Altre indagini biofarmaceutiche

Altre indagini

biofarmaceutiche

Indagini biofarmaceutiche

• Solubilità e velocità di dissoluzione.

• Coefficiente di ripartizione tra barriere lipidiche e mezzi fisiologici acquosi

• Studio del meccanismo di trasporto attraverso le membrane biologiche

• Stabilità e/o velocità di degradazione nei fluidi fisiologici

• Studio di suscettibilità all'inattivazione metabolica, effetto di primo passaggio

• Studio tramite dialisi del legame alle proteine

• Studi in vivo su animali

• Analisi farmacocinetiche preliminari

Quanto farmaco verrà assorbito?

Solubilità e velocità di dissoluzione

Degradazione nei fluidi?

Permeabilità (che dipende da Log P e dai meccanismi di trasporto)

(comprensione della sede

dell’assorbimento)

Effetto di primo passaggio

Legame alle proteine

Biodisponibilità plasmatica

Classificazione BIOFARMACEUTICA

paracetamolo carbamazepina

acyclovir amoxocillina

?

• La permeabilità del farmaco riguarda la capacità delle molecole di farmaco di attraversare vari tipi di membrane.

• una permeabilità intestinale di almeno 2-4x10^-4 cm.s^-1 (per molte

sostanze corrispondente a una

frazione assorbita di almeno 90%) è considerata alta.

tipo metodo

computazionale Log P da misure computazionali

Chimico-fisico Log P

Colture cellulari Caco 2 monolayer Tessuti isolati Intestino rovesciato Studi in situ In situ perfusion Studi In vivo Loop intestinale Studi sull’uomo Loc-I-gut- gamma

scintigrafia…

Metodi per misurare la permeabilità

Affidabilità in aumento

Coefficiente di ripartizione

Il rapporto liposolubilità/idrosolubilità è espresso dal coefficiente di

ripartizione olio/acqua: che è dato dal rapporto tra le concentrazione della sostanza nelle due fasi

immiscibili ad una temperatura e a equilibrio raggiunto.

K = C

/C

Fase lipofila: n- ottanolo, etere…

Caco-2 monolayers cells

Linee cellulari (da carcinoma umano) come modello per l’assorbimento intestinale

• Metodo serve anche a elucidare meccanismo di trasporto

(ad es. se aumento lineare con conc., glicoproteineP, uso di competitor specifici, EDTA per la via trans-

paracellulare, etc..)

• Screening rapido, ma non è un modello animale.

tessuti

Foglietti isolati di mucosa intestinale di ratto

(anche di diversi tratti)

Tessuto è vitale?

muscolo?

Perfusione intestinale

(Ratti anestetizzati)

Si valuta la differenza rispetto alla soluzione diluita in ingresso tenendo conto della lunghezza del loop intestinale

Metodo ad ansa aperta

Metodo invasivo

Permeabilità nell’uomo

L’invasività influenza la permeazione?

Permeabilità nell’uomo

• Gamma scintigrafia:

Intelisite capsule

Attivata con radiofrequenza per aprirsi e rilasciare dove si vuole il contenuto

Meccanismi di trasporto per l’assorbimento di

farmaci

Diversi farmaci diversi

meccanismi

• Trasporto passivo o per diffusione attraverso la membrana, dove la forza motrice è il gradiente di concentrazione (da un’area ad alta

concentrazione ad una a bassa)

• Non richiede consumo di energia

• Non richiede trasportatori e non è saturabile

• è regolato dalla prima legge di Fick

TRASPORTO PASSIVO

Zona ad alta

concentraz ione

Zona a bassa

concentrazi one

ATTENZIONE A:

Dimensione, idrofobia, e grado di ionizzazione!

Il

flusso J

proporzionale al gradiente d concentrazione dC/dx

Dove D= coefficiente di diffusione [cm²/sec]

C =concentrazione della sostanza che diffonde

[g/cm³]

X= è la distanza, perpendicolare alla barriera [cm]

TRASPORTO ATTIVO:

• necessita di un trasportatore

• necessita di energia

• (contro gradiente di concentrazione)

• può essere inibito da inibitori metabolici (dinitrofenolo)

• può essere inibito competitivamente da substrati analoghi

Se aumento

concentrazione di

farmaco non aumenta in modo lineare

l’ assorbimento

TRASPORTO ATTIVO

IN SPECIFICHE ZONE DELL’INTESTINO TENUE CI SONO:

Trasportatori specifici per

-peptidi o similpeptidi (anche le cefalosporine, le pennicilline, Ace inibitori, etc..usano questi carrier)

