LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
IEVA PETRAUSKAITĖ
KVAPIŲJŲ ROZMARINŲ (ROSMARINUS OFFICINALIS L.)
LAPŲ SKYSTŲJŲ EKSTRAKTŲ PRIEŠVĖŽINIO AKTYVUMO
ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbasDarbo vadovė Doc. dr. Vilma Petrikaitė
Konsultantė Prof. dr. Jurga Bernatonienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data
KVAPIŲJŲ ROZMARINŲ (ROSMARINUS OFFICINALIS L.) LAPŲ SKYSTŲJŲ EKSTRAKTŲ PRIEŠVĖŽINIO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Konsultantė Darbo vadovė
Prof. dr. Jurga Bernatonienė Doc. dr. Vilma Petrikaitė Data Data
Recenzentas Darbą atliko Magistrantė Ieva Petrauskaitė Data Data KAUNAS, 2015
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
DARBO REZULTATŲ PRISTATYMAS... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1. Kvapiųjų rozmarinų apibūdinimas ... 12
1.2. Kvapiųjų rozmarinų lapų cheminė sudėtis ... 12
1.3. Kvapiųjų rozmarinų preparatų medicininis pritaikymas ... 13
1.4. Kvapiųjų rozmarinų lapų ekstraktų biologinis aktyvumas ... 14
1.4.1. Priešvėžinis aktyvumas ... 14
1.4.2. Antibakterinis aktyvumas ... 15
1.4.3. Priešvirusinis aktyvumas ... 16
1.4.4. Antioksidacinis aktyvumas ... 16
1.5. Rozmarinių pagrindinių cheminių komponentų biologinis aktyvumas ... 17
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 20
2.1. Reagentai ir priemonės ... 20
2.2. Tyrimo objektas ... 20
2.3. Tyrimo metodikos ... 22
2.3.1. Poveikio ląstelių proliferacijai nustatymas ... 22
2.3.2. Poveikio ląstelių migracijai nustatymas ... 22
2.3.3. Duomenų apdorojimas, statistinė analizė ... 23
3.1. Poveikis ląstelių proliferacijai ... 25
3.2. Poveikis ląstelių migracijai ... 30
3.3. Ekstraktų aktyvumo priklausomybės nuo pagrindinių komponentų kiekio įvertinimas ... 36
4. IŠVADOS ... 38
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 39
SANTRAUKA
I. Petrauskaitės magistro baigiamasis darbas: Kvapiųjų rozmarinų (Rosmarinus officinalis L.) lapų skystųjų ekstraktų priešvėžinio aktyvumo įvertinimas. Mokslinė vadovė: doc. dr. V. Petrikaitė, konsultantė: prof. dr. J. Bernatonienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Vaistų chemijos katedra. Kaunas, 2015.
Tikslas: Įvertinti kvapiųjų rozmarinų lapų skystųjų ekstraktų priešvėžinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai: 1) Ištirti įvairiomis sąlygomis pagamintų kvapiųjų rozmarinų skystųjų ekstraktų poveikį vėžio ląstelių proliferacijai ir migracijai; 2) Nustatyti kvapiųjų rozmarinų skystųjų ekstraktų veikliųjų medžiagų – rozmarino rūgšties, ursolo rūgšties, oleanolio rūgšties ir karnozolio – priešvėžinį aktyvumą; 3) Įvertinti ekstraktų priešvėžinio aktyvumo priklausomybę nuo jų sudėtyje esančių pagrindinių veikliųjų medžiagų kiekio.
Tyrimo objektas: Kvapiųjų rozmarinų (Rosmarinus officinalis L.) džiovintų lapų vandeniniai ir etanoliniai ekstraktai.
Tyrimo metodai. Poveikis žmogaus vėžio ląstelių proliferacijai įvertintas tiriant ląstelių gyvybingumo slopinimą MTT metodu. Poveikis ląstelių migracijai in vitro nustatytas, panaudojant „žaizdos gijimo“ metodą. Koreliacija tarp ekstraktų veikliųjų komponentų aktyvumo ir ekstraktų aktyvumo įvertinta apskaičiuojant Pearson‘o koreliacijos koeficientą r.
Rezultatai. Iš keturiolikos tirtų rozmarinų lapų skystųjų vandeninių ir etanolinių ekstraktų, devyni veikė bent vieną vėžinių ląstelių liniją mažesne nei 5 mg/ml koncentracija. Jie geriausiai veikė IGR39 ląstelių liniją, mažiausiai – U87. Iš vandeninių ekstraktų didžiausiu aktyvumu pasižymėjo ekstraktai R1, R2 ir R7, jie visas ląstelių linijas veikė 8 mg/ml ir mažesnėmis koncentracijomis. Iš etanolinių ekstraktų didžiausiu priešvėžiniu aktyvumu pasižymėjo ekstraktai R10, R11, R12, R13, jų priešvėžinis aktyvumas (GI50) A549, IGR39 ir U87 ląstelėms yra 2,3–5,5 mg/ml. Didžiausią priešvėžinį
aktyvumą turi ursolo rūgštis, kurios GI50 visoms tirtoms ląstelių linijoms yra 10,1–13,2 µM. Oleanolio
rūgštis ir ursolo rūgštis A549 ir IGR39 ląstelių migraciją slopino 25,0–50,0 µM koncentracijomis. Iš keturių tirtų rozmarino ekstraktų, ekstraktas R1 turėjo stipriausią A549 ir IRG39 ląstelių migraciją slopinantį poveikį. Priešvėžiniam ekstraktų aktyvumui daugiausiai įtakos galėtų turėti oleanolio ir rozmarino rūgštys.
Išvados: Kvapiųjų rozmarinų lapų skystieji vandeniniai ir etanoliniai ekstraktai pasižymi priešvėžiniu aktyvumu žmogaus melanomos, plaučių karcinomos ir glioblastomos ląstelėms: slopina jų proliferaciją ir migraciją. Dauguma ekstraktų aktyvesni prieš melanomos ląsteles, mažiausiai veikia glioblastomos ląstelių proliferaciją.
SUMMARY
I. Petrauskaitė Master Thesis: Evaluation of anticancer activity of Rosmarinus officinalis L. leaf liquid extracts. Scientific supervisor: Assoc. Prof. V. Petrikaitė, advisor: Prof. J. Bernatonienė; Department of Drug chemistry, Faculty of Pharmacy, Medical Academy of Lithuanian University of Health Sciences. Kaunas, 2015.
The Aim of the Research: To evaluate anticancer activity of the rosemary leaf liquid extracts. Objectives: 1) To investigate the antiproliferative and antimigratory activities of rosemary leaf liquid extracts produced under different conditions; 2) To investigate anticancer activity of the active ingredients found in extracts (ursolic acid, rosemary acid, oleanolic acid, and carnosol); 3) To evaluate the correlation between the quantity of main active substances of extracts and the anticancer activity of extracts.
The object of research: Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) dried leaf ethanolic and aqueous extracts.
Methods. The effect on human cancer cell proliferation was investigated by evaluating cell viability using MTT assay. Antimigratory activity was tested in vitro using “wound healing” method. The correlation between anticancer activity of extracts and concentration of the main active ingredients was evaluated by calculating Pearson's correlation coefficient r.
Results. Nine out of fourteen tested Rosemary leaf liquid aqueous and ethanolic extracts inhibited the growth of at least one cancer cell line at concentration lower than 5 mg/ml. Extracts possessed the highest activity against IGR39 cell line, and the lowest against U87. In the group of aqueous extracts R1, R2 and R7 were the most active ones against all tested cancer cell lines at the concentration of 8 mg/mL or lower. In series of ethanolic extracts the most active were R10, R11, R12, R13. Their anticancer activity (GI50) against A549, U87 and IGR39 cells was in the range of 2.3-5.5
mg/mL. Ursolic acid showed the highest anticancer activity against all tested cancer cells (GI50 was from 10.1 to 13.2 µM). Oleanolic acid and ursolic acid inhibited A549 and IGR39 cell migration at the concentrations from 25.0 to 50.0 µM. Rosemary extract R1 had the higher antimigratory activity on IRG39 and A549 cells. Anticancer activity of extracts was mostly dependent on the amounts of ursolic acid and oleanolic acid.
Conclusions. Rosemary leaf liquid aqueous and etanolic extracts have anticancer activity against melanoma, lung carcinoma, and glioblastoma cells: inhibit their proliferation and migration. Majority of tested extracts were more active against melanoma cells, the activity on glioblastoma cell proliferation was lower.
PADĖKA
Dėkoju Vilniaus universiteto Biotechnologijos instituto Biotermodinamikos ir vaistų tyrimų skyriaus ir Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Neuromokslų instituto mokslininkams už suteiktą galimybę ir materialinę bazę, atliekant mokslinį – tiriamąjį darbą „Kvapiųjų rozmarinų lapų skystųjų ekstraktų priešvėžinio aktyvumo įvertinimas“. Dėkoju doc. dr. V. Petrikaitei ir prof. dr. J. Bernatonienei už pagalbą ir konsultacijas.
