VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
SIMONAS DAUNYS
HSP90 SLOPIKLIŲ IR PRIEŠVĖŽINIŲ JUNGINIŲ SINERGISTINIO
POVEIKIO ŽMOGAUS KASOS VĖŽIO LĄSTELIŲ KULTŪROSE
ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė Prof. dr. Vilma Petrikaitė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė Data
HSP90 SLOPIKLIŲ IR PRIEŠVĖŽINIŲ JUNGINIŲ SINERGISTINIO
POVEIKIO ŽMOGAUS KASOS VĖŽIO LĄSTELIŲ KULTŪROSE
ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Recenzentas
Dr. Inga Stanevičienė
Data
Darbo vadovė
Prof. dr. Vilma Petrikaitė Data Darbą atliko Magistrantas Simonas Daunys Data KAUNAS, 2018
TURINYS
SANTRAUKA ... 4
SUMMARY ... 5
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Hsp90 vaidmuo ląstelėse ... 10
1.2. Hsp90 slopikliai ... 13
1.2.1. Geldanamicino dariniai... 13
1.2.2. Purinai ir purinų analogai ... 14
1.2.3. Rezorcinolio dariniai ... 15
1.3. Hsp90 slopiklių klinikiniai tyrimai ... 17
1.4. Sinergistiniai Hsp90 slopiklių tyrimai ... 19
1.5. Priešvėžinių junginių ir hipertermijos kombinacinis poveikis ... 22
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 24
2.1. Tyrimo objektas ... 24
2.2. Reagentai ir naudojama aparatūra ... 24
2.3. Poveikio žmogaus vėžinių ląstelių gyvybingumui tyrimas ... 25
2.4. Hsp90 slopiklių ir priešvėžinių junginių kombinacinio poveikio tyrimas ... 26
2.5. Poveikio vėžio ląstelių sferoidams tyrimas ... 26
2.6. Hsp90 slopiklių ir hipertermijos sinergistinio poveikio tyrimas ... 27
2.7. Statistinis duomenų apdorojimas ... 27
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28
3.1. Tiriamųjų junginių poveikis vėžio ląstelių gyvybingumui ... 28
3.2. Hsp90 slopiklių ir priešvėžinių junginių kombinacinio poveikio tyrimas 2D kultūrose .... 29
3.3. Hsp90 slopiklių ir priešvėžinių junginių kombinacinis poveikis sferoiduose ... 33
3.4. Hsp90 slopiklių ir hipertermijos poveikis vėžio ląstelių gyvybingumui ... 38
4. IŠVADOS... 40
5. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 41
SANTRAUKA
S. Daunio magistro baigiamasis darbas „Hsp90 slopiklių ir priešvėžinių junginių sinergistinio poveikio žmogaus kasos vėžio ląstelių kultūrose įvertinimas“. Mokslinė vadovė – prof. dr. V. Petrikaitė. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Vaistų chemijos katedra. Kaunas, 2018.
Darbo tikslas – įvertinti Hsp90 slopiklių ir priešvėžinių junginių sinergistinį aktyvumą žmogaus kasos vėžio ląstelių kultūrose.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti Hsp90 slopiklių ir priešvėžinių junginių derinių poveikį žmogaus kasos vėžio ląstelių gyvybingumui.
2. Nustatyti Hsp90 slopiklių ir hipertermijos kombinacijos poveikį žmogaus kasos vėžio ląstelių gyvybingumui.
3. Nustatyti efektyviausių Hsp90 slopiklių ir priešvėžinių junginių derinių aktyvumą žmogaus kasos vėžio ląstelių sferoiduose (3D kultūrose).
Tyrimo metodai. Šiame darbe buvo tiriamas dviejų Hsp90 slopiklių (ICPD47, ICPD62) ir trijų priešvėžinių junginių (gemcitabino, 5-fluorouracilo, doksorubicino) derinių poveikis žmogaus kasos vėžio ląstelių linijų (MIA PaCa-2 ir PANC-1) 2D ir 3D kultūrose. Tiriamųjų junginių poveikis žmogaus kasos vėžio ląstelių gyvybingumui nustatytas MTT metodu po 72 val. inkubacijos, apskaičiuojant koncentracijas, sukeliančias pusę maksimalaus matuojamo efekto (EC50). Hsp90 slopiklių ir priešvėžinių junginių derinių
sinergistinis poveikis nustatytas 2D kultūrose, taikant Chou-Talalay metodą, apskaičiuojant kombinacijos indeksą (CI). Hsp90 slopiklių ir priešvėžinių junginių bei jų derinių aktyvumas kasos vėžio ląstelių 3D kultūrose nustatytas, įvertinant jų poveikį sferoidų dydžio kitimui. Hsp90 slopiklių ir hipertermijos sinergistinis poveikis nustatytas, vertinant vėžio ląstelių gyvybingumą, paveikus jas 43 ºC temperatūra, MTT metodu ir apskaičiuojant EC50 vertes.
Rezultatai. Hsp90 slopiklių grupėje didesniu aktyvumu pasižymėjo ICPD62 (EC50 vertė po 72 val.
MIA PaCa-2 ir PANC-1 ląstelių linijose buvo atitinkamai 0,45 ± 0,06 ir 0,41 ± 0,08 μM), o priešvėžinių junginių grupėje – doksorubicinas (EC50 vertė po 72 val. MIA PaCa-2 ir PANC-1 ląstelių linijose atitinkamai
0,08 ± 0,03 ir 0,07 ± 0,03 μM). Labiausiai sinergistiškai veikė ICPD47 ir gemcitabino (GEM) 1:5 derinys (CI = 0,22) MIA PaCa-2 ląstelių linijoje, o PANC-1 ląstelių linijoje – ICPD62 ir GEM 5:1 derinys (CI = 0,17). MIA PaCa-2 sferoidų augimą stipriausiai slopino ICPD47 ir 5-FU 1:5 derinys, o PANC-1 sferoidų augimą labiausiai slopino ICPD47 ir GEM 1:5 derinys. PANC-1 ląstelių linija buvo jautresnė ICPD47 ir hipertermijos poveikiui.
Išvados. Hsp90 slopikliai deriniuose su GEM santykiais 1:5 ir 5:1 veikia sinergistiškai MIA PaCa-2 ir PANC-1 kasos vėžio ląstelių linijose. ICPD47 ir 5-FU 1:5 derinys labiausiai slopina MIA PaCa-2 sferoidų augimą. ICPD47 derinyje su hipertermija pasižymi sinergistine sąveika PANC-1 ląstelių linijoje.
SUMMARY
S. Daunys Master Thesis „Evaluation of synergistic activity of Hsp90 inhibitors and anticancer agents in pancreatic cancer cell cultures“. Scientific supervisor – Prof. Dr. V. Petrikaitė. Department of Drug chemistry, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences. Kaunas, 2017.
The aim of the research was to evaluate a synergistic activity of Hsp90 inhibitors and anticancer agents in human pancreatic cancer cell cultures.
Objectives:
1. To investigate the effect of Hsp90 inhibitors and anticancer agents combinations on the viability of human pancreatic cancer cell cultures.