- zuccheri

-nucleosidi (e così antivirali, antitumorali) -amminoacidi (L-dopa, a-metdopa)

-vitamine

-molecole organiche ionizzate

-acidi biliari Carrier sono più o meno specifici

Finestra di assorbimento: dove ci sono i carrier

Membrana apicale orletto a spazzola e basolaterale

TRASPORTO FACILITATO:

• necessita di un trasportatore ma non è contro gradiente

• DRIVING FORCE GRADIENTE DI CONCENTRAZIONE

• competizione con inibitori

• Saturabile

• VELOCITA’ di assorbimento MAGGIORE DI QUELLA PREVEDIBILE DA DIMENSIONI E POLARITA’

IMPORTANZA MOLTO LIMITATA NELL’ASSORBIMENTO DI FARMACI

PINOCITOSI-FAGOCITOSI:

• Tramite invaginazioni della membrana cellulare si incorporano in vescicole sostanze fluide (pino-) o

solide (anche 500 nm). [unica via di assorbimento che non richiede soluzione del farmaco]

• anche macromolecole

• anche mediati da recettori: ligando-recettore)

Macromolecole

Vitamine liposolubili K, D, A, E.., Vaccini

PARACELLULARE

Trasporto di materiali tra i pori acquosi delle cellule anziché attraverso di esse

• Dipende da quanto compatto è lo strato di cellule

• Serve a trasportare molecole cariche, ad es. Calcio, Aminoacidi, zuccheri, piccoli peptidi oltre la

saturazione del carrier. Cut off 200 Da

Celiachia e altre patologie

Permeation enhancers?

Tensioattivi anionici (Sodio laurilsolfato, Sodiolauriletere solfato,..), non ionici, anfiionici

Acidi grassi, esteri, eteri di acidi grassi Sali biliari

EFFLUSSO DALL’INTESTINO Glicoproteine P

Si trovano nel digiuno, nelle cellule tumorali, e molti epiteli-endoteli dell’organismo

DIMINUISCE LA BIODISPONIBILITA’ DI FARMACI (vd Ciclosporina, nifedipina, verapamile…)

La legge di Fick può essere applicata alla diffusione

passiva attraverso la membrana cellulare

C^acq₁ C^m₁ C^m₂ C^acq₂

x

C^acq₁

>

La prima legge di Fick descrive la diffusione libera anche in ambienti non acquosi e quindi anche nell’ambiente interno libero

di una qualsiasi membrana omogenea

La permeabilità relativa di una molecola attraverso un doppio strato lipidico è proporzionale al suo coefficiente di ripartizione K tra la fase di olio e la fase acquosa

Permeabilità della

membrana P_memb = K D_m/x

C^acq₁ C^m₁ C^m₂ C^acq₂

x

C^acq₁

>

Coeff di ripartizione

fluido- membrana K= C^m /C^acqua

Il flusso attraverso la membrana è dato da:





memb

C C

P

J  





m

C C

x K D

J  

Cacq 1Cm 1Cm 2Cacq 2 x

K= coefficiente di ripartizione del F

K1 è tra membrana e fluido fisiologico al sito di assorbimento K2 è tra membrana e sangue,

C sono le due concentrazioni : C1 (m e acq) nel sito di assorbimento, C2 (m e acq) nel torrente circolatorio.

C^acq₁ C^m₁ C^m₂ C^acq₂

x

sangue Fluido fisiologico

K1 K2





memb

C C

P

J  

• La velocità di assorbimento passivo è proporzionale alla concentrazione del F in soluzione nei fluidi

biologici nel sito di assorbimento.

(una cinetica di primo ordine: dipende da una sola concentrazione ).

• Siccome C2 è molto minore di C1





memb

C P

J 





memb

C P

J 

Potete vederla più comunemente scritta così:

Sdt

J  dM ^PC

Sdt dM 

acq1

dt PSC dM 

SICCOME IL Flusso J è la massa che passa per quell’area nell’unità di tempo:

acq1

dt PSC dM 

La velocità di assorbimento passivo è proporzionale alla concentrazione del F in soluzione nei fluidi biologici nel sito di assorbimento

Coefficiente di partizione(K) fluido/membrana entra nell’espressione della permeabilità di un farmaco attraverso la membrana biologica tramite diffusione passiva.

Data la composizione lipidica della membrana cellulare la molecola deve prevedere una adeguata affinità per le fasi lipidiche in modo da poter diffondere attraverso di essa sotto la spinta del gradiente di concentrazione.





m

C

x K D

J 

Però:

l’equazione

maggior liposolubilità= maggior permeabilità- assorbibilità non vale in assoluto!