SANTRUMPOS
ATCC A549
Amerikos ląstelių kultūrų kolekcija (angl. American type culture collection) žmogaus nesmulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių linija
DMSO DPPH EC50 ESC GI50 IC50 dimetilsulfoksidas
2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas
koncentracija, surišanti 50 proc. pradinės DPPH koncentracijos efektyvioji skysčių chromatografija
koncentracija, slopinanti 50 proc. ląstelių augimą (angl. growth inhibition) inhibitoriaus koncentracija, sukelianti pusės (50 proc.) ląstelių biologinių ar biocheminių funkcijų netekimą (angl. inhibitory concentration)
IGR39 žmogaus melanomos vėžio ląstelių linija
LD50 dozė, sukelianti žūtį 50 proc. eksperimente naudojamų gyvūnų (angl. lethal
dose) MTT NAD(P)H PBS PSO U87 VAŽ ŽIV 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas redukuota piridino dinukleotido forma
fosfatinis druskų tirpalas, pH 7,4 Pasaulio sveikatos organizacija
žmogaus glioblastomos vėžio ląstelių linija vaistinė augalinė žaliava
ĮVADAS
Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis, navikiniai susirgimai yra viena pagrindinių mirties priežasčių visame pasaulyje [1]. Vėžiniai susirgimai gali pasireikšti bet kuriame amžiuje ir bet kurioje kūno vietoje. Dažniausiai vėžiu sergantys pacientai miršta nuo plaučių, krūties, gaubtinės ir tiesiosios žarnos, skranžio ir prostatos vėžio [2]. Kiekvienas vėžinis susirgimas turi būti gydomas specifiškai. Gali būti taikomas chirurginis gydymas, radioterapija ir chemoterapija [1]. Chemoterapija yra vienas iš pagrindinių vėžio gydymo būdų, tačiau šį gydymo būdą riboja vaistų toksiškumas ir vėžinių ląstelių atsparumas vaistams. Chemoterapijai naudojami vaistai pasižymi dideliu toksiškumu įvairioms organų sistemoms: kvėpavimo takų, širdies ir kraujagysių, virškinamojo trakto, urogenitalinei sistemai ir kt., ir dažnai sukelia rimtas komplikacijas, netgi mirtį [3].
Navikinių ląstelių atsparumas vaistams nuo vėžio yra opi problema, jis gali būti natūralus arba įgytas, gydant navikinius susirgimus. Įgytu rezistentiškumu pasižymi vėžinės ląstelės, kuriose gydymo metu sukeliamos specifinės onkogenetinės mutacijos [4]. Ypač svarbu ieškoti naujų būdų, kurie padėtų kovoti su šiomis problemomis. Šiuo metu labai aktuali priešvėžiniu aktyvumu pasižyminčių veikliųjų medžiagų paieška. Itin daug dėmesio skiriama vaistinių augalų ir jų preparatų pritaikymui gydyti vėžį [5].
Navikinių susirgimų gydymas vaistinių augalų preparatais kartu su tradiciniu gydymu tampa vis populiaresnis. Augaliniai preparatai yra saugesni, pasižymi mažesniu toksiškumu, puikiai tinka profilaktikai ir gydymui [6, 7]. Augaluose yra įvairios prigimties biologiškai aktyvių junginių. Aktyvieji komponentai papildo vienas kito farmakologinį poveikį – veikia kompleksiškai. Jie gali veikti sinergistiškai ir antagonistiškai [8].
Rosmarinus officinalis L. (Lamiaceae) yra visžalis krūmas, natūraliai augantis Viduržiemio jūros regione. Jis plačiai naudojamas visame pasaulyje kulinarijoje ir medicinoje [9]. Sudedamieji kvapiojo rozmarino cheminiai komponentai yra ištirti kaip potencialūs antidepresantai [10], jie pasižymi antivirusiniu [11] ir antioksidaciniu [12] aktyvumu, antinavikiniu veikimu [13] ir kitokiais poveikiais. Literatūros duomenimis, kvapiųjų rozmarinų lapuose eantys aktyvieji komponentai pasižymi vėžinių ląstelių proliferaciją ir migraciją slopinančiu poveikiu. Dėl šios priežasties kaip tyrimo objektą pasirinkome kvapiųjų rozmarinų (Rosmarinus officinalis L.) džiovintų lapų vandeninius ir etanolinius ekstraktus. Labai svarbu nustatyti veikliąsias medžiagas, dėl kurių ekstraktai pasižymi priešvėžiniu aktyvumu – ekstraktai gali būti panaudoti kaip naujų priešvėžinių cheminių junginių šaltinis. Keičiant aktyvių junginių struktūrą, būtų galima kurti naujus cheminius junginius, kurie galėtų pasižymėti didesniu farmakologiniu aktyvumu.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Įvertinti kvapiųjų rozmarinų lapų skystųjų ekstraktų priešvėžinį aktyvumą. Darbo uždaviniai:
1. Ištirti įvairiomis sąlygomis pagamintų kvapiųjų rozmarinų skystųjų ekstraktų poveikį vėžio ląstelių proliferacijai ir migracijai.
2. Nustatyti kvapiųjų rozmarinų skystųjų ekstraktų veikliųjų medžiagų – rozmarino rūgšties, ursolo rūgšties, oleanolio rūgšties ir karnozolio – priešvėžinį aktyvumą.
3. Įvertinti ekstraktų priešvėžinio aktyvumo priklausomybę nuo jų sudėtyje esančių pagrindinių veikliųjų medžiagų kiekio.
DARBO REZULTATŲ PRISTATYMAS
Lietuvos sveikatos mokslų universitete 2013 m. lapkričio 23 d. vykusioje 4-oje tarptautinėje farmacijos mokslų konferencijoje. Stendinio pranešimo pavadinimas „Antimicrobial properties of Rosmarinus officinalis L. leaf extracts“;
Lietuvos sveikatos mokslų universitete 2014 m. gegužės 21-23 d. vykusioje Jaunųjų mokslininkų ir tyrėjų konferencijoje. Žodinio pranešimo pavadinimas „Kvapiųjų rozmarinų lapų skystųjų ekstraktų priešvėžinio aktyvumo tyrimas“;
Lietuvos jaunųjų mokslininkų sąjungos mokslo stovykloje – seminare „Idėjų kalvė 2014“ birželio 19-22 d. pristatytas žodinis pranešimas „Anticancer activity of Rosmarinus officinalis L. leaf extracts“;
Lietuvos jaunųjų mokslininkų sąjungos viešojoje diskusijoje 2014 m. rugsėjo 11 d. pristatytas žodinis pranešimas „Kvapiųjų rozmarinų lapų skystųjų ekstraktų antimikrobinis ir priešvėžinis aktyvumas“.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1.
Kvapiųjų rozmarinų apibūdinimas
Rosmarinus officinalis L. - notrelinių (Lamiaceae) šeimos daugiametis, sumedėjęs, visžalis krūmas, natūraliai augantis Viduržiemio jūros regione ir auginamas visame pasaulyje [9]. Lapai bekočiai, 1–4 cm ilgio, 2–4 mm pločio, spygliški, į apačią užlinkusiais pakraščiais. Viršutinis lapų paviršius yra tamsiai žalias, odiškas, apatinis yra pilkai žalias, apaugęs trumpais tankiais plaukeliais [14]. Žiedynai yra nuo šviesiai mėlynos iki šviesiai alyvinės spalvos su violetinėmis dėmėmis, turi du kuokelius, kurie išsidėstę toliau nuo vainikėlio. Rozmarinas pasižymi aromatingu kvapu ir karčiu skoniu [15]. Jis plačiai naudojamas medicinoje ir kulinarijoje kaip konservantas ir kvapioji medžiaga [9].
1 pav. Kvapusis rozmarinas [16]
1.2. Kvapiųjų rozmarinų lapų cheminė sudėtis
Rozmarinuose yra įvairios prigimties biologiškai aktyvių cheminių junginių, kurių kiekybinė sudėtis priklauso nuo klimato sąlygų, auginimo sąlygų bei vaistinės augalinės žaliavos (VAŽ) kokybės. Rozmarinų lapai gali kaupti iki 2,5 proc. eterinio aliejaus, kuris yra bespalvis arba šviesiai geltonos spalvos skystis. Eterinio aliejaus sudėtyje yra kamparo (5-21 proc.), eukaliptolio, 1,2-cineolio (15-55 proc.), α-pineno (9-26 proc.), borneolio (1,5-5,0 proc.), kamfeno (2,5-12,0 proc.), β-pineno (2,0-9,0 proc.), limoneno (1,5-5,0 proc.), mirceno ir humuleno [15, 17].
Lapai taip pat kaupia fenolinius junginius, kurių didžiąją dalį sudaro flavonoidai, fenolinės rūgštys ir tricikliai diterpenai. Tyrimų metu nustatyti šie flavonoidai: genkvaninas [15], hesperetinas,
apigeninas, cirzimarinas, skutelareinas, homoplantagininas ir kt. [18]. Rozmarinų lapai kaupia šias fenolines rūgštis (>3 proc.): rozmarino, chlorogeno, kavos [15], ferulinę ir vanilinę [17, 18]. Taip pat lapuose yra triciklių diterpenų: rozmarindifenolio, rozmarinkvinono, metilkarnozato, karnozolio, karnozolio rūgšties, rozmanolio epirozmanolio, epiizorozmanolio, epirozmanolio, epiizorozmanolio etilo eterio, rozmadialio, metilkarnozolato [15, 18, 19].
1.3. Kvapiųjų rozmarinų preparatų medicininis pritaikymas
Rozmarinas buvo vartojamas Europos ir tradicinėje Graikų medicinoje kaip tonikas, stimuliuojanti medžiaga, mažinanti galvos skausmą ir nervinę įtampą. Vartojimo indikacijos skiriasi skirtinguose pasaulio regionuose, pavyzdžiui, senovės graikai naudojo rozmariną stiprinti atminčiai. Pietų Amerikoje rozmarinas buvo vartojamas gydyti vėžinius susirgimus. Brazilijos liaudies medicinoje buvo vartojamas kaip abortą sukelianti medžiaga. Moterys jį naudojo esant menstruacijų ciklo sutrikimams. Britų vaistažolių farmakopėjoje nurodyta, kad rozmarinų sudėtyje esantys cheminiai junginiai pasižymi spazmolitiniu, raminančiu, diuretiniu, antimikrobiniu, analgetiniu, antidepresiniu ir kitais poveikiais [19].
Europos liaudies medicinoje rozmarino preparatai vartojami kaip spazmolitinė priemonė, esant dispepsijai, taip pat kaip diuretikas, tonizuojanti medžiaga, skatinti menstruacijas, šalinanti menstruacijų ciklo sutrikimus, mažinanti galvos skausmą ir atminties sutrikimus. Taip pat rozmarinas vartojamas mažinti sąnarių skausmą, aktyvina sumažėjusią kraujotaką, vartojamas esant virškinimo sutrikimams, cukriniam diabetui, hipertenzijai, mažina plaukų slinkimą. Išoriškai buvo vartojamas nuo reumato, kraujotakos sutrikimams gydyti, esant sumušimams ir sausgyslių patempimams. Kosmetikos pramonėje rozmarinas vartojamas gydyti celiulitą ir raukšles [9, 15, 20].