2. To evaluate the effect of Hsp90 inhibitors and hyperthermia combination on the viability of human pancreatic cancer cell cultures.
3. To evaluate the effect of most promising Hsp90 inhibitors’ and anticancer agents’ combinations in the human pancreatic cancer cell 3D cultures (spheroids).
Methods. There was investigated the activity of different combinations of two Hsp90 inhibitors (ICPD47 and ICPD62) and three anticancer agents (gemcitabine, 5-fluorouracil and doxorubicin) in 2D and 3D human pancreatic cancer cell (MIA PaCa-2, PANC-1) cultures. The effect of compounds on cell viability was tested using MTT assay, and EC50 values were calculated after 72 hours of incubation. The type of
combination effect was determined by calculating combination index (CI), using Chou-Talalay method. The activity of Hsp90 inhibitors, anticancer agents and their combinations in 3D pancreatic cancer cell cultures was examined by measuring the size change of spheroids. The effect of Hsp90 inhibitors’ and hyperthermias’ combination was evaluated using MTT assay after preheating cells at the 43ºC for 0.5 hours and incubation of 72 hours at 37 ºC.
Results. Among tested Hsp90 inhibitors ICPD62 had greater effect on cell viability (EC50 values
after 72 h on MIA PaCa-2 and PANC-1 were 0.45 ± 0.06 µM and 0.41 ± 0.08 µM, respectively) and among anticancer agents doxorubicin showed the greatest effect on cell viability (EC50 values after 72 h on MIA
PaCa-2 and PANC-1 were 0.08 ± 0.03 µM and 0.07 ± 0.02 µM, respectively). The ICPD47 and gemcitabine (GEM) combination with concentration ratio 1:5, showed the greatest synergistic activity in MIA PaCa-2 cell line (CI = 0.22), and the combination of ICPD62 and GEM with concentration ratio 5:1, showed the greatest synergistic activity in PANC-1 cell line (CI = 0.17). The combinations ICPD47 with 5-FU and ICPD47 with GEM in ratio 1:5 showed the greatest effect on tumour spheroid growth. ICPD47 and hyperthermia had the greatest effect on PANC-1 cells.
Conclusions. Hsp90 inhibitors in combinations with GEM act synergistically, in ratios 1:5 and 5:1, in MIA PaCa-2 and PANC-1 cancer cell lines. Also, the combination of ICPD47 and hyperthermia demonstrates synergistic activity in PANC-1 cell line.
Padėka
Dėkoju mokslinio darbo vadovei prof. dr. Vilmai Petrikaitei už suteiktą visapusišką pagalbą ir konsultacijas, prof. Daumantui Matuliui už gautus junginius ir galimybę juos tirti. Taip pat dėkoju prof. Arvydui Ūsui ir prof. Vilmantei Borutaitei už galimybę naudotis reikiama įranga bei dokt. Miglei Paškevičiūtei už pagalbą tyrimuose.
SANTRUMPOS
17-AAG 17-N-alilamino-17-demetoksigeldanamicinas17-DMAG 17-dimetilaminoetilamino-17-demetoksigeldanamicinas 5-FU 5-fluorouracilas
ADP adenozino difosfatas
ATCC Amerikos ląstelių kultūrų kolekcija (angl. American Type Culture Collection) ATP
C
adenozino trifosfatas
junginių derinio koncentracija
CI kombinacijos indeksas (angl. combination index)
DMEM Dulbecc‘o modifikuota Eagle mitybinė terpė (angl. Dulbecco's Modified Eagle
Medium)
DMSO dimetilsulfoksidas DOX doksorubicinas
EC50 fa
koncentracija, sukelianti pusę maksimalaus matuojamo efekto frakcija, paveikta junginio (ang. fraction affected)
FBS fetalinis veršiukų serumas GA geldanamicinas GEM HER2 HIP HOP gemcitabinas
žmogaus epidermio augimo faktoriaus receptorius 2 (angl.epidermal growth factor receptor 2 )
su Hsp70 sąveikaujantis baltymas (angl. Hsp70 interacting protein)
Hsp90 ir Hsp70 sujungiantis baltymas (angl. Hsp90-Hsp70 organizing protein) Hsp
Hsp40
Hsp70
Hsp90
šiluminio šoko baltymas (angl. heat shock protein)
šiluminio šoko baltymas, kurio molekulinė masė 40 kDa (angl. heat shock protein
40)
šiluminio šoko baltymas, kurio molekulinė masė yra 70 kDa (angl. heat shock
protein 70)
šiluminio šoko baltymas, kurio molekulinė masė yra 90 kDa (angl. heat shock
protein 90)
mTOR žinduolių rapamicino taikinys (angl. mammalian target of rapamycin) TS timidilatsintazė
ĮVADAS
Pasaulio sveikatos organizacijos duomenimis, vėžys yra antra pagal dažnumą mirties priežastis išsivysčiusiose šalyse. 2015 metais pasaulyje nuo vėžinių susirgimų mirė 8,8 mln. žmonių, tikėtina, kad mirčių skaičius per artimiausius du dešimtmečius išaugs iki 70 proc. [1].
Kasos vėžys yra viena agresyviausių ir didžiausiu mirtingumu pasižyminti vėžio rūšis. Diagnozavus šią ligą, penkerių metų santykinio išgyvenamumo vidurkis yra tik apie 8,5 proc. Šis rodiklis toks žemas todėl, kad liga dažniausiai diagnozuojama tik vėlyvosiose stadijose. Ankstyvosiose stadijose vėžio simptomų beveik nepastebima dėl jų nebuvimo ar panašumo į kitas ligas, be to diagnozavimą apsunkina kasos topografija [2]. Pažymėtina, kad kasos vėžys yra linkęs greitai metastazuoti į limfinę sistemą ir aplinkinius organus [3].
Kasos vėžio gydymui yra patvirtinta septyniolika vaistinių preparatų [4,5], tačiau prastėjanti mirtingumo nuo kasos vėžio statistika rodo, kad taikomas gydymas nėra efektyvus [2]. Be to, moksliniais tyrimais nustatomas vis didėjantis vėžio atsparumas gemcitabinui ir 5-fluorouracilui, kurie yra pagrindiniai chemoterapiniai preparatai [6]. Norint pagerinti pacientų išgyvenamumą, tarpusavyje derinami skirtingo veikimo mechanizmo priešvėžiniai preparatai, tačiau ir toks gydymas dažnai yra neefektyvus [7]. Todėl yra poreikis kurti naujus junginius, turinčius kitokius veikimo mechanizmus, kuriais būtų galima gydyti kasos vėžį ir gydymui atsparias šio vėžio formas.
Tyrimais nustatyta, kad šiluminio šoko baltymas Hsp90 yra itin svarbus vėžinių ląstelių gyvybinėms funkcijoms palaikyti, nes prisijungdamas prie ląstelės baltymų juos stabilizuoja ir apsaugo nuo degradacijos stresinėmis sąlygomis [8]. Vėžinės ląstelės šio baltymo gamina daugiau, todėl jos yra jautresnės jo slopinimui [9]. Moksliniais ir klinikiniais tyrimais nustatyta, kad Hsp90 slopikliai pasižymi stipriu poveikiu gydant vėžinius susirgimus, o juos vartojant derinuose su priešvėžiniais vaistais lėčiau vystosi atsparumas jiems [9,10].
