un substrato selettivo artificiale costituito da 3% di saccarosio, 0,3% di sodio nitrato, 0,1% di fosfato dipotassico, 0,05% di magnesio solfato, 0,05% di cloruro di potassio, 0,001% di solfato ferroso e 1,5% di agar; il pH finale è di 7,3.

TEST DI SENSIBILITÀ AGLI ANTIMICOTICI

Gli isolati così ottenuti sono stati utilizzati per le prove di sensibilità in vitro effettuate secondo la metodica EUCAST per la determinazione in vitro delle MIC per i funghi filamentosi (Rodriguez-Tudela et al., 2008).

Le colonie pure sono state seminate su piastre Petri con terreno PDA (Potato Dextrose Agar) così da favorire la sporulazione e poste ad incubare a 25°C; dopo 48 ore, a crescita avvenuta, le colonie sono state coperte con 5 ml di acqua sterile contenente lo 0,1% di Tween20, la superficie del micelio è stata delicatamente grattata con un'ansa così da liberare i conidi. La sospensione così ottenuta è stata omogeneizzata con il vortex a 2000 rpm e sono state effettuate delle diluizioni seriali per ottenere una concentrazione di conidi pari a 2-5x106 _{ufc/mL tramite conta con camera}

contaglobuli di Thoma (Aberkane et al., 2002; Rodriguez-Tudela et al., 2003).

La sospensione è stata poi diluita 1:10 per ottenere l'inoculum di 2-5x105 _{ufc/mL da utilizzare per}

le prove di sensibilità agli azoli.

Tali prove sono state allestite seguendo la metodica delle microdiluizioni scalari in piastre multipozzetto da 96 celle, descritta sempre nel protocollo EUCAST E.DEF 9.1: come medium è stato utilizzato il brodo di coltura RPMI 1640 con glutammina e supplementato con il 2% di glucosio e MOPS [3-(N-morpholino) propanesulfonic acid] alla concentrazione di 0,165 mol/L a pH 7.

Infine sono state preparate le soluzioni con gli antifungini itraconazolo, posaconazolo e voriconazolo; tutti sono stati forniti dalla Sigma-Aldrich, Milano.

Inizialmente è stata preparata una soluzione stock a concentrazione 200 volte superiore quella di utilizzo sciogliendo dli antifungini in DMSO, poi sono state fatte diluizioni intermedie con DMSO e infine diluizioni 1:100 nel terreno RPMI 1640 per ottenere le concentrazioni da testare: per tutti e tre gli azoli il range è compreso tra 8 e 0,0156 mg/L.

Quindi le piastre multipozzetto sono state inoculate con 100 μl di terreno RPMI 1640 addizionato con gli antifungini a diversa concentrazione e 100 μl di inoculum di spore fungine precedentemente preparato e messe ad incubare a 25°C per 48 ore.

Ogni determinazione è stata eseguita in triplo.

La lettura dei pozzetti è stata effettuata avvalendosi di uno stereomicroscopio e la valutazione delle MIC seguendo le indicazioni dell'EUCAST, Thecnical Note on the method for the determination of broth dilution MICs (Rodriguez-Tudela et al., 2008): la MIC dell'isolato corrisponde alla concentrazione più bassa di antifungino in cui non si osserva crescita nel pozzetto.