Ciò che è importante è che il farmaco abbia un adeguato rapporto

liposolubilità/idrosolubilità.

Infatti:

1. se la solubilità in acqua è veramente scarsa non si riesce a realizzare una concentrazione significativa nel fluido extracellulare e quindi l’assorbimento è trascurabile malgrado la favorevole

lipofilia.

2.Inoltre se il farmaco è molto lipofilo potrebbe essere sequestrato dalle strutture lipidiche con conseguente scarsa progressione verso gli strati più profondi.

1

2

Quanto farmaco verrà assorbito?

Solubilità e velocità di dissoluzione

Degradazione nei fluidi?

Permeabilità (che dipende da Log P e dai meccanismi di trasporto) Comprensione della sede

dell’assorbimento

Effetto di primo passaggio

Legame alle proteine

Biodisponibilità plasmatica

Dove saranno assorbiti i p.a.?

Nello stomaco? Nell’intestino?

(che sono per lo più acidi e basi deboli)

pH partition theory*

* Non vale solo per

l’assorbimento nel GIT ma in generale dove ci siano variazioni di pH tra un distretto all’altro e una ripartizione

Trasporto attraverso la membrana (solubilità lipidica)

• Il trasporto attraverso la membrana della forma

indissociata è favorito rispetto a quello della forma

dissociata.

coefficiente di ripartizione vero

P =[HA]

/[HA]

Per una sostanza HA

coefficiente di ripartizione apparente (di distribuzione)

acq acq o

A HA

Papp HA

] [

] [

] [



  Fase organica

Fase acquosa HA HA = H⁺ + A^-

Il grado di ionizzazione varia al variare del pH della fase acquosa e quindi anche il K app !!!!!

Se, come nel caso della gran parte dei F, la sost. è un elettrolita debole esisterà un coefficiente di partizione vero e uno apparente (che tiene conto della forma dissociata della sostanza)

Sappiamo che quando pH= pKa il F è al 50% dissociato e al 50% indissociato.

Ma in qualunque altro caso le conc. differiscono.

Acido debole

Consideriamo la distribuzione di un acido debole (pKa =3) come l’acido acetilsalicilico in fluido gastrico e nel sangue:

log [A-]/[HA]=pH-pKa

a pH gastrico: 1.2-3.0=-1.8 cioè il rapporto [A-]/[HA]=0.016 cioè il 98.6% di F è presente in forma indissociata nello stomaco e quindi assorbibile.

A pH del sangue: 7.4-3.0= 4.4 cioè il 99.996% del F è in forma dissociata nel sangue e quindi non tenderà ad essere riassorbito nello stomaco.

Per un farmaco acido debole

Base debole

Consideriamo una base debole (pKa=5):

log [BH+]/[B]=pKa-pH

a pH gastrico: 5-1.2= 3.8 cioè la gran parte del F è presente nella forma BH+ cioè dissociata non assorbibile dallo stomaco.

A pH del sangue: 5-7.4= -2.4 cioè il 99.65 del F è in forma indissociata.

Anche a pH intestinale la forma prevalente è quella indissociata (90.9%): 5-6=-1.

Per un farmaco base debole con pKa= 5

Secondo questa teoria:

• acidi deboli sono prevalentemente assorbiti nello stomaco, dove sono in forma indissociata,

• Mentre le basi deboli vengono assorbiti preferibilmente a livello

intestinale .

Però questa teoria è parzialmente vanificata da:

• l’area assorbente (di gran lunga maggiore nell’intestino),

• il tempo di residenza nel sito di assorbimento,

• eventuale dissoluzione del F . che deve precedere l’assorbimento e che determina la sua concentrazione nel luogo di assorbimento (e quindi condizioni idrodinamiche: agitazione, composizione…)

acq1

dt PSC

dM 

Molto solubili a pH gastrico (sarà molto dissociato)

Facilmente assorbito nell’intestino tenue (pH più alcalino) dove sarà permeabile, non ionizzato

non è un caso!

Quanto farmaco verrà assorbito?

Solubilità e velocità di dissoluzione

Degradazione nei fluidi?

Permeabilità (che dipende da Log P e dai meccanismi di trasporto)

Effetto di primo passaggio

Legame alle proteine

Biodisponibilità plasmatica

Analisi

farmacocinetica!