Hsp90 slopiklių bei jų kombinacijų su kitais priešvėžiniais junginiais poveikis plačiai tiriamas įvairiose vėžinių ląstelių linijose, tačiau tyrimų, kuriais nustatomas Hsp90 slopiklių ir priešvėžinių junginių sinergistinis poveikis kasos vėžio ląstelių linijose, kiekis yra ribotas, o patys tyrimai dažnai atliekami paviršutiniškai, nes netiriami skirtingi junginių santykių deriniai. Šiuo tyrimu siekta įvertinti pasirinktų Hsp90 slopiklių ir kasos vėžio gydymui taikomų priešvėžinių junginių bei Hsp90 slopiklių ir hipertermijos sinergistinį poveikį dviejose kasos vėžio ląstelių linijose, pasižyminčiose skirtingu genotipu, fenotipu bei atsparumu gemcitabinui.
DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – įvertinti Hsp90 slopiklių ir priešvėžinių junginių sinergistinį aktyvumą žmogaus kasos vėžio ląstelių kultūrose.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti Hsp90 slopiklių ir priešvėžinių junginių derinių poveikį žmogaus kasos vėžio ląstelių gyvybingumui.
2. Nustatyti Hsp90 slopiklių ir hipertermijos kombinacijos poveikį žmogaus kasos vėžio ląstelių gyvybingumui.
3. Nustatyti efektyviausių Hsp90 slopiklių ir priešvėžinių junginių derinių aktyvumą žmogaus kasos vėžio ląstelių sferoiduose (3D kultūrose).
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1.
Hsp90 vaidmuo ląstelėse
Hsp90 – tai šiluminio šoko baltymas (angl. heat shock protein), kurio masė yra 90 kDa. Jis priklauso šaperoninių baltymų klasei ir yra labai svarbus ląstelės homeostazei palaikyti [11]. Šis baltymas yra atsakingas už tinkamą naujai pagamintų ar denatūruotų baltymų „sulankstymą“, juos apsaugo nuo agregacijos ar denatūracijos bei stabilizuoja jų aktyvumą stresinėmis sąlygomis [11,12].
Normaliomis sąlygomis Hsp90 sudaro 1-2 proc. visų baltymų ląstelėje, o patiriant stresą šio baltymo ekspresija padidėja keletą kartų [13,14]. Šis baltymas turi keturias izoformas: Hsp90α ir Hsp90β aptinkamos citoplazmoje, Grp94 – endoplazminiame tinkle, o Trap-1 – mitochondrijose [13,15]. Pagrindinės citoplazmos izoformos,Hsp90α ir Hsp90β, tarpusavyje yra labai panašios, tačiau skiriasi jų ekspresuojami kiekiai bei funkcijos stresinėmis sąlygomis [11,13,16]. Hsp90α svarbus ląstelės apsauginiams procesams ir į atsaką reaguoja greitai, o Hsp90β į atsaką reaguoja lėčiau ir dalyvauja ląstelės prisitaikymo procesuose [11,16].
1 pav. Hsp90 struktūra: N domenas (N), M domenas (M) ir C domenas (C) [18]
Hsp90 struktūroje išskiriamos trys dalys (1 pav.): N domenas, vidurinis domenas ir C galo domenas [17,18]. N domene suformuojama „kišenė“, prie kurios jungiasi adenino nukleotidai (ATP/ADP), svarbūs šio baltymo aktyvacijai [17-20]. Taip pat šioje vietoje jungiasi Hsp90 slopinantys junginiai [17–21]. M domene nustatyta stipriai hidrofobinė sritis, kuri itin svarbi „klientinių“ baltymų prisijungimui [17]. Taip pat ši sritis sąveikauja su ATP, kuris prisijungia γ-fosfatą N domene [17,18].
C domeno struktūra sudaryta iš keturių glaudžiai susispaudusių α spiralių [17]. Ši sritis reikalinga Hsp90 dimerizacijai. Be to, Hsp90 veikimo ciklo metu šioje srityje jungiasi košaperonai [17,22].
2 pav. Hsp90 veikimo mechanizmo schema [11]
Hsp90 veikimo mechanizmas yra cikliškas (2 pav.). Ciklo pradžioje, Hsp90 ir ADP kompleksas yra atviros konformacijos, komplekso viduje ties M domenu suformuojama kišenė. Prie šio komplekso per Hsp90 ir Hsp70 sujungiantį baltymą (HOP, angl. Hsp90-Hsp70 organizing protein) jungiasi košaperonų Hsp70, Hsp40 ir su Hsp70 sąveikaujančio baltymo (HIP, angl. Hsp70 interacting protein) bei dalinai sulankstyto baltymo kompleksas. Hsp90 aktyvuojamas fosforilinant ADP. Tada košaperonų kompleksas atsijungia nuo C domeno, ir prie M domeno prisijungia „klientinis“ baltymas, o Hsp90 užsiveria. Hsp90 struktūra stabilizuojama, prisijungus baltymui p23. Tuomet pradedamas klientinio baltymo lankstymas. Ciklo pabaigoje „klientinis“ baltymas ir p23 atsijungia, o prie Hsp90 vėl jungiasi ADP ir ciklas pradedamas iš naujo [11].
Hsp90 yra atsakingas už daugiau nei 300 „klientinių“ baltymų stabilizavimą ir aktyvavimą [23,24]. Šis baltymas padeda kontroliuoti ląstelės gyvybines funkcijas bei generuoti įvairius atsakus į išorinius ląstelės dirgiklius. Pavyzdžiui, šis baltymas padeda vaisinei muselei Drosophila melanogaster išgyventi tokioje aplinkoje, kuriai būdingi pastovūs temperatūros šuoliai [8]. Parazitiniams pirmuonims, tokiems kaip Plasmodium falciparum, Hsp90 baltymas leidžia sėkmingai prisitaikyti prie gyvenimo ciklo, keičiant skirtingus šeimininkus-nešiotojus bei lengvai adaptuotis prie besikeičiančių aplinkos sąlygų [8]. Taip pat šis baltymas yra itin svarbus vėžio ląstelėms. Jis padeda ląstelėms prisitaikyti prie
įvairių stresinių sąlygų, tokių kaip mitybinių medžiagų trūkumo, proteotoksinio streso (3 pav.), genetinio nestabilumo ar net organizmo imuninio atsako [8,23].
3 pav. Hsp90 reikšmė vėžio ląstelėms [8]
Padidėjusi Hsp90 ekspresija siejama su melanomos, krūties, plaučių, skrandžio ir žarnų vėžio progresavimu [25,26]. Geriausiai žinomi Hsp90 „klientiniai“ baltymai yra mutavęs žmogaus epidermio augimo faktoriaus receptorius (HER2), mutavęs epidermio augimo faktorius, BCR-ABL susijungimo baltymas, serino-treonino baltymų kinazė, c-MET ir steroidinių hormonų receptoriai, kurie yra svarbūs daugelio vėžinių ligų progresavimui ir gyvybingumui [25,26]. Užslopinus Hsp90 vėžio ląstelėse, sumažėja onkogeninių klientinių baltymų (pvz., mutavusių kinazių) kiekis, tuomet blokuojami įvairūs vėžio vystymosi keliai: slopinama ląstelių proliferacija, skatinama apoptozė, slopinama angiogenezė bei mažėja ląstelių invaziškumas.