Eksperimentiniais farmakologiniais tyrimais patvirtintas rozmarinų lapų skystųjų ekstraktų antimutageninis, antihepatotoksinis, priešuždegiminis, antioksidacinis, antimikrobinis, atpalaiduojantis, antinefrotoksinis, spazmolitinis, prievėžinis aktyvumas, taip pat diuretinis, hipoglikeminis, fermentus indukuojantis, estrogeninis ir imuninę sistemą stimuliuojantis poveikis. Nustatytas ekstraktų poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai, imuninei sistemai, inkstų, kepenų funkcijai [15].
Kvapiųjų rozmarinų ekstraktų pagrindiniai sudedamieji cheminiai komponentai (karnozolis, karnozolio rūgštis, rozmarino rūgštis ir kavos rūgštis) yra ištirti kaip potencialūs antidepresantai [10], jie pasižymi antivirusiniu [11], antimikrobiniu [21] ir antioksidaciniu aktyvumu, antinavikiniu [13] ir kitokiais poveikiais.
1.4. Kvapiųjų rozmarinų lapų ekstraktų biologinis aktyvumas
1.4.1. Priešvėžinis aktyvumas
Kvapiųjų rozmarinų lapų skystieji ekstraktai ir atskiri biologiškai aktyvūs cheminiai junginiai, kurių yra vaistinėje augalinėje žaliavoje, pasižymi chemoprofilaktinėmis savybėmis. Rozmarinas taip pat pasižymi proliferaciją slopinančiu veikimu in vitro prieš krūties, leukemijos, kepenų, gaubtinės žarnos, plaučių, prostatos, kiaušidžių ir šlapimo pūslės vėžinių ląstelių linijas. Rozmarinų molekulinis veikimo mechanizmas, atsakingas už priešvėžinį poveikį, nėra dar visiškai aiškus. Prieš pradedant naudoti rozmariną kaip papildomą priemonę gydyti vėžinius susirgimus, reikia nustatyti efektyviausią cheminių junginių kompoziciją, todėl būtina atlikti detalesnius tyrimus in vivo ir in vitro [8].
Literatūros duomenimis, karnozolio ir karnozolio rūgšties derinio priešvėžinis aktyvumas yra didesnis nei atskirų komponentų, todėl ekstraktai pasižymi sinergistiniu poveikiu. Tikslus rozmarino ekstraktų molekulinis priešvėžinio veikimo mechanizmas nėra gerai ištirtas. Manoma, jog priešvėžinės savybės susijusios su padidėjusia GCNT3 geno raiška ir sumažėjusia, šio geno potencialaus epigenetinio moduliatoriaus, miR-15b, ekspresija. Be to, in vivo eksperimentais įrodyta, jog vartojant rozmarinų ekstraktus sumažėja miR-15b kiekis plazmoje [8].
Rozmarinų lapų metanoliai, etanoliniai ir superkritinių skysčių ekstrakcijos būdu pagaminti ekstraktai pasižymi priešvėžiniu aktyvumu prieš įvairias vėžio ląstelių linijas, tarp jų ir krūties vėžio: MCF-7, T-47D, MDA-MB-231, UACC-812 ir SK-BR-3. Eksperimentais patvirtinta, kad mažiausiai jautri ląstelių linija yra UACC-812 (GI50 =19,2 ± 4,5 µg/ml), o jautriausia - SK-BR-3 (GI50 = 10,0 ±
2,1 µg/ml). Nustatyta, kad tokį aktyvumą lemia pagrindiniai ekstraktų cheminiai komponentai – karnozolis ir karnozolio rūgštis [22].
Išanalizavus 36 mokslinių tyrimų rezultatus, iš kurių 8 atlikti su gyvūnais, o 28 – su ląstelėmis in vitro (1996-2010 m.), mokslininkai padarė išvadą, kad rozmarinų ekstraktai pasižymi priešvėžiniu aktyvumu dėka jų sudėtinių komponentų: karnozolio, karnozolio rūgšties, ursolo rūgšties ir rozmarino rūgšties. Nustatytas rozmarinų ekstraktų apsauginis priešvėžinis poveikis prieš storosios žarnos ir kitų rūšių vėžius [23].
Ištirtas ekstraktų priešvėžinis aktyvumas prieš gimdos kaklelio epitelio karcinomos ląstelių liniją. Buvo vertinamas acetoninio rozmarinų ekstrakto in vitro citotoksiškumas prieš nevėžines Afrikos žaliosios beždžionės inkstų ląstelių linijas ir gimdos kaklelio vėžio ląstelių linijas. Rosmarinus officinalis ekstraktai stipriai slopino gimdos kaklelio vėžinių ląstelių linijos proliferaciją. Buvo nustatyta, kad priešvėžiniu aktyvumu pasižymi šie cheminiai rozmarino komponentai: rozmarino rūgštis, karnozolis ir karnozolio rūgštis [24].
Nustatytas rozmarinų lapų ekstrakto priešvėžinis poveikis storosios žarnos vėžinėms ląstelėms, naudojant MTT metodą. Ekstraktas slopino storosios žarnos vėžinių ląstelių dauginimąsi ir sukėlė ląstelių mirtį. Rozmarinų lapų ekstraktu buvo veikiamos dvi ląstelių linijos: SW620 (GI50 = 26,58 ± 5,58 µg/ml) ir DLD-1 (GI50 = 23,89 ± 6,68 µg/ml) [13].
Nustatytas proliferaciją slopinantis šešių rozmarino ekstraktų ir atskirų veikliųjų komponentų (karnozolio ir rozmarino rūgščių) poveikis žmogaus leukemijos, krūties, prostatos, plaučių ir kepenų vėžinėms ląstelių linijoms (NCI-H82, DU-145, Hep-3B, K-562, MCF-7, PC-3, MDA-MB-231) [25].
Remiantis literatūroje pateiktais eksperimentų rezultatais, galima teigti, kad ekstraktai, savo sudėtyje turintys daug karnozolio, karnozolio rūgšties, ursolo rūgšties ir rozmarino rūgšties, galėtų būti vartojami kaip papildoma priemonė gydyti storosios žarnos, krūties, prostatos, nesmulkialąstelinį plaučių, kasos ir kitų rūšių vėžį.
1.4.2.
Antibakterinis aktyvumasAntibakterinį aktyvumą turinčių augalinių ekstraktų ir jų sudedamųjų cheminių junginių vartojimas medicininėje praktikoje yra labai reikšmingas. Tai puiki alternatyva cheminiams vaistams, juose esantys junginiai veikia kompleksiškai ir jie yra saugesni nei cheminiai vaistai. Kvapiųjų rozmarinų lapų ir stiebų etanoliniai ekstraktai yra veiksmingi prieš burnos ertmės patogenus (Streptococcus mutans, S. salivarius, S. sobrinus, S. mitis, S. sanguinis ir Enterococcus faecalis), kurie atsakingi už dantų ėduonies atsiradimą. Lapų ekstraktai pasižymi didesniu aktyvumu, juose aptikti šie cheminiai junginiai: karnozolio rūgštis ir karnozolis. Teigiama, kad pastarieji junginiai nulemia antimikrobines ekstraktų savybes. Kiti mokslininkai nustatė, kad flavonoidų frakcija nepasižymi stipriu aktyvumu [9, 26]. Ekstraktai, kuriuose nustatytas didelis kiekis rozmarino rūgšties, nepasižymėjo antimikrobiniu aktyvumu minėtiems patogenams [9].
Nustatyta, kad ekstraktai pasižymi aktyvumu prieš šlapimo takų infekcijas sukeliančias bakterijas (E. coli, P. mirabilis, K. pneumoniae, E. aerogenes, P. aeruginosa, S. saprophyticus, S. epidermidis ir E. faecalis) [27, 28]. Šių ir kitų mokslininkų tyrimų rezultatai parodė, kad gramteigiamos bakterijos (S. saprophyticus, S. epidermidis, E. faecalis, P. aeruginosa) yra jautresnės ekstraktų poveikiui, nei gramneigiamos bakterijos (S. aureus ir S. epidermidis) [26, 27, 28]. Ekstraktai taip pat slopina šių bakterijų augimą: S. aureus, M. luteus, B. subtilis ir A. niger . Jautriausia bakterijų kultūra buvo M. luteus [28]. Rozmarinų ekstraktai taip pat slopina maiste atsirandančių bakterijų augimą [29].
Šių tyrimų rezultatai rodo, kad rozmarinų ekstraktai, kurie yra pagaminti naudojant paprastą gamybos technologiją, galėtų būti pritaikyti kaip natūrali priemonė, slopinanti bendrųjų ligų sukėlėjų augimą, pavyzdžiui, šlapimo takų infekcijų.
1.4.3. Priešvirusinis aktyvumas
Šiuo metu itin susidomėta vaistinių augalų ekstraktų pritaikymu gydyti virusines infekcijas. Literatūros duomenimis, etanoliniai rozmarinų ekstraktai pasižymi antivirusiniu aktyvumu prieš Herpes simplex viruso 1 tipą, kuris yra labai paplitęs tarp suaugusiųjų ir vaikų. Manoma kad, antivirusinį poveikį nulemia ekstraktuose esanti rozmarino rūgštis ir eterinis aliejus. Nustatyta, kad etanolinių ekstraktų pusinė maksimali inhibicinė koncentracija (IC50) yra 0,16-0,82 μg/ml [30].
Metanoliniai rozmarino ekstraktai stabdo respiracinio sincitinio viruso replikaciją. Šis virusas sukelia apatinių kvėpavimo takų infekcijas. Aiškinama, kad šių ekstraktų antivirusinį poveikį lemia karnozolio rūgštis [11].
