PROTEINE RESPIRATORIE DEI VERTEBRATI EMOGLOBINA E MIOGLOBINA

PROTEINE RESPIRATORIE DEI VERTEBRATI EMOGLOBINA E MIOGLOBINA

Legano reversibilmente l’OSSIGENO.

L’emoglobina (tetramerica) è presente negli eritrociti, e trasporta ossigeno nel sangue La mioglobina (monomerica) è

presente nelle cellule muscolari.

Aumenta la solubilità dell’ossigeno nel plasma, da 3ml/L a 220 ml/L.

Essenziale per la loro funzione è il legame con un gruppo prostetico: Il gruppo EME in cui è presente lo ione ferroso Fe²⁺ che funziona da sito di legame per l’O₂

La mioglobina e l’emoglobina sono

proteine

coniugate: legano a se un gruppo

PROSTETICO

GRUPPO EME

4 anelli pirrolici uniti da ponti metilenici

(protoporfirina IX), struttura coniugata e planare che coordina il FERRO nello stato ferroso - Fe(II) (Fe

)-

Esso è coordinato dai 4

atomi di azoto dell’anello

tetrapirrolico

MIOGLOBINA EMOGLOBINA

1 CATENA POLIPEPTIDICA (GLOBINA)

+ 1 EME

4 CATENE POLIPEPTIDICHE (GLOBINE)

+ 1 EME PER CIASCUNA (4) SOLO STRUTTURA TERZIARIA STRUTTURA TERZIARIA

+ QUATERNARIA

5 | 4 Nelson • Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2014

Il gruppo EME è alloggiato in una «tasca», formata dal ripiegamento della catena polipeptidica (globinica), in cui si affacciano diversi residui amminoacidici idrofobici (Val, Leu, Iso, Phe, Met) che interagiscono con l’anello tetrapirrolico dell’EME e lo mantengono in sede.

interazioni idrofobiche, contatti di van der Waals e legami H

Nella tasca idrofobica è impedito l’ingresso

all’H₂O e il Fe²⁺ è protetto dall’ossidazione

irreversibile.

Istidina prossimale His93 (His F8)

Piano dell’anello porfirinico

Lo ione Fe²⁺ è coordinato dai 4 atomi di azoto dell’anello tetrapirrolico, e forma altri 2 legami di coordinazione: 1 con l’ossigeno molecolare (O₂) e 1 con l’istidina prossimale (His93; His F8)

Elica F della Catena globinica,

Lo ione ferroso Fe

può legare O

J. M. Berg et al. BIOCHIMICA 7/E Zanichelli editore S.p.a Copyright © 2012

L’interazione tra Ferro e Ossigeno è descritta dalla combinazione di 2 strutture di risonanza

Lo ione ferrico Fe

non può legare O

La Mb o l’Hb SI OSSIDANO

(Meta-Mb o Meta-Hb)

La struttura della Mb o delle catene globiniche di Hb sono fatte in modo da proteggere il ferro dall’ossidazione, ed evitare la

formazione di ioni superossido

La tasca dell’EME è idrofobica e quindi è impedito l’ingresso di acqua

Esiste un sistema anti-ossidante che rimuove le specie reattive dell’ossigeno (ROS) basato sull’attività del glutatione.

Nella tasca dell’EME esiste un secondo residuo di ISTIDINA

chiamato DISTALE che interagisce con l’ossigeno e indebolisce

il legame fra ossigeno e ferro

Mioglobina: 1 catena globinica composta da 8 α-eliche (indicate con le lettere da A a H) unite da segmenti di interconnessione (anse e curve)

His-93 (F8) prossimale

His-64 (E7) distale

His prossimale

His distale

Phe Val

Val-68 e Phe-43 aiutano a mantenere

l’EME in posizione

La formazione e il rilascio dell’anione superossido è impedito da un

fra l’O

e l’Istidina DISTALE (His64, E7).

Questo legame impedisce

anche l’ossidazione dello ione Fe

a Fe

Il legame H fra O

e His-64

(distale) assicura che

l’interazione O

/Fe

sia

dell’eme per il suo ligando

La tasca dell’EME può accogliere anche altre piccole molecole, come per es. il MONOSSIDO DI CARBONIO (CΞO)

Il monossido di carbonio blocca i siti di legame per l’ossigeno nell’Hb e nella Mb, rendendole non-funzionali.

Si blocca la respirazione per intossicazione da CO.

Il legame è molto forte ma reversibile,

il CΞO può essere rilasciato in condizioni di alte pressioni di O

(camera iperbarica)

il CΞO lega il Fe

dell’EME con un’affinità molto maggiore

rispetto all’O

(CO e Fe

sono perfettamente allineati).

Mioglobina: 1 catena globinica composta da 8 α-eliche (indicate con le lettere da A a H) unite da segmenti di interconnessione (anse e curve)

 La Mb ha un solo gruppo EME, può legare 1 molecola di O

.