Vėžio ląstelės yra labiau priklausomos nuo Hsp90 funkcijos nei sveikos ląstelės, todėl jos yra jautresnės šio baltymo slopinimui. Kadangi Hsp90 slopinimas vienu metu veikia į kelis skirtingus vėžinių signalų kelius, šis baltymas yra patrauklus taikinys vėžinių ligų gydyme.
1.2.
Hsp90 slopikliai
Per pastaruosius du dešimtmečius smarkiai padidėjo mokslininkų ir farmacijos pramonės susidomėjimas Hsp90 slopikliais, pritaikant juos įvairių vėžinių ligų terapijoje. Hsp90 slopikliai pasižymi didesniu selektyvumu vėžio ląstelėms, dėl didesnės šio baltymo ekspresijos jose. Taip pat pastebėta, kad šie junginiai yra linkę kauptis vėžiniame audinyje, o iš centrinės kraujotakos ir sveikų audinių greitai pašalinami [27,28]. Be to, Hsp90 baltymo slopinimas kartu blokuoja kelis vėžinių signalų perdavimo kelius, todėl jie yra veiksmingi prieš vėžio ląsteles, atsparias preparatams, slopinantiems tik vieną vėžinių signalų kelią, pvz., mTOR slopikliams [27]. Dėl šios priežasties Hsp90 slopikliai gali būti pritaikyti atsparių vaistams vėžio formų terapijoje.
Šiuo metu sparčiai auga junginių, slopinančių Hsp90 šaperoninį baltymą, skaičius, atliekama daugybė ikiklinikinių tyrimų, mažiausiai trylika junginių pateko į klinikinius tyrimus. Tolimesniuose poskyriuose apžvelgiamos pagrindinės Hsp90 slopiklių grupės bei jų struktūros ypatumai.
1.2.1. Geldanamicino dariniai
Geldanamicinas (GA) – pirmasis natūralus junginys, gebantis slopinti Hsp90 šaperoninį baltymą. Tai natūralus ansamicino grupės antibiotikas, pirmą kartą išgautas iš Streptomyces
hygroscopicus 1970 metais [29].
Pirmasis GA Hsp90 slopinantis poveikis buvo aprašytas Whitesell ir kitų autorių tyrime 1994 metais. Šie mokslininkai pastebėjo, kad junginys tiesiogiai jungiasi prie Hsp90 ir sutrikdo Hsp90 ir klientinio baltymo komplekso susidarymą [30]. Vėliau nustačius kristalinę struktūrą buvo pastebėta, kad GA konkuruoja su ATP dėl prisijungimo prie N domeno ir taip slopina ATPazės aktyvumą [29]. GA pasižymi priešvėžiniu poveikiu in vitro ir in vivo, tačiau dėl didelio hepatotoksiškumo (dėl chinono žiedo struktūroje) (4 pav.) nebuvo pritaikytas klinikinėje praktikoje [25]. Vis dėlto, modifikavus GA struktūrą, buvo sukurti mažiau toksiški analogai, kurie sėkmingai pateko į klinikinius tyrimus.
Tanespimicinas arba 17-AGG buvo gautas iš GA, pakeitus chinono žiedo C-17 metoksigrupę į propilenamino grupę (4 pav.). Šis struktūrinis pakitimas ne tik išlaikė didelį junginio priešvėžinį aktyvumą, bet ir sumažino toksiškumą. Tačiau šis junginys pasižymėjo prastu tirpumu vandenyje ir mažu stabilumu. Pagrindinis šio junginio trūkumas – benzochinono fragmentas 17-AGG struktūroje, kuris prieš jungiantis su Hsp90, turi būti redukuotas chinono reduktazės. Taip pat ši struktūrinė grupė lemia didelį hepatotoksiškumą [25]. Taigi, 17-AAG pritaikymą klinikinėje praktikoje riboja mažas biopasisavinimas, nestabilumas ir didelis hepatotoksiškumas.
4 pav. Geldanamicino grupės Hsp90 inhibitorių struktūros
Alvespimicinas arba 17-DMAG (4 pav.) buvo antrasis Hsp90 inhibitorius, patekęs į klinikinius tyrimus. Alvespimicinas pasižymi geresnėmis farmakokinetinėmis savybėmis ir sukelia mažiau šalutinių poveikių nei 17-AAG [25,27]. Šis junginys buvo gautas pakeitus C-17 metoksigrupę GA struktūroje į N,N-dimetilaminogrupę. Toks modifikavimas pagerino junginio tirpumą vandenyje ir padidino aktyvumą, lyginant su 17-AAG [27,29]. Nors šis junginys pasižymėjo silpnesniu toksiniu poveikiu nei 17-AAG, tolimesnis jo plėtojimas buvo nutrauktas dėl per mažo efektyvumo in vivo [13].
Retaspimicinas, arba IPI-504, (4 pav.) yra tirpus vandenyje hidrochinono hidrochlorido druskos darinys, gautas iš 17-AAG. Šio junginio hidrochinono grupė egzistuoja redokso pusiausvyroje su chinono grupe, todėl yra mažiau linkęs oksiduotis [25,29,31].
GA dariniai pasižymi dideliu priešvėžiniu aktyvumu, bet dėl per didelio toksiškumo, jų, kaip priešvėžinių junginių, tolimesnis plėtojimas yra nutrauktas. Tačiau tai leido sukurti naujus sintetinius Hsp90 slopiklius.
1.2.2. Purinai ir purinų analogai
Sintetinių Hsp90 slopiklių kūrimas tapo įmanomas, kai buvo nustatytos Hsp90 baltymo ir ATP/ADP bei GA ir radisikolio kompleksų kristalinės struktūros. Tada buvo sukurti mažos struktūros
junginiai, gebantys imituoti nukleotidų prisijungimą prie Hsp90 [32]. Pirmasis sintetinis junginys, savo struktūroje turintis purino fragmentą ir gebantis jungtis pire Hsp90 N domeno, buvo PU3 [32,33].
PU3 tapo purinų klasės Hsp90 slopiklių pagrindu. Pakeitus ar prijungus įvairias grupes, buvo gauti nauji junginiai, pasižymintys didesniu aktyvumu, selektyvumu vėžio ląstelėms bei geresnėmis farmakokinetinėmis savybėmis [29]. Į klinikinius tyrimus sėkmingai pateko junginiai CNF2024/BIIB021, PU-H71 ir Debio 0923 (5 pav.). Visos šios molekulės turi aminogrupę, prijungtą prie purino ar panašaus į puriną junginio branduolio, ir per 5Å nuo jo nutolusią arilogrupę. Amino ir arilo grupės yra svarbios sudaryti ryšius tarp Hsp90 N domeno ir junginio [29].