Literatūros duomenimis, rozmarino ekstraktai taip pat pasižymi antivirusiniu aktyvumu prieš žmogaus imunodeficito virusą (ŽIV). Ekstraktų veikimo mechanizmas nėra tiksliai nustatytas. Manoma, kad jie slopina ŽIV replikaciją ląstelėse. Nustatyta, kad priešvirusinį aktyvumą nulemia karnozolis ir karnozolio rūgštis [31].
1.4.4. Antioksidacinis aktyvumas
Rozmarino ekstraktai yra natūrali alternatyva cheminiams antioksidantams, jie turi panašų arba net stipresnį antioksidacinį poveikį [32]. Džiovintuose rozmarinų lapuose yra daug junginių, pasižyminčių antioksidaciniu aktyvumu, jų poveikis gerai ištirtas naudojant įvairius tyrimo metodus. Vieni iš aktyviausių antioksidantų, esančių šiame augale, yra karnozolio rūgštis [33], kavos rūgštis, rozmarino rūgštis.
Ištyrus rozmarinų lapų, šakų ir žiedų skystųjų metanolinių, acetoninių ir vandeninių ekstraktų antioksidacinį aktyvumą 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo radikalų (DPPH) sujungimo metodu, nustatyta, kad žiedų ekstraktai pasižymi didesniu antioksidaciniu aktyvumu. Žiedų ekstraktų koncentracija, surišanti 50 proc. pradinės DPPH koncentracijos (EL50) yra 33 µg/ml, ji mažesnė nei lapų (EL50 =
46 µg/ml) ir šakų ekstraktų (EL50 = 164 µg/ml). Didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo
Atlikus rozmarinų džiovintų lapų etanolinių ekstraktų antioksidacinio aktyvumo tyrimą in vitro pelių makrofagų/monocitų ląstelių linijoje (RAW 264.7) DPPH metodu, nustatyta, kad esant etanolinių ekstraktų praskiedimams 1:10 ir 1:15 (EL50 = 8,1–12,6 µM), jie pasižymi didžiausiu aktyvumu, kuris
yra didesnis nei trolokso antioksidacinė galia. Taip pat ekstraktai efektyviai slopina azoto monoksido gamybą RAW 264.7 ląstelėse [34].
1.5. Rozmarinų pagrindinių cheminių komponentų biologinis aktyvumas
Kvapiųjų rozmarinų lapuose esantys cheminiai junginiai (2 pav.) pasižymi dideliu biologiniu aktyvumu. Įrodyta, kad dauguma šių junginių, pavyzdžiui, karnozolio rūgštis, karnozolis, ursolo rūgštis, oleanolio rūgštis, taip pat eterinio aliejaus sudedamieji komponentai yra atsakingi už rozmarinų preparatų priešvėžines savybes [8]. Jie yra įvairios cheminės prigimties, pavyzdžiui, ursolo ir oleanolio rūgštis yra triterpenoidiniai junginiai, kurie yra izopentilpirofostato oligomerų metabolitai. Triterpenoidai labai paplitę gamtoje ir randami įvairiuose augaluose: spanguolėse, levandose, rozmarinuose ir kituose augaluose. Jie yra biosintetinami skvaleno kristalizacijos metu iš triterpeno hidrokarbonato ir iš steroidų pirmtakų. Nustatyta, kad triterpenoidai pasižymi mažu toksiškumu, dėl šios savybės susidomėta jų biologiniu aktyvumu [35].
Ursolo rūgštis (3b-hidroksi-12urs-12-en-28-o rūgštis) yra hidroksipentaciklinė triterpeno rūgštis [35], kuri yra gerai žinoma dėl priešvėžinių, antioksidacinių [36], antidepresantinių, antimikrobinių, antivirusinių, priešuždegiminių savybių [6, 10]. In vitro tyrimų metu nustatyta, kad ursolo rūgštis slopina vėžinių ląstelių proliferaciją, ląstelių ciklo G1 fazės metu sukelia citotoksinį atsaką, kuris nulemia ląstelių mirtį [37]. Taip pat sukelia vėžinių ląstelių apoptozę, apsaugo nuo tumorigenezės, sukelia autofagiją [35]. In vivo tyrimais patvirtinta, kad ursolo rūgštis slopina navikų augimą, vėžio ląstelių diferenciaciją ir apoptozę. Taip pat slopina angiogenezę, vėžio ląstelių invaziją ir metastazes [38]. Šis junginys stipriai slopina H3255 ir A549 vėžio ląstelių invaziją ir migraciją [39]. Vis dėlto, ursolo rūgšties pritaikymą klinikinėje praktikoje riboja prastas tirpumas vandenyje, greitas metabolizmas ir nedidelis biologinis pasisavinimas [35].
CH3 CH3 OH O H C H3 CH3 O O H CH3 H CHCH3 3 H C H3 H CH3 C H3 O H C H3 OH O
Karnozolis Oleanolio rūgštis
O OH OH OH O H O H O O H C H3 CH3 H CH3 O H H CH3 C H3 OH O CH3 CH3
Rozmarino rūgštis Ursolo rūgštis
2 pav. Rozmarino lapuose randamų biologiškai aktyvių cheminių junginių struktūrinės formulės
Oleanolio rūgšties (3β-hidroksi-olea-12-en-28-olinė rūgštis) ir ursolo rūgšties struktūra beveik identiška, skiriasi tik E ciklo C-29 metilo grupės padėtis. Šios rūgštys prastai tirpsta vandenyje, todėl turi mažą biologinį pasisavinimą [40]. Abu triterpeniniai junginiai yra plačiai paplitę augaluose kaip laisvos rūgštys arba kaip triterpeninių saponinų agliukonai. Oleanolio rūgštis randama augalų paviršiniame vaško sluoknyje, apsaugančiame nuo vandens netekimo ir patogenų. Nustatyta, kad oleanolio rūgštis sintetinama citozolyje iš 2,3-oksidoskvaleno. Oleanolio ir ursolo rūgšties biologinis aktyvumas yra panašus. Viena iš pagrindinių farmakologinių savybių yra hepatoprotekcinis poveikis – apsaugo kepenis nuo cheminių medžiagų sukelto ūmaus pažeidimo, fibrozės ir cirozės sukeltų lėtinių ligų [41]. Taip pat pasižymi priešuždegiminiu, priešvėžiniu aktyvumu, antihiperlipideminiu poveikiu [42, 43].
Rozmarino rūgštis yra kofeino rūgšties ir 3,4-dihidroksifenilacetinės rūgšties esteris, kuris dažniausiai randamas Boraginaceae, Laminaceae, Apiaceae šeimų augaluose. Nustatytas rozmarino rūgšties antivirusinis, antibakterinis, priešuždegiminis, antimutageninis ir antioksidacinis aktyvumas. Dėl antivirusinių savybių naudojama Herpes simplex infekcijos gydymui. Priešuždegiminės savybės
pasireiškia dėl lipoksigenazės ir ciklooksigenazės slopinimo. Rozmarino rūgštis yra greitai eliminuojama iš kraujo cirkuliacijos. Ji gali būti vartojama kaip prevencinė priemonė nuo vėžinių susirgimų, taip pat naudojama kosmetikos pramonėje [44].
Karnozolis yra orto-difenolinis diterpenas, C11 ir C12 padėtyse turintis hidroksi grupes ir laktono fragmentą B žiede. Tai karnozolio rūgšties oksidacinės degradacijos produktas [45], pasižymintis priešuždegiminiu, chemoprotekciniu ir priešvėžiniu aktyvumu [25] prieš prostatos, krūties, leukemijos ir kitas vėžinių ląstelių linijas [45]. Literatūros duomenimis, karnozolis turi apoptozę sukeliantį poveikį leukemijos vėžinėms ląstelėms, tačiau veikimo mechanizmas nėra gerai ištirtas. Proteometrinės analizės metu nustatyta, kad karnozolis turi įtakos redokso reguliavimui ląstelėse [46].
Tyrimų su gyvūnais metu nustatyta, kad kiekvieną dieną vartojant karnozolio tirpalus per os, jis yra gerai toleruojamas ir pasisavinamas [45].
Apibendrinant literatūroje pateiktus duomenis, galima teigti, kad ursolo rūgštis, oleanolio rūgštis, karnozolis ir rozmarino rūgštis lemia kvapiųjų rozmarinų lapų preparatų priešvėžines savybes. Todėl nusprendėme išsiaiškinti, kaip ekstraktų poveikis ląstelių proliferacijai (ląstelių augimui) galėtų priklausyti nuo šių komponentų kiekio esktraktuose, o taip pat įvertinti jų poveikį ląstelių migracijai. Esant vėžiniams susirgimams, ląstelės migruoja iš pirminio naviko į kraujotaką arba limfą ir juda į naują vietą, kur sudaro antrinį auglį, t.y. metastazuoja [47]. Labai svarbu kontroliuoti ir slopinti metastazes esant vėžiniams susirgimams [48]. Aktyviųjų junginių poveikis skirtingoms vėžinėms ląstelės gali skirtis, todėl tyrimams pasirinkome tris skirtingas žmogaus vėžio ląstelių linijas: nesmulkialąstelinio plaučių vėžio (A549), melonomos (IGR39) ir glioblastomos (U87).