 Si forma un complesso MbO

secondo un rapporto di 1:1.

 Il legame fra Mb e O

è reversibile ed è regolato

secondo un equilibrio da una costante di dissociazione:

Mb + O

MbO

Mb + O

MbO

K_diss

La concentrazione di proteina ossigenata (legata all’ossigeno, MbO₂) rispetto alla concentrazione totale di Mb (Mb + MbO₂), varia al variare della Kdiss e della concentrazione di ossigeno (ligando) fornito alla proteina. Questo rapporto è chiamato FRAZIONE DI SATURAZIONE DELLA Mb (si esprime in % o in frazione)

Mb + O

MbO

Mb + O

MbO

K_diss

[Mb] [O₂ ] K_diss =

[MbO₂] [Mb] [O₂ ] K_diss =

[MbO₂]

[MbO

]

Y = [MbO

] + [Mb]

[MbO

]

Y = [MbO

] + [Mb]

2) dall’affinità che la proteina ha per il suo ligando, cioè dalla costante di

dissociazione (K_diss) del complesso MbO₂

LA FRAZIONE DI SATURAZIONE DIPENDE DA:

1) dalla concentrazione del ligando [O₂] che si esprime come pO₂

Se la Kdiss è piccola l’affinità proteina per il suo ligando (O₂) è elevata Se la Kdiss è grande l’affinità della proteina per l’O₂ è bassa

Il valore della K

corrisponde al valore di pO

che consente di saturare la Mb al 50% (Y = 0.5).

La frazione di saturazione Y, la concentrazione di O

, e la K

sono legate da una relazione matematica:

Y = K

+ Y = K

+

pO

Y = K

+ pO

Y = K

+

Y = K

+ pO

Y = K

+ pO

[O₂] = pO₂ (pressione parziale di ossigeno)

[O₂] K_diss + [O₂] Y =

Il valore della K

si ricava sperimentalmente

utilizzando il grafico di ossigenazione della Mb.

Y

La CURVA di LEGAME o di OSSIGENAZIONE IPERBOLICA della Mb si OTTIENE MISURANDO la FRAZIONE di SATURAZIONE (Y) della Mb a

DIVERSI VALORI di pO₂

[MbO₂] Y = [MbO₂] + [Mb]

[MbO₂] Y = [MbO₂] + [Mb]

Pressione parziale di O₂

Tutti i siti di legame della Mb sono

OCCUPATI

Tutti i siti di legame della Mb sono

LIBERI

4

O₂ O₂ O₂

O₂ Kdiss

Y

la Mb rilascia EFFICACEMENTE l’ossigeno che aveva

legato.

Fase di

deossigenazione

minore consumo di O₂: la pO₂ intracellulare è in equilibrio con quella del sangue capillare (30 mmHg)

La Kdiss della mioglobina ha un valore di ~ 4 mmHg, la sua affinità per l’O

è molto elevate.

DEVE ESTRARRE O

DAL SANGUE E ACCUMULARLO NEL TESSUTO MUSCOLARE

Nelle cellule muscolari metabolicamente

attive:

si consuma O₂: la pO₂ cellulare diminuisce

< 10 mmHg

Nelle cellule muscolari a riposo:

Mb è quasi satura:

accumula O₂

Fase di ossigenazione

pO₂ nei capillari

~ 30 mmHg

Kdiss

Emoglobina (Hb): tetramero

(le globine si associano formando due copie di dimeri αβ (α₁β₁ e α₂β₂) che si associano a formare un

tetramero attraverso interazioni idrofobiche, legami H e ponti salini.

Le interazioni si formano

nell’interfaccia α₁β₁ e α₂β₂ e α₁β₂ e α₂β₁

Ogni globina ha una tasca in cui lega un gruppo EME,

quindi l’Hb può legare e trasportare 4 molecole di O

2 catene globiniche α (7 α-eliche) e

2 catene globiniche β (8 α-eliche)

Il grado di ossigenazione della Hb dipende dalla pO

e dalla K

del complesso Hb(O

)

.

Frazione di saturazione: % di Hb ossigenata (di siti EME occupati dall’O₂) rispetto all’Hb

totale

Hb + 4[O

] Hb[O

]

Hb + 4[O

] Hb[O

]

[Hb(O

)

] Y =

[Hb(O

)

] + [Hb]

[Hb(O

)

] Y =

[Hb(O

)

] + [Hb]

[Hb(O

)

] Y =

[Hb(O

)

] + [Hb]

La Frazione di saturazione è legata alla pO₂ e

alla K_diss secondo la seguente relazione:

pO

Y =

K

+ pO

pO

Y =

K

+ pO

pO

Y =

K

+ pO

Sperimentalmente:

il valore della K

= (valore della pO

che consente di

raggiungere il 50% di saturazione dell’Hb) n

“n” o n

= Coefficiente di Hill = indica il grado di cooperatività dei siti di legame per l’O

.