CNF2024/BIIB021 (5 pav.) pirmą kartą buvo susintetintas ConformaTherapeutics laboratorijoje [32]. Šio junginio struktūra išsiskiria tuo, kad arilo grupė prijungta prie C-9 purino žiede, o aminogrupė perkelta prie C-2, kad būtų išlaikytas svarbus 5Å atstumas.
5 pav. Purinų grupės Hsp90 slopikliai
PU-H71 (5 pav.) – dar vienas purinų klasės Hsp90 inhibitorius. Jis buvo sukurtas modifikuojant PU3 ir pasižymi geru tirpumu bei dideliu specifiškumu N domenui [38]. Moksliniuose tyrimuose buvo nustatytas šio junginio priešvėžinis aktyvumas krūties vėžio ląstelių linijoms. Šiuo metu vyksta du I fazės klinikiniai tyrimai su pacientais, kuriems diagnozuotas solidinis navikas ir limfoma [38].
Purinų grupės junginiai pasižymi mažesniu priešvėžininiu aktyvumu nei GA dariniai, tačiau dėl geresnių farmakokinetinių savybių ir mažesnio toksiškumo, jų klinikiniai tyrimai vis dar tęsiami.
1.2.3. Rezorcinolio dariniai
Radisikolis (6 pav.) – makrociklinis laktono grupės antibiotikas, pirmą kartą išskirtas 1953 metais iš Monosporium bonorden grybelio [32]. Radisikolis savo struktūroje turi rezorcinolio grupę, reaktyvų epoksido tiltelį ir nesočiąsias α, β, γ, δ karbonilų grupes. Radisikolis yra nestabilus
plazmoje ir yra neaktyvus in vivo. Nauji Hsp90 slopinantys junginiai, turintys savo struktūroje rezorcinolio fragmentą, pasižymi dideliu aktyvumu in vitro ir in vivo. NVP-AUY922 ir STA-9090 yra labiausiai tiriami klinikiniuose tyrimuose rezorcinolio dariniai [29,32,40].
6 pav. Rezorcinolio dariniai
STA-9090 (6 pav.) yra rezorcinolio fragmentą turintis triazolo junginys, pasižymintis didesniu priešvėžiniu aktyvumu, geresne skvarba į patį naviką, ir mažesniu toksiškumu nei 17-AAG [40]. Šis junginys pateko į klinikinius tyrimus su pacientais, kuriems diagnozuoti hematologiniai vėžiniai susirgimai bei pažengusios navikų formos [40]. Lyginant su kitais Hsp90 slopikliais, STA-9090 yra gana gerai toleruojamas pacientų, nesukelia žymių regos sutrikimų bei nepasižymi dideliu toksiškumu širdies, kepenų ir inkstų sistemoms.
NVP-AUY922 (6 pav.) yra izoksazolo-rezorcinolio darinys, pasižymintis itin dideliu selektyvumu Hsp90 [11,41]. Šio junginio selektyvumas Hsp90 yra 5 kartus didesnis nei kitiems šios šeimos baltymams, tokiems kaip GRP94 ar TRAP-1, ir 50 kartų didesnis, palyginus su nuo ATPazių priklausomomis kinazėmis [41]. Šis junginys nėra metabolizuojamas CYP3A4 ar NQ01 fermentų, todėl didesnės jo koncentracijos išlieka vėžio ląstelėse [11]. AUY922 efektyviai slopina ląstelių proliferaciją, ląstelių vystymąsi, vėžinių ląstelių invaziškumą ir angiogenezės procesus skirtingose vėžio ląstelių linijose [11,41].
ICPD47 ir ICPD62 yra Lietuvoje, Biotechnologijos institute, susintetinti Hsp90 slopikliai. Šių junginių struktūrai taip pat būdingas rezorcinolio fragmentas (6 pav.) bei tiadiazolo struktūra, svarbi jungimuisi prie Hsp90 N domeno [42]. Šie junginiai pasižymi skirtingu priešvėžiniu aktyvumu: ICPD62 yra apie dešimt kartų aktyvesnis. Mokslininkai nustatė šių junginių fizikines savybes, stabilumą bei
įvertino jų aktyvumą in vitro prieš žmogaus storosios žarnos vėžio HCT116, osteosarkomos U2OS ir gimdos kaklelio vėžio HeLa ląstelių linijas. [42]. Taip pat nustatyta, kad šie junginiai jungiasi prie Hsp90 stipriau nei pirmos kartos slopikliai (17-AAG).
Rezorcinolio grupės slopikliai pasižymi didesniu aktyvumu nei kitos struktūros Hsp90 slopikliai. ICPD grupės junginiai nebuvo tirti deriniuose su priešvėžiniais junginiais, todėl buvo nuspręsta atlikti sinergistinius jų tyrimus su skirtingą veikimo mechanizmą turinčiais priešvėžiniais junginiais.
1.3.
Hsp90 slopiklių klinikiniai tyrimai
Po GA atradimo buvo sukurta įvairios struktūros junginių, kurie pasižymi skirtingomis fizikocheminėmis savybėmis ir skirtingu aktyvumu vėžio ląstelėms. 2007-2008 metais buvo pasiektas Hsp90 slopiklių vystymo pikas (7 pav.), kai buvo sukurti keturi itin aktyvūs junginiai, kurie pateko į trisdešimt skirtingų klinikinių tyrimų, kaip monoterapiniai priešvėžiniai junginiai arba deriniuose su priešvėžiniais junginiais [43].
7 pav. Klinikinių tyrimų su Hsp90 slopikliais raida. X ašyje nurodyti junginiai bei metai, kada junginiai pateko į klinikinius tyrimus. Junginiai, kurių klinikinių tyrimų skaičius nenurodytas, reiškia,
kad klinikiniai tyrimai buvo nebaigti ar nutraukti [43].
Remiantis JAV Nacionalinio sveikatos instituto klinikinių tyrimų tinklapiu (www.clinicaltrials.gov), 2018 m. vasario mėn. buvo užregistruoti aštuoniasdešimt dveji įvairios stadijos klinikiniai tyrimai, kuriuose yra vertinamas Hsp90 slopiklių poveikis pacientams, sergantiems įvairiais vėžiniais susirgimais. I-II fazės klinikiniuose tyrimuose yra nustatytas mažiausiai penkiolikos skirtingų
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 1 7 -AAG 1 7 -D M AG IPI5 04 BII B0 2 1 NVP-AU Y9 2 2 KW2 4 7 8 SNX54 2 2 BII B0 2 8 IPI4 93 STA9 0 9 0 XL 8 8 8 AT1 3 3 8 7 HSP99 0 M P C3 1 0 0 D eb io0 9 32 PU-H 7 1 DS22 4 8 1999 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 A tli ek am ų k lini ki ni ų ty rim ų sk ai či us
struktūrų Hsp90 slopiklių efektyvumas, vartojant juos kaip monoterapinius junginius ar deriniuose su priešvėžiniais junginiais (1 lentelė). Beveik trečdalis Hsp90 slopiklių klinikinių tyrimų buvo sustabdyta ar nutraukta dėl nustatyto nepakankamo efektyvumo arba pernelyg didelio toksiškumo, lyginant su klinikinėje praktikoje vartojamais junginiais. Be to, pastebėta, kad dauguma Hsp90 slopiklių sukelia regos pažeidimus [8,40]. Šių junginių sukeliamas toksiškumas akims yra viena iš priežasčių, kuri riboja jų tyrimus tolimesnėse klinikinių tyrimų stadijose.