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1. Reagentai ir priemonės
Reagentai
Ursolo rūgštis ≥ 97 proc., Sigma-Aldrich Oleanolio rūgštis ≥ 97 proc., Sigma-Aldrich Karnozolis ≥ 98 proc., Sigma-Aldrich Rozmarino rūgštis > 98 proc., ChromaDex
Dimetilsulfoksidas (DMSO) ≥ 99,5 proc., Sigma-Aldrich
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il-)-2,5-difeniltetrazolio bromidas (MTT) ≥ 97 proc., Sigma-Aldrich NVP-AUY922 > 99 proc., Selleckchem
Dulbecc‘o modifikuota Eagle ląstelių mitybinė terpė (DMEM), Gibco Fetalinis veršiukų serumas (FBS),Gibco
Fosfatinis druskų tirpalas, pH 7,4 (PBS), Gibco
1 proc. antibiotikų tirpalas (10000 vienetų/ml penicilino ir 10 mg/ml streptomicino), Gibco Tripsino tirpalas TrypLE™ Express, Gibco
Vėžio ląstelių linijos
Žmogaus nesmulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių linija (A549), Amerikos ląstelių kultūrų kolekcija (angl. American Type Culture Collection, ATCC)
Žmogaus melanomos vėžio ląstelių linija (IGR39), ATCC Žmogaus glioblastomos vėžio ląstelių linija (U87), ATCC Įranga
Mikroplokštelių spektrofotometras Multiskan go, Thermo Scientific Elektroninis fazinio kontrasto mikroskopas Olympus TH4-200
2.2. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – kvapiųjų rozmarinų (Rosmarinus officinalis L.) džiovintų lapų vandeniniai ir etanoliniai ekstraktai, pagaminti doktorantės Ugnės Čižauskaitės. VAŽ buvo įsigyta iš UAB „Širdažolė“ (Lietuva). Ekstraktų gamybai buvo naudoti džiovinti smulkinti (0,225-1 mm) R. officinalis lapai. Ekstraktų kiekybinė analizė atlikta efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu.
Vandeniniai ir etanoliniai ekstraktai buvo ruošiami iš VAŽ santykiais 1:5, 1:10, 1:15, 1:20. VAŽ užpilama 70 proc. arba 90 proc. V/V etanoliu. Gaminant vandeninius ekstraktus, VAŽ užpilama destiliuotu vandeniu, kurio pH 7-11. Skystieji ekstraktai ekstrahuojami ultragarsu 10 min, 15 min, 30 min 30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C temperatūroje. Pagaminti ekstraktai filtruojami per popierinį filtrą, po to – per 0,2 µm membraninį filtrą. Laikomi ne ilgiau kaip tris paras 5 ±3ºC temperatūroje. Ekstraktų gamybos sąlygos pateiktos 1 ir 2 lentelėse.
1 lentelė. Vandeninių ektraktų gamybos sąlygos
Ekstrakto kodas Ekstrahento pH Žaliavos-ekstrahento santykis Ekstrakcijos temperatūra (°C) Ekstrakcijos laikas (min) R1 7 1:5 50 10 R2 7 1:10 50 10 R3 7 1:15 40 10 R4 9 1:15 50 10 R5 11 1:15 50 10 R6 7 1:20 50 10 R7 7 1:15 50 10
2 lentelė. Etanolinių ekstraktų gamybos sąlygos
Ekstrakto kodas Etanolio koncentracija (proc. V/V) Žaliavos-ekstrahento santykis Ekstrahavimo temperatūra (°C) Ekstrakcijos laikas (min) R8 90 1:15 30 10 R9 90 1:15 40 10 R10 90 1:15 50 30 R11 90 1:15 50 10 R12 90 1:15 60 10 R13 90 1:15 50 15 R14 70 1:15 50 10
2.3. Tyrimo metodikos
2.3.1. Poveikio ląstelių proliferacijai nustatymas
Rozmarinų lapų vandeninių ir etanolinių ekstraktų bei jų pagrindinių aktyvių komponentų (ursolo rūgšties, rozmarino rūgšties, oleanolio rūgšties ir karnozolio) priešvėžinis aktyvumas nustatytas in vitro trims vėžinių ląstelių linijoms: A549, IGR39 ir U87. Ląstelės auginamos DMEM su 10 proc. FBS ir 1 proc. antibiotikų (10000 vienetų/ml penicilino ir 10 mg/ml streptomicino). Ląstelės inkubuojamos 37°C temperatūroje, drėgnoje atmosferoje, turinčioje 5 proc. CO2.
Į 96 šulinėlių plokšteles pilama po 100 µl ląstelių suspensijos eksponentinio augimo fazėje taip, kad viename šulinėlyje būtų atitinkamai po 3000 (U87) arba 2000 (A549 ir IGR39) ląstelių. Ląstelės plokštelėse 24 val. inkubuojamos 37 °C temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje.
Įvairių koncentracijų tiriamieji etanoliniai ir vandeniniai ekstraktai praskiedžiami su ląstelių auginimo terpe nuo 100 iki 1600 kartų. Tiriamieji cheminiai junginiai tirpinami DMSO ir skiedžiami ląstelių augimo terpėje vis po keturis kartus (nuo 100 μM iki 1,56 μM). Pagaminti tirpalai po 100 μl pilami į plokšteles su ląstelėmis. Tiriant aktyvius junginius neigiama kontrolė buvo 0,25 proc. DMSO tirpalas su terpe, o tiriant ekstraktus ląstelės paveiktos terpe su ekstrahentu (etanolis arba vanduo). Teigiama kontrolė – ląstelės paveiktos 10 μM NVP-AUY922 (tokia šio junginio koncentracija nužudo visas vėžio ląsteles). Kiekvienas bandymas kartotas tris kartus. Plokštelės laikomos 37 °C temperatūroje 5 proc. CO2 atmosferoje 72 val.
Poveikis ląstelių proliferacijai tirtas MTT metodu, t.y. augančios ląstelės veikiamos MTT, kuris yra nuo redukuotų piridino dinukleotidų formų NAD(P)H kiekio priklausomos oksidoreduktazės substratas. Į kiekvieną šulinėlį pilama po 20 µl MTT ir inkubuojama 37 °C temperatūroje 5 proc. CO2
atmosferoje. Po 2 valandų skystis iš šulinėlių išpilamas. Susidaręs netirpaus metabolito (formazano) kristalų kiekis atitinka gyvų ląstelių skaičių. Susidarę formazano kristalai tirpinami 100 µl DMSO, o jų kiekis nustatomas UV spektrofotometriškai. Absorbcija buvo išmatuota naudojant daugybinės detekcijos mikroplokštelių skaitytuvą 490 nm bandymo bangos ilgyje ir 630 nm etaloninės bangos ilgyje.
2.3.2. Poveikio ląstelių migracijai nustatymas
Kvapiųjų rozmarinų lapų keturių skystųjų ekstraktų, pagamintų ultragarsinės ekstrakcijos metodu, ir atskirų komponentų (karnozolio, rozmarino rūgšties, oleanolio rūgšties ir ursolo rūgšties)
poveikis ląstelių migracijai in vitro nustatytas dviems vėžinių ląstelių linijoms (A549 ir IGR39), panaudojant „žaizdos“ gijimo metodą.
Žaizdos gijimo tyrimo metu stebima ląstelių migracija į „žaizdą“, kuri yra padaryta vėžinių ląstelių monosluoksnyje. Šis metodas ypač tinka nustatyti ląstelių migracijos kryptį ir ląstelių sąveiką su tarpląsteline matriksa ir tarpusavyje. Pagrindinis žingsnis yra sukurti „žaizdą“ ląstelių monosluoksnyje. Po to fiksuojamas vaizdas ląstelių migracijos pradžioje ir reguliariais laiko tarpais „žaizdos“ gijimo metu. Palyginant gautas nuotraukas nustatomas ląstelių migracijos lygis [47].
Naudojamos 24 šulinėlių plokštelės, kurių išorinėjė apatinėje dalyje nubrėžiamos punktyrinės atskaitos linijos, reikalingos fotografuojant. Paruoštos ląstelių suspensijos eksponentinio augimo fazėje išpilstomos į šulinėlius taip, kad kiekviename šulinėlyje būtų po 80000 ląstelių, kurios po 24 val. sudaro ląstelių monosluoksnį. Ląstelės inkubuojamos 24 val. 37 °C temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje.
Rankiniu būdu nugramdant ląstelių monosluoksnį 20 μl pipetės antgaliu, padaromos „žaizdos“. Nuo ląstelių nusiurbiama terpė, perplaunama 1 ml PBS ir į šulinėlius supilama po 500 μl rozmarinų ekstraktų arba atskirų komponentų DMSO tirpalų, praskiestų su ląstelių auginimo terpe. A549ląstelių linija buvo veikiama atitinkamomis keturių rozmarino ekstraktų (R1, R8, R10 ir R12) ir aktyviųjų komponentų (oleanolio rūgšties, karnozolio, ursolo rūgšties ir rozmarino rūgšties) koncentracijomis, o IGR39 ląstelių linija – ursolo rūgštimi ir ekstraktu R1. Tyrimuose naudotos nuo 5 iki 50 µM aktyvių junginių koncentracijos. Buvo naudojamos šios ekstraktų R8, R10, R12 (5, 2,5 ir 1,25 mg/ml) ir R1 (2,5, 1,25 ir 0,625 mg/ml) koncentracijos. Neigiama kontrolė – atitinkamos koncentracijos DMSO tirpalai.
Pradiniame atskaitos taške (eksperimento pradžioje), naudojant fazinio kontrasto elektroninį mikroskopą (4×) nufotografuojamos padarytos „žaizdos“. Ląstelės su ekstraktais ir tiriamųjų medžiagų tirpalais inkubuojamos 37 °C temperatūroje 5 proc. CO2 atmosferoje, o po 24, 48 ir 72 val.
fotografuojamos elektroniniu mikroskopu. Atliekama kiekybinė vaizdų analizė, įvertinama ląstelių migracija.
2.3.3. Duomenų apdorojimas, statistinė analizė
Duomenys apdoroti „MS Excel 2013“ paketu, įvertinant trijų matavimų vidurkį ir santykinį standartinį nuokrypį.
Poveikis ląstelių proliferacijai įvertintas, apskaičiuojant koncentraciją, kuri slopina 50 proc. ląstelių gyvybingumą (GI50), normalizavus absorbcijos vertes nuo 0 (teigiama kontrolė) iki 1 (neigiama
Poveikis ląstelių migracijai apskaičiuotas, panaudojant „Tscratch“ programinį paketą (MATLAB, 2008). Programa paskaičiuoja jai pateiktoje nuotraukoje plotą procentais, kuriame nėra ląstelių (žaizdos dydį).