Se l’Hb avesse n

avviene contemporaneamente in tutti i siti, e tutte le molecole di Hb sono o

completamente legate o completamente dissociate.

QUESTO NON AVVIENE.

Cos’è n?

• Per la Mb n = 1 (NON COOPERATIVA)

• Per l’Hb n > 1 ma MAI uguale al numero dei siti per l’O₂,

• Le diverse emoproteine (per es. le diverse varianti di Hb prodotte a causa di mutazioni) possono avere un grado di cooperatività (n_H) differente

pO

Y =

K

+ pO

pO

Y =

K

+ pO

pO

Y =

K

+ pO

In condizioni fisiologiche n

dell’Hb è ~ 3

1< n

<N° siti >> la proteina è Cooperativa e grazie alla cooperatività positiva dei siti di legame subisce una transizione fra stato a bassa affinità (T) e stato ad alta affinità (R).

Ciò vuol dire che, in uno stesso momento, avremmo una miscela di molecole di Hb completamente ossigenate, altre non ossigenate e altre parzialmente ossigenate.

n

= 1 >> Non cooperativa (Mioglobina) n

< 0 >> Cooperatività negativa

I siti di legame per l’O2 dell’Hb (cioè i gruppi EME) sono tra di loro cooperativi perché lo stato di ossigenazione di un sito può essere

comunicato agli altri siti attraverso un cambiamento della

struttura dell’Hb.

1,00

0.75

0.50

0.25

0.0

Y

20,0 40,0 60,0 80,0

pO

(mmHg)

Graficamente la relazione esistente fra Y e pO₂ è rappresentato da una CURVA DI OSSIGENAZIONE SIGMOIDALE, infatti il legame Hb/O₂ è di tipo COOPERATIVO.

a) L’AFFINITA’ DELL’Hb PER L’OSSIGENO AUMENTA MANO A MANO CHE LE MOLECOLE DI O₂ OCCUPANO I GRUPPI EME.

b) Il legame di 1 molecola di O₂ ad un gruppo EME facilita il legame di altre molecole di O₂ agli altri gruppi EME

Kdiss ~ (26 mmHg)ⁿ , valore di pO₂che satura il 50% dei siti di legame dell’Hb

STATO R

Hb a bassa affinità, poco ossigenata

STATO T

Hb semisatura, con minime variazioni di pO₂ si deossigena e si ossigena quasi completamente

Hb ad alta affinità, raggiunge la saturazione

Qual’è il vantaggio per un organismo vivente nel possedere una proteina respiratoria che lega l’O₂ in modo cooperativo?

Hb

rilascia e lega

efficientemente l’ossigeno

Mb Hb

1,00

0.75

0.50

0.25

0.0

Y

pO

(mmHg)

20,0 40,0 60,0 80,0 100,0

pO₂ presente nei capillari tissutali

pO₂ presente nei capillari polmonari

La transizione fra stato T e stato R è possibile perché Hb è una proteina ALLOSTERICA e l’O

è il suo effettore allosterico omotropico

La transizione fra stato T e stato R è possibile perché quando l’Hb si ossigena cambia struttura in funzione del legame con le molecole del suo ligando (O

) e quindi della

sua concentrazione (pO

).

1) Ha più siti di legame per il suo ligando

2) Il ligando è un effettore omoallosterico: occupando uno dei siti di legame della proteina influisce sull’affinità degli altri siti liberi 3) Il legame proteina/ligando causa sempre una modificazione della

struttura 3

e anche della struttura 4

della proteina che modifica la sua affinità nei confronti del ligando stesso.

4) Ha siti di legame per altri ligandi che agiscono come molecole regolatrici (effettori eteroallosterici) che influenzano l’affinità

della proteina verso il suo ligando

5) La modulazione e il legame proteina/effettori è sempre

REVERSIBILE

α₁

β¹ α² β² STATO T

Hb a bassa affinità

+ O

Legame con la molecola di O₂ >>

cambia la struttura 3

CON LA PARZIALE OSSIGENAZIONE (almeno un sito occupato dall’O₂ in ciascuno dei 2 dimeri αβ) l’intera proteina modifica la sua struttura 4^aria assumendo una struttura piu’ disponibile ad accettare altre molecole di O₂.

α₁

β¹ α² β²

α₁

β¹ α² β²

α₁

β¹ α² β²

α₁

β¹ α² β² α₁

β¹ α² β²

α₁

β¹ α² β²

α₁

β¹ α² β²

+ O

+ O

α₁

β¹ α² β²

+ O

α₁

β¹ α² β²

STATO R ALTA AFFINITA’

La Transizione idealmente si completa: quando sono occupati gli ultimi siti e tutte le molecole di

Hb sono nella forma ad alta affinità

α₁

β¹ α² β²

α₁

β¹ α² β² α₁

β¹ α² β²