1 lentelė. Hsp90 slopiklių klinikiniai tyrimai bei nustatytas jų efektyvumas vėžiniams susirgimams [remtasi www.clinicaltrials.gov].
Tyrimo fazė Nustatytas aktyvumas
Geldanamicino analogai
17-AAG I-II (vienas ar kombinacijoje su bortezomibu ar gemcitabinu)
HER-2 teigiamas krūties vėžys, mieloma
17-DMAG I Ūminė limfoblastinė anemija, prostatos
vėžys, melanoma, HER2 teigiamas krūties vėžys, kiaušidžių vėžys
IPI-504 I-III (vienas ar kombinacijoje su trastuzumabu ar paklitakseliu)
Nesmulkialąstelinis plaučių vėžys,
skrandžio ir žarnų vėžys, HER2 teigiamas krūties vėžys
IPI-493 I Nenustatytas
Rezorcinolio dariniai
STA-9090 I-III (vienas ar kombinacijoje su docetakseliu)
Tiesiosios žarnos vėžys, melanoma, nesmulkialąstelinis plaučių vėžys, lėtinė mieloidinė leukemija
NVP-AUY922 I-II (vienas ar kombinacijoje su erlotinibu, kapecitabinu,
trastuzumabu)
HER2 teigiamas krūties vėžys, nesmulkialąstelinis plaučių vėžys AT-13387 I-II (vienas ar kombinacijoje su
imatinibu)
Skrandžio ir žarnų vėžys KW-2478 I-II (kombinacijoje su
bortezomibu)
Dauginė mieloma
Purino analogai
BIIB021 I-II Lėtinė kimfocitinė leukemija,
HER2 teigiamas krūties vėžys
MPC-3100 I Nenustatytas
Debio 0932 I-II Nesmulkialąstelinis plaučių vėžys
PU-H71 I-II Limfoma
Kitos struktūros junginiai
SNX-5422 I Nenustatytas
DS-2248 I Nenustatytas
Šiuo metu yra tik du junginiai, kurie pateko į trečiąją klinikinių tyrimų stadiją, tai – IPI-504 ir STA-9090 (1 lentelė). Abu šie junginiai nesukelia arba sukelia nežymų, grįžtamojo pobūdžio toksiškumą akims. Be to, pasižymi dideliu efektyvumu ir nedideliu toksiškumu žmogaus organų sistemoms, lyginant su kitais priešvėžiniais preparatais [40].
Atliktų Hsp90 slopiklių klinikinių tyrimų rezultatai rodo, kad šių junginių pritaikymas monoterapijai klinikinėje praktikoje yra mažai tikėtinas. Tačiau yra nustatyta, kad slopikliai, deriniuose su priešvėžiniais junginiais, gali pagerinti pastarųjų priešvėžinį aktyvumą bei mažinti vėžio ląstelių atsparumą jiems.
1.4.
Sinergistiniai Hsp90 slopiklių tyrimai
Vaistų deriniai dažniausiai taikomi vėžio ir AIDS gydyme. Vaistų derinių sinergistinis poveikis didina junginių terapinį efektyvumą, leidžia sumažinti junginių dozes bei toksiškumą, lyginant su pavieniais junginiais. Taip pat pasireiškiant sinergistiniam poveikiui ląstelės lėčiau įgauna atsparumą junginiams [44].
Sinergistiniam poveikiui nustatyti dažniausiai naudojamas Chou-Talalay metodas, kai vaistų kombinacijų poveikio tyrimų metu apskaičiuojamas kombinacijos indeksas (CI). Chou-Talalay metodas tiksliausiai įvertina vaistų kombinacijos sąveikos tipą, apskaičiuojant CI. Kai CI < 1, nustatoma sinergistinė sąveika, kai CI = 1, pasireiškia adityvinis poveikis, kai CI > 1 – pasireiškia antagonistinė sąveika [44,45]. Šis metodas paremtas fizikocheminiais dėsniais ir nustato tik junginių sąveiką derinyje, bet ne sąveikos mechanizmą.
Atliekant Hsp90 slopiklių tyrimus in vitro ir in vivo deriniuose su priešvėžiniais junginiais, tokiais kaip taksanai, cisplatina, gemcitabinas, citarabinas ir kiti, dauguma atveju buvo nustatytas sinergistinis ar adityvinis poveikis (2 lentelė). Tačiau negalima teigti, kad visų šių tyrimų duomenys tikrai nusako vaistų kombinacijų sinergistinę sąveiką. Sinergistiniai tyrimai yra sudėtingi ir norint nustatyti sąveiką, pirmiausia reikia nustatyti atskirų tiriamųjų junginių poveikį, po to nustatyti junginių derinių skirtingais santykiais poveikį, ir tik tada skaičiuojamas CI taikant Chou-Talalay metodą [44]. Mokslininkai dažnai junginių sinergistiniam poveikiui įvertinti taiko statistinį junginių derinio ir pavienių junginių poveikių palyginimą, ir tai yra viena iš dažniausiai pasitaikančių klaidų. Kita klaida sinergistiniuose tyrimuose yra tai, kad mokslininkai tiria tik kelių konkrečių koncentracijų junginių derinius. Kad būtų tinkamai nustatyta sąveika, tyrimo metodas reikalauja junginių kombinacijoje
palaikyti fiksuotą junginių koncentracijų santykį, nes kombinacija veikia kaip naujas junginys ir jis turi būti pastovios sudėties [44].
2 lentelė. Hsp90 slopiklių ir priešvėžinių vaistinių junginių derinių sąveikos [46-50]. Hsp90
slopiklis
Priešvėžinis junginys kombinacijoje
Sąveika Vėžio ląstelių linija
STA-9090, 17-AAG
Cisplatina Sinergistinė Storosios žarnos vėžio ląstelės (HCT116)
Radisikolis Cisplatina, oksaliplatina
Sinergistinė Storosios žarnos vėžio ląst.
STA-9090 Cisplatina Sinergistinė Neuroblastomos, osteosarkomos ląstelės 17-AAG Taksolis Sinergistinė Krūties vėžio ląstelės (BT-474)
17-AAG Bortezomibas Sinergistinė Krūties vėžio ląstelės (MCF-7)
17-AAG Imatinibas Sustiprinta Leukemija (CMF)
17-AAG Gemcitabinas Padidina
jautrumą
Kiaušidžių navikas, mieloidinės leukemijos ląstelės
17-AAG Citarabinas Sinergistinė Leukemijos vėžio ląstelės 17-AAG Doksorubicinas Sinergistinė Krūties vėžio ląstelės
Radicikolis Emuninas Padidina
jautrumą
Mielomos ląstelės
STA-9090 Etoposidas Sinergistinė Storosios žarnos vėžinės ląstelės (HCT116)
17-AAG Imatinibo mesilatas Sustiprinta Leukemijos ląstelės NVP-AUY922 Doksorubicinas Sinergistinė Mielomos ląstelės NVP-AUY922 Trametinibas Padidina
jautrumą
Nesmulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelės
STA-9090 Taksanai Sinergistinė Nesmulkialąstelinio plaučių vėžio ląst. STA-9090 5-Fluoruracilas Sinergistinė Storosios žarnos vėžio ląst. (HCT116)
Daugiausia sinergistinių tyrimų atlikta storosios žarnos vėžio, krūties vėžio, nesmulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelėse su 17-AAG, NVP-AUY922 ir įvairių priešvėžinių junginių deriniais. Mokslinėje literatūroje trūksta duomenų apie sinergistinius tyrimus kasos vėžio ląstelėse, su Hsp90 slopiklių ir kasos vėžio gydyme,vartojamų junginių: GEM, 5-FU ir DOX, deriniais.