Koreliacija tarp ekstraktų veikliųjų komponentų aktyvumo ir ekstraktų aktyvumo įvertinta apskaičiuojant Pearson‘o koreliacijos koeficientą r. Koreliacija laikoma labai stipri, kuomet r yra 0,90 – 0,99 (teigiama) arba -0,99 – (-0,90) (neigiama); stipri, kai r yra 0,70 – 0,89 (teigiama) arba -0,89 – (- 0,70) (neigiama); vidutinė, kai r yra 0,40 – 0,69 (teigiama) arba -0,69 – (-0,40) (neigiama).
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Poveikis ląstelių proliferacijai
Atlikus ekstraktų pagrindinių komponentų priešvėžinio aktyvumo tyrimą, nustatyta, kad didžiausią aktyvumą turi ursolo rūgštis, kurios GI50 visoms tirtoms ląstelių linijoms yra 10,1–13,2 µM
(3 pav.). Huang ir kiti mokslininkai taip pat nustatė panašų ursolo rūgšties aktyvumą prieš A549 ląstelių liniją. Labiausiai šios ląstelių linijos gyvybingumą slopino 16,0 µM ursolo rūgšties koncentracija [39].
3 pav. Ekstraktų pagrindinių komponentų GI50 A549, IGR39 ir U87 ląstelėms
Karnozolis veikė visas tris ląstelių linijas, didžiausiu aktyvumu pasižymėjo prieš U87 ląstelių liniją (GI50 = 13,5 µM). Rozmarino rūgštis prieš tirtas vėžio ląstelių linijas nepasižymėjo dideliu
citotoksiniu aktyvumu (GI50 > 50 µM). Kiti mokslininkai taip pat nustatė, kad rozmarino rūgštis turi tik
nedidelį citotoksinį aktyvumą, 60 µM koncentracija mažino žmogaus monocitinės leukemijos ląstelių linijos (U937) gyvybingumą [49]. Oleanolio rūgštis slopino tik A549 ląstelių proliferaciją (GI50 =
33,7 µM).Elsayed ir kiti mokslininkai nustatė, kad oleanolio rūgšties GI50 krūties vėžio ląstelių linijai
4 pav. Vandeninių ir etanolinių ekstraktų GI50 A549, IRG39 ir U87 ląstelių linijoms
Iš keturiolikos tirtų rozmarinų lapų skystųjų vandeninių ir etanolinių ekstraktų, devyni veikė bent vieną vėžinių ląstelių liniją mažesne nei 5 mg/ml koncentracija. Jie geriausiai veikė IGR39 ląstelių liniją, mažiausiai – U87.
Iš vandeninių ekstraktų didžiausiu aktyvumu pasižymėjo ekstraktai R1, R2 ir R7, pagaminti ekstrakciją vykdant 10 min 50 °C temperatūroje, žaliavos – ekstrahento santykiu 1:5, 1:10 ir 1:15. Jie visas ląstelių linijas veikė 8 mg/ml ir mažesnėmis koncentracijomis (4 pav.).
Siekėme išsiaiškinti, kas galėjo nulemti atskirų ekstraktų skirtingą aktyvumą, todėl buvo atlikta ekstraktų kiekybinė analizė ESC metodu (ją atliko doktorantė U. Čižauskaitė).
Nustatyta, kad vandeniniuose ekstraktuose yra tik rozmarino rūgšties, o etanoliniuose ekstraktuose yra visų trijų rūgščių (3 lentelė). Etanoliuose ekstraktuose daugiausia išekstrahuota ursolo rūgšties, o ekstrakte R12 nustatyti didžiausi ursolo rūgšties ir oleanolio rūgties kiekiai. Etanoliniame ekstakte R10 nustatytas didžiausias rozmarino rūgšties kiekis. Vandeniniuose ekstraktuose rozmarino rūgšties koncentracija 60 ir daugiau kartų mažesnė nei etanoliniuose.
Iš vandeninių ekstraktų labiausiai vėžio ląstelių prliferaciją slopino ekstraktas R1, pagamintas naudojant žaliavos - ekstrahento santykį 1:5. Tai ir galėjo nulemti ekstrakto aktyvumą: jame nustatyta didžiausia rozmarino rūgšties koncentracija (0,0169 mg/ml). Ekstrakte R1 galėjo būti didesnis kiekis ir kitų cheminių junginių, kurie galėtų slopinti vėžio ląstelių proliferaciją, nes pati rozmarino rūgštis nepasižymi dideliu priešvėžiniu aktyvumu.
3 lentelė. Etanolinių ir vandeninių ekstraktų kiekybinė sudėtis
Vandeniniai ekstraktai R4, R5 ir R7 pagaminti ekstrahentu naudojant skirtingų pH reikšmių destiliuotą vandenį (R4 – pH 9, R5 – pH 11, R7 – pH 7), kitos gamybos sąlygos buvo identiškos (1 lentelė). Ekstraktas R7 buvo daug aktyvesnis nei R4 ir R5, jo priešvėžinis aktyvumas tirtoms ląstelėms yra 4–8 mg/ml (R4 GI50 = 12–17 mg/ml, o R5 GI50 = 17–32 mg/ml) (4 pav.). Remiantis gautais
rezultatais, galima teigti, kad didėjant ekstrahento pH reikšmei, mažėja ekstraktų priešvėžinis aktyvumas. Optimaliausia ekstrakcijai būtų naudoti vandenį, kurio pH 7.
Iš etanolinių ekstraktų didžiausiu priešvėžiniu aktyvumu pasižymėjo ekstraktai R10, R11, R12, R13, pagaminti ekstrahentu naudojant 90 proc. etanolį, ekstrakciją vykdant 10 ir 30 min, 50 °C ir 60 °C temperatūrose. Jų priešvėžinis aktyvumas (GI50) A549, IGR39 ir U87 ląstelėms yra 2,3–5,5 mg/ml.
Aktyviausias iš jų buvo ekstraktas R12, pagamintas ekstrahuojant 10 min 60 °C temperatūroje. Jis IGR39 ląstelių proliferaciją slopino 2,3 mg/ml koncentracija. Jame nustatytas didžiausias veikliųjų medžiagų kiekis: 0,625 mg/ml oleanolio rūgšties ir 1,055 mg/ml ursolo rūgšties (3 lentelė). Ursolo rūgšties ir oleanolio rūgšties koncentracija ekstraktuose didėja, keliant ekstrakcijos temperatūrą.
Ekstrakto kodas
Koncentracija (mg/ml) Rozmarino
rūgštis
Oleanolio rūgštis Ursolo rūgštis
R1 0,0169 - - R2 0,0077 - - R3 0,0055 - - R4 0,0085 - - R5 0,0079 - - R6 0,0026 - - R7 0,0076 - - R8 0,357 0,365 0,49 R9 0,4295 0,495 0,725 R10 1,0255 0,61 1,03 R11 0,5875 0,55 0,925 R12 0,5785 0,625 1,055 R13 0,5945 0,56 0,95 R14 0,9055 0,275 0,29
Padidinus temperatūrą nuo 30 °C iki 60 °C, šių junginių koncentracija padidėja net 2 kartus, todėl tikslinga ekstraktus gaminti 60 °C temperatūroje.
Etanoliniai ekstraktai buvo aktyvesni prieš tirtas vėžio ląstelių linijas, tačiau kai kurie vandeniniai ekstraktai (R1, R2 ir R7) ląstelių gyvybingumą slopino geriau nei etanoliniai. Pavyzdžiui, A549 ląstelių gyvybingumą labiausiai slopino ekstraktas R1. Mažiausiai aktyvus buvo ekstraktas R3 (5 pav.), jis už aktyviausią ekstraktą R1 veikė 15 kartų silpniau. Šis ekstraktas pagamintas ekstrakciją vykdant žemesnėje (40 °C) temperatūroje, ir tai galėjo nulemti mažesnę veikliųjų medžiagų ekstrakciją – mažesnį poveikį A549 ląstelių proliferacijai. Taip pat ekstraktas pagamintas naudojant didesnį žaliavos – ekstrahento santykį, dėl šios priežasties jame yra mažiau veikliųjų medžiagų.
5 pav. A549 ląstelių išgyvenamumo priklausomybė nuo vandeninių ekstraktų koncentracijos
Etanoliniai ekstraktai veikė IGR39 ląsteles 2,3-5,7 mg/ml koncentracijomis. Aktyviausias ekstraktas R12 (GI50 = 2,3 mg/ml) 2 kartus aktyvesnis už kitus tirtus etanolinius ekstraktus. Ekstraktai
R8, R9 ir R12 buvo pagaminti panašiomis gamybos sąlygomis (2 lentelė). Aktyviausias iš jų (6 pav.) yra ekstraktas R12, kuris pagamintas aukštesnėje temperatūroje (60 °C), tai galėjo nulemti didesnę veikliųjų medžiagų koncentraciją ir stipresnį poveikį. Mažiausiu aktyvumu pasižymi ekstraktas R8, jis pagamintas 30 °C temperatūroje. Ekstraktas R11 pagamintas ekstrahentu naudojant 90 proc. etanolį, o R14 – 70 proc. etanolį. Naudojant 90 proc. etanolį išekstrahuota daugiau veikliųjų medžiagų – oleanolio rūgšties koncentracija didesnė 2 kartus, o ursolo rūgšties – 3 kartus (3 lentelė). Dėl šios priežasties ekstraktas R11 pasižymi didesniu priešvėžiniu aktyvumu.
6 pav. IGR39 ląstelių išgyvenamumo priklausomybė nuo etanolinių ekstraktų koncentracijos
Palyginus ekstrakto R12 poveikį visoms trims vėžio ląstelių linijoms, matyti, kad jo priešvėžinis aktyvumas yra panašus prieš U87 ir IGR39 vėžinių ląstelių linijas, tačiau prieš IGR39 didesnis (GI50 = 2,3 mg/ml) (7 pav.). Šio ekstrakto aktyvumui įtakos taip pat galėjo turėti ursolo rūgšties
kiekis, nes kiekybinės analizės metu nustatyta, kad iš tirtų septynių etanolinių ekstraktų jame yra didžiausias ursolo rūgšties kiekis (1,055 mg/ml) (3 lentelė).