L'obiettivo della farmacocinetica è di descrivere la variazione della

concentrazione del farmaco nel sangue in termini matematici in modo che:

1) la "performance" della forma farmaceutica possa essere valutata in termini di velocità e di quantità di farmaco rilasciato nell'organismo;

2) di aggiustare il dosaggio di un farmaco in modo da produrre e mantenere concentrazioni terapeutiche efficaci.

Farmacocinetica

Da un punto di vista sperimentale uno studio di farmacocinetica prevede:

1. La somministrazione, attraverso diverse vie, del

farmaco ai soggetti (in fase preformulativa modelli animali)

1. il prelievo di campioni di sangue o di urina a tempi prefissati

2. lo studio dell'andamento nel tempo delle

concentrazioni del farmaco nei fluidi biologici.

3. In questo modo è possibile una valutazione

complessiva della distribuzione delle concentrazioni del farmaco nell'organismo e quindi delle

concentrazioni efficaci nei siti bersaglio.

…valutazione complessiva della distribuzione delle concentrazioni del farmaco nell'organismo e quindi delle concentrazioni efficaci nei siti bersaglio…

FARMACO NELLA FORMA DI DOSAGGIO

FARMACO IN SOLUZIONE NEI

FLUIDI G.I.

FARMACO NEL COMPARTIMEN TO CORPOREO

FARMACO NELL’

URINA

USC

INGRESSO ITA

EFFETTO

K^A K^EL

Considerando per semplicità:

• FF ORALE

• MODELLO APERTO A UN COMPARTIMENTO

• CINETICA DI PRIMO ORDINE

Farmacocinetica

BIODISPONIBILITA’

Per confrontare la potenza di due forme farmaceutiche dello stesso principio attivo, si è

il termine

"biodisponibilità (plasmatica)”:

la velocità e l’entità con cui il p.a. viene assorbito

nella circolazione generale

Diverse vie:

Per definizione, un farmaco somministrato endovena è biodisponibile al 100%.

(la biodisponibilità dell’ e.v. è 1)

Se il farmaco è somministrato per via extravasale (per es.per os) in

conseguenza del processo di assorbimento, si ha una biodisponibilità generalmente non superiore al 70% di quella corrispondente allo

stesso farmaco somministrato per e.v.

AUC

endovena orale

l'area sottesa dalle curve di assorbimento-eliminazione è usata come misura della biodisponibilità:

Essa infatti permette di ottenere la quantità di farmaco presente nel sangue dall'assorbimento fino alla completa eliminazione

Area= Cp dt

Compresse orali:

Fase di assorbimento e di eliminazione

Diverse vie

così potrò anche sapere se il PICCO di

assorbimento del mio p.a. resta nel range terapeutico e

Quanto dura l’effetto terapeutico

Confronto di diverse formulazioni in base ai profili plasmatici

Posso descrivere l’andamento dalla quantità eliminata nelle urine

Confronto tra diverse

Formulazioni in

base a dati urinari

FARMACO NELLA FORMA DI DOSAGGIO

FARMACO IN SOLUZIONE NEI

FLUIDI G.I.

FARMACO NEL COMPARTIMENTO

CORPOREO

FARMACO NELL’

URINA

USCITA

INGRESSO

EFFETTO

K^A K^EL

• F.F. ORALE

• MODELLO APERTO A UN COMPARTIMENTO

• CINETICA DI PRIMO ORDINE

TEMPO DI EMIVITA DALL’ELIMINAZIONE!!!

t¹

2 = ^0,693

𝐾 𝑒𝑙

Alcuni parametri farmacocinetici importanti

Biodisponibilità assoluta

Il rapporto (AUCos / AUCev) fornisce il valore della biodisponibilità di una formulazione data per via extravasale rispetto alla

somministrazione endovena : BIODISPONIBILITA’ ASSOLUTA

EV OS

AUC assoluta AUC

BILITA

BIODISPONI ' 

EV OS

AUC assoluta AUC

BILITA

BIODISPONI ' 

Biodisponibilità relativa

Il rapporto (AUC

/ AUC

) fornisce il confronto della biodisponibilità di due formulazioni

Area= Cp dt

La frazione può essere moltiplicata per 100 per fornire la biodisponibilità relativa percentuale

 

 C dt dt C

AUC AUC

p p

2 1 2

1 A PARITà DI DOSE

Se si somministrano dosi differenti:

Biosponibilità ass.= AUC

/dose

AUC

/dose

Biosponibilità rel.= AUC

/dose

AUC

/dose

Esempio

exv=extravasale

La biodisponibilità di uno stesso principio attivo varia

a seconda della via di somministrazione

a seconda della forma farmaceutica