GEM – priešvėžinis chemoterapinis vaistas, priskiriamas pirimidinų antimetabolitų klasei. Šis vaistas pasižymi dideliu efektyvumu gydant kasos, krūties, kiaušidžių, nesmulkialąstelinį plaučių ir šlapimo pūslės vėžį [51]. GEM yra sukurtas kaip provaistas – tai reiškia, kad pats savaime nėra aktyvus. Šis junginys aktyvinamas, tik patekęs į ląstelę intraląstelinio fosforilinimo būdu [52]. GEM patekus į organizmą, jis į ląsteles trasportuojamas nukleozidų transporteriais. Pirmiausia jis fosforilinamas fermento deoksicitidinkinazės į gemcitabino monofosfatą. Tada fosforilinamas iki gemcitabino difosfato ir gemcitabino trifosfato, veikiant nukleozidų monofosfato ir difosfato kinazėms [52]. GEM citotoksinis poveikis pasireiškia dėl DNR sintezės slopinimo, kai į naują DNR giją yra įterpiamas aktyvus gemcitabino trifosfatas [52].
Hubbard ir kolegos nustatė gemcitabino ir Hsp90 slopiklio 17-AAG kombinacijos poveikį, atlikdami tyrimus su pacientais, kuriems diagnozuoti gydymui atsparūs solidiniai navikai [53]. Gauti tyrimo rezultatai parodė, kad 17-AAG sustiprina GEM poveikį [53]. Yra duomenų, kad vartojant šią kombinaciją, sumažėja gemcitabino toksinis poveikis dėl 17-AAG citoprotekcinio poveikio ląstelėms [29]. Tačiau šis tyrimas, nepateikia duomenų apie 17-AAG ir GEM sinergistinę sąveiką, nes nebuvo skaičiuojamas CI [53].
Doksorubicinas (DOX) – priešvėžinis vaistas, priskiriamas antraciklinų antibiotikų grupei [51]. DOX taikomas gimdos kaklelio, krūtų, plaučių, kasos, skrandžio, storosios žarnos ir daugeliui kitų rūšių vėžiniams susirgimams gydyti [54,55]. Gerai žinomi yra du DOX veikimo mechanizmai: (I) DOX įsiterpia tarp išsivyniojusių DNR grandžių prieš DNR replikaciją, dalyvaujant fermentui topoizomerazei, ir taip slopina DNR replikaciją; (II) taip pat susidaro laisvieji radikalai, kurie pažeidžia ląstelių membranas, DNR ir baltymų struktūras [54,55].
Kaiser ir kolegos, taikydami Chou-Talalay metodą, nustatė DOX ir NVP-AUY922 sinergistinę sąveiką mielomos ląstelėse [47]. Tyrimo metu buvo nustatyta sinergistinė sąveika (CI < 0,85) RPMI-8226 ląstelėse, naudojant didesnes junginių koncentracijas derinyje, bei adityvinė sąveika OPM-2 ląstelėse (0,9 < CI < 1,1) [47]. Šiuo tyrimu nustatyta NVP-AUY922 derinyje su DOX, labiau slopina vėžio ląstelių augimą ir gyvybingumą bei labiau skatina ląstelių apoptozę, lyginant su pavieniais preparatais [47].
5-Fluorouracilas (5-FU) yra priešvėžinis junginys, priskiriamas antimetabolitų klasei, uracilo analogas [56]. Šis junginys ypač efektyvus gydant krūties, galvos ir kaklo vėžius [57]. Patekęs į organizmą, 5-FU yra metabolizuojamas į aktyvius metabolitus, kurie ir nulemia citotoksinį junginio poveikį. Fluorodeoksiuridino monofosfatas slopina timidilatsintazę (TS) ir mažina deoksinukleotidų stabilumą bei pažeidžia DNR, o fluorodoeksiuridino trifosfatas yra įterpiamas į DNR ir RNR struktūras ir trikdo normalų nukleinių rūgščių metabolizmą [56].
Lee ir kiti mokslininkai vertino 5-FU ir NVP-AUY922 sinergistinę sąveiką žmogaus skrandžio vėžio ląstelėse [58]. Jų tyrimo metu, naudojant skirtingas skrandžio vėžio ląstelių linijas, buvo taikomas Chou-Talalay metodas, ir nustatyta sinergistinė sąveika, kai CI < 1 [58].
Kitame tyrime Liu mokslininkų komanda įvertino Hsp90 slopiklio SNX-2112 ir 5-FU sinergistinę sąveiką stemplės vėžio ląstelėse. Taikant Chou-Talalay metodą, mokslininkai nustatė stiprią antagonistinę sąveiką tarp šių junginių. Tyrimo metu nustatytos CI reikšmės buvo didesnės nei 1, o kai kuriais atvejais didesnės nei 2 [59]. Antagonistinė sąveika buvo susijusi su ląstelių augimo slopinimu, ląstelės G2/M ciklo sustabdymu, nuo kaspazės priklausoma apoptoze ir Hsp90 klientinių baltymų ekspresija, tikslesnis junginių sąveikos mechanizmas nenustatytas [59].
Apibendrinant galima teigti, kad kai kurie Hsp90 slopikliai kartu su priešvėžiniais preparatais gali veikti sinergistiškai, tačiau tiriant junginių kombinacijų sąveikas, ne visada taikomas Chou-Talalay metodas, todėl kai kurių tyrimų rezultatai gali būti nepatikimi ir prieštaringai vertinami. Šis tyrimo metodas leidžia tiksliai ir be sąlyginai didelių sąnaudų įvertinti tarp junginių pasireiškiančią sąveiką, todėl ir buvo pasirinktas tyrimui atlikti.
1.5.
Priešvėžinių junginių ir hipertermijos kombinacinis poveikis
Pastaraisiais metais atliekama vis daugiau tyrimų su nedidele hipertermija, kai vėžinis audinys yra veikiamas 41-45 °C temperatūra. Atlikus daugybę tyrimų buvo nustatyta, kad naudojant aukštesnę nei 43 °C temperatūrą, vėžio ląstelėse bei aplinkinio audinio ląstelėse vyksta negrįžtami viduląsteliniai baltymų pakitimai ir ląstelės nekrozuoja [60,61], todėl imta daugiau dėmesio skirti žemesnėms nei 43 °C temperatūroms. Pastebėta, kad veikiant tokiomis temperatūromis ląstelėse yra indukuojami baltymų konformacijos pakitimai, taip pat vyksta baltymų agregacija dėl susidariusių atvirų hidrofobinių grupių [60]. Vėžinėse ląstelėse įsijungia apsauginis šiluminio šoko atsakas, valdomas skirtingais signaliniais keliais. Sveikose ląstelėse šis atsakas nėra toks aktyvus [61].