7 pav. A549, IGR39 irU87 ląstelių išgyvenamumo priklausomybė nuo R12 ekstrakto koncentracijos
Remiantis ląstelių išgyvenamumo priklausomybe nuo ekstraktų koncentracijos, galima teigti, kad tirti kvapiųjų rozmarinų etanoliniai ekstraktai yra aktyvesni nei vandeniniai (4 pav.). Tačiau vandeniniai ekstraktai R1 ir R2 taip pat pasižymi dideliu aktyvumu. Palyginus aktyviausio etanolinio ekstrakto R12 ir aktyviausio vandeninio ekstrakto poveikį A549 vėžio ląstelių linijai, matyti, kad vandeninis ekstraktas yra 2 kartus aktyvesnis nei etanolinis (8 pav.).
8 pav. A549 ląstelių išgyvenamumo priklausomybė nuo vandeninio (R1) ir etanolinio (R12) ekstrakto koncentracijos
Ekstraktų priešvėžiniam aktyvumui įtakos turi gamybos sąlygos. Veikliųjų medžiagų koncentracija tiesiogiai priklauso nuo ekstrahento ir žaliavos santykio. Keliant ekstrakcijos temperatūrą išekstrahuojamas didesnis veikliųjų medžiagų kiekis Ekstrakcijos laikas didelės reikšmės neturi ekstraktų priešvėžiniam aktyvumui (3 lentelė) (4 pav.).
Remiantis gautais rezultatais, galima teigti, kad rozmarino etanoliniai ir vandeniniai ekstraktai galėtų būti vartojami kaip natūrali priemonė gydyti vėžinius susirgimus ir kaip šaltinis naujų vėžinių vaistų paieškoje, todėl reikėtų atlikti detalesnius tyrimus.
3.2. Poveikis ląstelių migracijai
Rozmarinų (Rosmarinus officinalis) lapų skystųjų etanolinių ir vandeninių ekstraktų ir veikliųjų komponentų poveikis ląstelių migracijai įvertintas palyginant „žaizdos“ dydžio pokyčius. Oleanolio rūgštis ir ursolo rūgštis A549 ląstelių migraciją veikė 25–50 µM koncentracijomis. Atlikus vaizdų
analizę, matyti, kad pastarieji junginiai šiomis koncentracijomis netgi sukelia ląstelių žūtį. Pastarųjų junginių struktūra yra beveik identiška, tai ir galėjo nulemti šį išsiskiriantį poveikį ląstelėms. Ursolo rūgštis esant 25–50 µM koncentracijomis slopino ląstelių migraciją (9 pav.).
9 pav. A549 ląstelių migracijos priklausomybė nuo ursolo rūgšties koncentracijos
Oleanolio rūgštis tik esant 25 µM koncentracijai slopino A549 ląstelių migraciją (10 pav.). Kiti mokslininkai nustatė, kad esant 14 µM koncentracijai yra slopinama žmogaus krūties vėžio ląstelių migracija [50]. Todėl reikėtų atlikti detalesnius tyrimus ir įvertinti oleanolio rūgšties poveikį A549 ląstelių migracijai, panaudojant nuo 25 iki 50 µM oleanolio rūgšties koncentracijas.
Tirtų koncentracijų karnozolio ir rozmarino rūgšties tirpalai neturi slopinančio poveikio A549 ląstelių migracijai. Iš gautų duomenų matyti, kad skirtingų koncentracijų karnozolio ir rozmarino rūgšties tirpalai turi beveik identišką poveikį ląstelių migracijai, kaip ir kontrolė (0,5 proc. DMSO tirpalas) (11 ir 12 pav.)
11 pav. A549 ląstelių migracijos priklausomybė nuo karnozolio koncentracijos
12 pav. A549 ląstelių migracijos priklausomybė nuo rozmarino rūgšties koncentracijos
Iš keturių tirtų rozmarino ekstraktų, ekstraktas R1 turėjo stipriausią A549 ląstelių migraciją slopinantį poveikį, jis veikė 2,5 mg/ml koncentracija. Šis ekstraktas yra vandeninis, kiti trys tirti ekstraktai yra etanoliniai. Tai galėjo nulemti didesnį R1 ekstrakto poveikį, nes jame galėjo būti išekstrahuota didesnis kiekis ir daugiau vandenyje tirpstančių veikliųjų medžiagų, pavyzdžiui karnozolio
rūgšties, kuri pasižymi ląstelių migraciją slopinančiu poveikiu [51]. Po 48 val. inkubacijos laikotarpio daugiausiai ląstelių migravo į „žaizdos“ sritį paveiktą 1,25 mg/ml koncentracija (13 pav.).
13 pav. A549 ląstelių migracijos priklausomybė nuo ekstrakto R1 koncentracijos
Tirti etanoliniai ekstraktai (R8, R10 ir R12) stipraus migraciją slopinančio poveikio neturėjo. Ekstraktas R10 geriausiai veikė esant 1,25 mg/ml koncentracijai, o esant 5 mg/ml koncentracijai netgi aktyvino ląstelių migraciją, galbūt dėl kitų jo sudėtinių komponentų, balastinių medžiagų (14 pav.).
Palyginus neigiamos kontrolės, ursolo rūgšties ir etanolinio ekstrakto R8 poveikį A549 ląstelių migracijai, matyti, kad ekstraktas R8 neturi ląstelių migraciją slopinančio poveikio. Palyginus ursolo rūgšties ir neigiamos kontrolės poveikį, matyti ryškus skirtumas. Ląstelės paveiktos neigama kontrole pilnai migravo į „žaizdą“ po 24 val., o paveiktos ursolo rūgšties 25 µM koncentracija migravo tik po 72 val. (15 pav.). Wang ir kiti mokslininkai nustatė, kad esant 5 µM koncentracijai ursolo rūgštis slopina žmogaus storosios žarnos vėžio ląstelių linijos (SW480) migraciją į „žaizdą“. Padaryta „žaizda“ esant šiai koncentracijai „užgijo“ tik po 56 valandų [6].
0 val. 24 val. 48 val. 72 val.
K on trol ė R 8 5 mg/ ml Ursolo r ū gšti s 2 5 µM
15 pav. A549 ląstelių migracijos priklausomybė nuo ekstrakto R8 ir ursolo rūgšties koncentracijos
Poveikis IGR39 ląstelių migracijai buvo nustatytas tik su skirtingų koncentracijų ursolo rūgšties ir ekstrakto R1 tirpalais. Nustatyta, kad ekstraktas R1 esant tik 5 mg/ml koncentracijai sukelia ląstelių migraciją slopinantį poveikį (16 pav.). Ursolo rūgštis 25-50 µM koncentracijomis slopina ląstelių migraciją, o 50 µM koncentracija sukelia ir ląstelių žūtį.
0 val. 24 val. 48 val. K on trol ė R 1 5mg/ ml Ursolo r ū gšti s 50 µ M
16 pav. IGR39 ląstelių migracijos priklausomybė nuo ekstrakto R1 ir ursolo rūgšties koncentracijos
Remiantis gautais rezultatais, galima teigti, kad iš tirtų veikliųjų junginių ir ekstraktų, ursolo rūgštis ir ekstraktas R1 turi stipriausią ląstelių migraciją slopinantį poveikį, jie stipriau veikia IGR39 ląstelių migraciją. Dėl migraciją slopinančio poveikio jie galėtų būti pritaikyti kontroliuoti metastazinius vėžius. Vertėtų atlikti detalesnius tyrimus, panaudojant mažesnes ir didesnes ekstraktų ir aktyviųjų junginių koncentracijas.
3.3. Ekstraktų aktyvumo priklausomybės nuo pagrindinių komponentų kiekio
įvertinimas
Remiantis nustatytais ekstraktuose trijų veikliųjų medžiagų (rozmarino rūgšties, oleanolio rūgšties ir ursolo rūgšties) kiekiais (3 lentelė), įvertinome, kaip nuo jų galėtų priklausyti ekstraktų poveikis vėžio ląstelių proliferacijai (4 lentelė).
Remiantis koreliacijos analizės rezultatais, galima teigti, kad nei vienos iš šių medžiagų kiekis etanoliniuose ekstraktuose nekoreliuoja su jų priešvėžiniu aktyvumu A549 ląstelių linijai. Taip pat etanolinių ekstraktų priešvėžinis aktyvumas nebuvo tiesiogiai susijęs su ursolo rūgšties koncentracija.
4 lentelė. Etanolinių ir vandeninių ekstraktų GI50 priklausomybė nuo aktyviųjų komponentų koncentracijos ekstraktuose
Pearson’o koeficientas r
Aktyvieji komponentai A549 IGR39 U87
Etanoliniai ekstraktai Rozmarino rūgštis 0,09 0,20 0,64 Ursolo rūgštis -0,18 0,34 0,13 Oleanolio rūgštis 0,06 0,60 0,51 Vandeniniai ekstraktai Rozmarino rūgštis 0,86 0,76 0,60
Nustatyta vidutinė koreliacija (r = 0,60) tarp etanolinių ekstraktų priešvėžinio aktyvumo IGR39 ląstelių linijai ir oleanolio rūgšties koncentracijos ekstraktuose. Daugiausiai įtakos etanolinių ekstraktų proliferaciniam aktyvumui prieš U87 ląstelių liniją turėjo rozmarino rūgšties ir oleanolio rūgšties koncentracijos ekstraktuose. Iš gautų duomenų matyti, kad rozmarino rūgšties kiekis vandeniniuose ekstraktuose koreliuoja su ekstraktų priešvėžiniu aktyvumu visoms trims vėžinių ląstelių linijoms. Nustatyta stipri koreliacija (r = 0,76 – 0,86) tarp vandeninių ekstraktų priešvėžinio aktyvumo A549 ir IGR39 ląstelių linijoms ir rozmarino rūgšties koncentracijos ekstraktuose.
