INDICE
ABBREVIAZIONI
...IRIASSUNTO
... IIIABSTRACT
...VIINTRODUZIONE
CAPITOLO 1: DRUG METABOLISM ... 11.1 La biotrasformazione degli xenobiotici ... 1
1.2 Enzimi di Fase I: Il Sistema Citocromo P450... 2
1.2.1 Proprietà e struttura del citocromo P450 ... 2
1.2.2 La reazione monoossigenasica ... 8
1.2.3 Nomenclatura del citocromo P450 ... 10
1.2.4 Evoluzione del citocromo P450... 11
1.3 Enzimi di Fase II: Glutatione S-Transferasi ... 15
1.4 Enzimi Antiossidanti... 16
1.4.1 Lo stress ossidativo... 16
1.4.2 Radicali Liberi e specie Pro-Radicali ... 18
1.4.3 Enzimi ad azione antiossidante... 20
CAPITOLO 2: REGOLAZIONE TRAMITE RECETTORI NUCLEARI ... 24
2.1 Introduzione ... 24
2.2 I recettori nucleari... 25
2.2.1 PXR ... 26
2.2.2 CAR ... 31
2.3 “Cross-talk” fra i recettori nucleari... 35
CAPITOLO 3: RUOLO ENDOGENO DEL CITOCROMO P450 ... 37
CAPITOLO 4:
CITOCROMI P450 E METABOLISMO NEL SUINO ... 41
4.1 Introduzione ... 41
4.2 Presenza dei P450 nel suino... 43
CAPITOLO 5: CITOCROMI P450 ED ENZIMI ANTIOSSIDANTI NEL CERVELLO 5.1 Aspetti generali ... 49
5.2 P450 cerebrali e substrati endogeni ... 53
5.3 P450 cerebrali e substrati esogeni... 55
5.4 P450 2B... 56
5.5 P450 3A ... 58
5.6 P450 2J... 60
5.7 GST ed enzimi antiossidanti ... 61
CAPITOLO 6: CENNI ANATOMICI SUL SNC NEI MAMMIFERI... 64
6.1 Corteccia cerebrale ... 65 6.2 Mesencefalo ... 65 6.3 Ippocampo ... 66 6.4 Cervelletto ... 66 6.5 Meningi... 67 6.6 Barriera emato-encefalica ... 67
PARTE SPERIMENTALE
MATERIALI E METODI ... 72 1. Prodotti utilizzati ... 72 2. Modello sperimentale ... 72 2.1 Animali ... 72 2.2 Trattamento... 723. Isolamento dei capillari dalla corteccia cerebrale di suino... 73
4.1 Preparazione delle frazioni microsomiale e citosolica dal fegato.... 74
4.2 Preparazione delle frazioni microsomiali e mitocondriali dai comparti cerebrali ... 74
4.3 Determinazione del contenuto proteico ... 76
4.4 Determinazione del contenuto di citocromo P450 ... 76
5. Saggi di attività enzimatica ... 77
5.1 Benzilossichinolina debenzilasi (BQD) ... 77
5.2 Antraldeide ossidasi (AhOx)... 77
5.3 Testosterone idrossilasi ... 78
5.4 Glutatione S-transferasi (GST) ... 80
5.5 Catalasi (CAT) ... 80
5.6 Superossido dismutasi (SOD) ... 80
5.7 Glutatione reduttasi (GSSG-Red) ... 80
5.8 Glutatione perossidasi (GSH-Perox)... 81
6. Elettroforesi su gel di poliacrilammide e western blotting... 81
7. Estrazione dell’RNA e preparazione del cDNA... 82
7.1 Estrazione dell’RNA ... 82 7.2 Controllo dell’RNA... 84 7.3 RT-PCR (Reverse-Trascription PCR)... 86 7.3.1 Retrotrascrizione... 86 7.3.2 Amplificazione... 87 7.3.3 Primer utilizzati... 88
7.4 Elettroforesi su gel di agarosio... 91
7.5 Eluizione degli amplificati di PCR da gel... 91
7.6 Sequenziamento dell’amplificato atteso ... 92
RISULTATI
1. Dosaggio del citocromo P450 in microsomi epatici e di corteccia ... 952. Espressione di varie isoforme di P450 nel cervello ... 96
Attività catalitiche nel fegato ... 97
Attività catalitiche nelle regioni cerebrali... 99
Western blotting ... 103
3. Risultati del P450 2J ... 106 Western blotting ... 106 RT-PCR ... 107