Remiantis gautais rezultatais galima teigti, kad priešvėžiniam ekstraktų aktyvumui daugiausiai įtakos galėtų turėti oleanolio ir rozmarino rūgštys. Gaminant ekstraktus, būtų vertinga jų išekstrahuoti didesnes koncentracijas. Vis dėlto, reikia turėti omenyje, kad priešvėžiniu aktyvumu gali pasižymėti ir
kiti, šiame tyrime kiekybiškai neįvertinti, ekstraktų komponentai. Be to, įvairiomis koncentracijomis ekstraktų sudėtinės medžiagos gali veikti sinergiškai ar antagonistiškai.
4. IŠVADOS
1. Kvapiųjų rozmarinų lapų skystieji vandeniniai ir etanoliniai ekstraktai pasižymi priešvėžiniu aktyvumu žmogaus melanomos, plaučių karcinomos ir glioblastomos ląstelėms: slopina jų proliferaciją ir migraciją. Dauguma ekstraktų aktyvesni prieš melanomos ląsteles, mažiausiai veikia glioblastomos ląstelių proliferaciją.
2. Dauguma etanolinių ekstraktų vėžio ląstelių proliferaciją slopina labiau nei vandeniniai, o vandeniniai ekstraktai turi didesnį migraciją slopinantį poveikį.
3. Ekstraktų pagrindinės veikliosios medžiagos turi skirtingą aktyvumą vėžio ląstelių proliferacijai ir migracijai. Ursolo rūgštis turi daugiau nei 2 kartus didesnį priešvėžinį aktyvumą nei rozmarino rūgštis, oleanolio rūgštis ar karnozolis.
4. Priešvėžiniam etanolinių ekstraktų aktyvumui daugiausiai įtakos galėtų turėti oleanolio ir rozmarino rūgščių koncentracijos. Vandeninių ekstraktų aktyvumas tiesiogiai koreliuoja su rozmarino rūgšties koncentracija.
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Kvapiųjų rozmarinų džiovintų lapų skystieji vandeniniai ir etanoliniai ekstraktai galėtų būti pritaikyti kaip natūrali priemonė gydyti vėžinius susirgimus ir panaudojami kaip šaltinis naujų vėžinių vaistų paieškoje.
Norint, kad vandeniniai ekstraktai turėtų didesnį priešvėžinį aktyvumą, optimaliausia ekstrakcijai naudoti vandenį, kurio pH 7, ekstrakciją vykdyti 10 min 50 °C temperatūroje, žaliavos – ekstrahento santykiu 1:5. Gaminant etanolinius ekstraktus optimaliausia ekstrahentu naudoti 90 proc. etanolį, ekstrakciją vykdant 10 min, 60 °C temperatūroje.
Gaminant ekstraktus, būtų vertinga išekstrahuoti didesnes koncentracijas rozmarino ir ursolo rūgščių. Taip pat priešvėžiniu aktyvumu gali pasižymėti ir kiti, šiame tyrime kiekybiškai neįvertinti, ekstraktų komponentai. Tikslinga atlikti šių ekstraktų detalesnius tyrimus, ieškant naujų aktyvių ir selektyvių priešvėžinių vaistų.
6. LITERATŪRA
1. WHO | Cancer. World Health Organization; [cited 2015 May 16]; Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/
2. WHO | Cancer mortality and morbidity. World Health Organization; [cited 2015 May 19]; Available from: http://www.who.int/gho/ncd/mortality_morbidity/cancer_text/en/
3. Torrisi JM, H. SL, Gollub MJ, Ginsberg MS, Bosl GJ, Hricak H. CT Findings of Chemotherapy- induced Toxicity: What Radiologists Need to Know about the Clinical and Radiologic Manifestations of Chemotherapy Toxicity. Radiology [Internet]. 2011;258(1):41–56. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2068622
4. Gillet J, Maria A, Varma S, Marino M, Green LJ, Vora MI, et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108(46):18708–13.
5. Efferth T, Lee S, Motoo Y, Schröder S. Acupuncture and Herbal Medicine for Cancer Patients 2014. Evidence-Based Complement Altern Med [Internet]. 2014;2014:1–2. Available from: http://www.hindawi.com/journals/ecam/2014/326179/
6. Wang J, Liu L, Qiu H, Zhang X, Guo W, Chen W, et al. Ursolic Acid Simultaneously Targets Multiple Signaling Pathways to Suppress Proliferation and Induce Apoptosis in Colon Cancer Cells. PLoS One. 2013;8(5).
7. Chinembiri TN, du Plessis LH, Gerber M, Hamman JH, du Plessis J. Review of Natural Compounds for Potential Skin Cancer Treatment. Molecules (Basel, Switzerland). 2014. 11679-11721 p.
8. González-Vallinas M, Molina S, Vicente G, Zarza V, Martín-Hernández R, García-Risco MR, et al. Expression of MicroRNA-15b and the Glycosyltransferase GCNT3 Correlates with Antitumor Efficacy of Rosemary Diterpenes in Colon and Pancreatic Cancer. PLoS One [Internet]. 2014 Jan [cited 2014 Jun 9];9(6):e98556. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24892299 9. Bernardes W a, Lucarini R, Tozatti MG, Souza MGM, Silva MLA, Filho A a DS, et al. Antimicrobial activity of Rosmarinus officinalis against oral pathogens: relevance of carnosic
acid and carnosol. Chem Biodivers [Internet]. 2010 Jul;7(7):1835–40. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20658673
10. Machado DG, Neis VB, Balen GO, Colla a, Cunha MP, Dalmarco JB, et al. Antidepressant-like effect of ursolic acid isolated from Rosmarinus officinalis L. in mice: evidence for the involvement of the dopaminergic system. Pharmacol Biochem Behav [Internet]. Elsevier Inc.; 2012 Dec [cited 2014 Sep 8];103(2):204–11. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22940588
11. Shin H-B, Choi M-S, Ryu B, Lee N-R, Kim H-I, Choi H-E, et al. Antiviral activity of carnosic acid against respiratory syncytial virus. Virol J [Internet]. 2013 Jan [cited 2014 Oct 15];10(1):303. Available from: http://www.virologyj.com/content/10/1/303
12. Moreno S, Scheyer T, Romano CS, Vojnov A a. Antioxidant and antimicrobial activities of rosemary extracts linked to their polyphenol composition. Free Radic Res. 2006;40(2):223–31. 13. González-Vallinas M, Molina S, Vicente G, de la Cueva A, Vargas T, Santoyo S, et al. Antitumor
effect of 5-fluorouracil is enhanced by rosemary extract in both drug sensitive and resistant colon cancer cells. Pharmacol Res [Internet]. Elsevier Ltd; 2013 Jun [cited 2014 Oct 15];72:61–8. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23557932
14. European Pharmacopoeia 5.0. Rosemary leaf. 2005;(1):2377–8.
15. WHO Monographs on selected medicinal plants. Folium Rosmarini. 2009;Vol.4: 296-303. 16. Rosmarinus officinalis in garden-001 - Kvapusis rozmarinas – Vikipedija [Internet]. [cited 2015
May 20]. Available from:
http://lt.wikipedia.org/wiki/Kvapusis_rozmarinas#/media/File:Rosmarinus_officinalis_in_garde n-001.jpg
17. Bicchi C, Binello A, Rubiolo P. Determination of Phenolic Diterpene Antioxidants in Rosemary ( Rosmarinus officinalis L .) with Different Methods of Extraction and Analysis. 2000;(May 1999):236–42.
18. Cuvelier M-E, Richard H, Berset C. Antioxidative activity and phenolic composition of pilot-plant and commercial extracts of sage and rosemary. J Am Oil Chem Soc. 1996;73(5):645–52.
19. Herbal F, Solid R. Assessment report on Rosmarinus officinalis L ., aetheroleum and Rosmarinus officinalis L ., folium. 2010;44(July).
20. Ulbricht C, Abrams TR, Brigham A, Ceurvels J, Clubb J, Curtiss W, et al. An evidence-based systematic review of rosemary (Rosmarinus officinalis) by the Natural Standard Research Collaboration. J Diet Suppl [Internet]. 2010;7(4):351–413. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22432564
21. Del Campo J, Amiot MJ, Nguyen-The C. Antimicrobial effect of rosemary extracts. J Food Prot. 2000;63(10):1359–68.
22. González-Vallinas M, Molina S, Vicente G, Sánchez-Martínez R, Vargas T, García-Risco MR, et al. Modulation of estrogen and epidermal growth factor receptors by rosemary extract in breast cancer cells. Electrophoresis [Internet]. 2014 Jun [cited 2014 Jun 9];35(11):1719–27. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24615943
23. Ngo SNT, Williams DB, Head RJ. Rosemary and cancer prevention: preclinical perspectives. Crit Rev Food Sci Nutr [Internet]. 2011 Dec [cited 2014 Oct 15];51(10):946–54. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21955093
24. Berrington D, Lall N. Anticancer Activity of Certain Herbs and Spices on the Cervical Epithelial Carcinoma (HeLa) Cell Line. Evid Based Complement Alternat Med [Internet]. 2012 Jan [cited
2014 Oct 15];2012:564927. Available from:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3357546&tool=pmcentrez&rendert ype=abstract
25. Yesil-Celiktas O, Sevimli C, Bedir E, Vardar-Sukan F. Inhibitory effects of rosemary extracts, carnosic acid and rosmarinic acid on the growth of various human cancer cell lines. Plant Foods Hum Nutr [Internet]. 2010 Jun [cited 2014 Oct 15];65(2):158–63. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20449663
26. Sacco C, Bellumori M, Santomauro F, Donato R, Capei R, Innocenti M, et al. An in vitro evaluation of the antibacterial activity of the non-volatile phenolic fraction from rosemary leaves. Nat Prod Res [Internet]. 2014;(December):1–8. Available from: http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/14786419.2014.986728