Vienas pagrindinių šiluminio šoko atsako padarinių – padidėjusi Hsp baltymų (Hsp27, Hsp70, Hsp90) ekspresija, kuri apsaugo kitus ląstelės baltymus nuo suirimo ar agregacijos, tuo pačiu aktyvuojamas DNR pažaidų taisymo mechanizmas bei slopinama apoptozė [61,62]. Hsp šeimos baltymai sukelia ląstelių termotoleranciją – ląstelės tampa atsparios temperatūros padidėjimui, kuri trunka iki kelių dienų, ir tai apsunkina termoterapijos planavimą klinikinėje praktikoje [60]. Todėl Hsp slopiklių naudojimas derinyje su termoterapija galėtų būti patraukli vėžinių lygų gydymo strategija. Tokia strategija kliniškai pasižymėtų dvigubu poveikiu – didėtų junginių toksiškumas vėžinėms ląstelėms bei mažėtų jų atsparumas temperatūros poveikiui [60].
Nors šilumio šoko atsako mechanizmas bei Hsp90 slopikliai intensyviai tyrinėjami, tačiau kol kas yra nedaug duomenų apie Hsp90 slopiklių poveikį ląstelių terminiam jautrumui [60]. Ito ir jo kolegų atliktame tyrime buvo nustatytas stiprus Hsp90 slopiklio 17-DMAG poveikis žmogaus melanomos ląstelių terminiam jautrumui [60,63]. Šiame tyrime buvo nustatyta, kad 17-DMAG ir hipertermijos poveikis žymiai labiau slopino auglio formavimąsi pelių melonomos modelyje, lyginant vien su hipertermija ar 17-DMAG monoterapija [63]. Kito tyrimo metu nustatyta, kad 17-DMAG padidina jautrumą aukštesnei temperatūrai žiurkių rabdomiosarkomos ląstelių kultūrose ir pelėse, naudojant ne aukštesnes kaip 43 °C temperatūras [42].
Taigi, atlikti tyrimai rodo, kad Hsp baltymų, o ypač Hsp90 slopinimas efektyviai mažina hipertermijos sukeliamą šilumio šoko atsaką vėžio ląstelėse ir didina kombinuotos chemo- ir termoterapijos efektyvumą.
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1.
Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – ICPD47 ir ICPD62, (VU Biotechnologijos institutas, ≥ 98 %), gemcitabinas (Enzo, ≥ 97,5 %), doksorubicino hidrochloridas (Sigma-Aldrich, ≥ 98 %), 5-fluorouracilas (Sigma-Aldrich, ≥ 99 %).
2.2.
Reagentai ir naudojama aparatūra
Vėžio ląstelių linijos: Žmogaus kasos vėžio ląstelių linija MIA PaCa-2 (Amerikos ląstelių kultūrų kolekcija)
Žmogaus kasos vėžio ląstelių linija PANC-1 (ATCC)
Žmogaus fibroblastai (HF, gauti iš prof. Helder A. Santos, Helsinkio universitetas, Suomija)
Ląstelių kultivavimui bei tyrimams reikalingos plastiko priemonės (centrifūginiai mėgintuvėliai, vienkartinės pipetės, 6 ir 96 šulinėlių plokštelės, lėkštelės ląstelių auginimui, labai mažo prilipimo 96 šulinėlių plokštelės, antgaliai pipetėms) įsigytos iš kompanijos Corning.
Ląstelių sferoidų gamybai 3D Bioprinting metodu naudotos magnetinės plokštelės ir nanodalelės NanoShuttleTM, įsigytos iš kompanijos Nano3D Biosciences.
Reagentai:
1 proc. antibiotikų tirpalas (10000 vienetų/ml penicilino ir 10 mg/ml streptomicino, Gibco);
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas (MTT) (Sigma-Aldrich, ≥97 proc.);
Dimetilsulfoksidas (DMSO, Sigma-Aldrich Co, ≥ 99,5 proc.);
Dulbecc‘o modifikuota Eagle ląstelių mitybinė terpė (DMEM, Gibco);
Etanolis 96 proc. (Stumbras)
Fetalinis veršiukų serumas (FBS, Gibco);
Fosfatinis druskų tirpalas (PBS) pH 7,4 (Gibco);
Tripsino tirpalas TrypLE™ Express (Gibco); Aparatūra:
Fluorescencinis mikroskopas Olympus TH4-200 (Olympus);
Centrifuga Eppendorf Centrifuge 5424 (Eppendorf).
Inkubatorius MMM M-48S-230 (MMM Medcenter Einrichtungen GmbH)
Vandens kaitinamoji vonelė Water Bath 1008 (GFL)
2.3.
Poveikio žmogaus vėžinių ląstelių gyvybingumui tyrimas
Žmogaus kasos vėžio ląstelių linijos PANC-1 ir MIA PaCa-2 auginamos monosluoksniu DMEM mitybinėje terpėje, papildytoje 10 proc. FBS ir 1 proc. antibiotikų. Ląstelės inkubuojamos 37 ºC temperatūroje, 5 proc. CO2 turinčioje aplinkoje.
Ląstelių suspensija ruošiama jas perplovus 1 ml PBS ir inkubavus su 1 ml tripsino 7-8 min. 37 °C temperatūroje. Į ląsteles pilama 9 ml mitybinės terpės, išmaišoma, centrifuguojama 5 min. 1000 aps./min greičiu. Supernatantas nupilamas, nusėdusios ląstelės suspenduojamos 1 ml terpės ir suskaičiuojamos hemocitometru.
Į 96 šulinėlių plokšteles pilama po 100 μl suspensijos taip, kad kiekviename šulinėlyje būtų po 5000 PANC-1 arba MIA PaCa-2 ląstelių. Ląstelės inkubuojamos 24 val. 37 ºC temperatūroje, 5 proc. CO2 turinčioje aplinkoje.
Tiriamųjų junginių tirpalai ruošiami DMSO. Šie tirpalai skiedžiami mitybine terpe gaminant serijinius praskiedimus, ir pilami po 100 μl į 96 šulinėlių plokšteles su ląstelėmis. Kaip teigiama kontrolė naudojama mitybinė terpė be ląstelių, o kaip neigiama kontrolė – ląstelės, inkubuojamos mitybinėje terpėje su 0,25 proc. DMSO (tokia pati DMSO koncentracija buvo visuose šulinėliuose su tiriamaisiais junginiais). Ląstelės, paveiktos junginiais, inkubuojamos 72 val. 37 ºC temperatūroje, 5 proc. CO2
turinčioje aplinkoje. Po 72 val. į kiekvieną šulinėlį įpilama po 20 μl MTT dažo (5 mg/ml koncentracijos) ir inkubuojama 4 val. Tuomet skystis nupilamas nuo ląstelių, susidarę kristalai tirpinami 100 μl DMSO. Susidariusių formazano kristalų koncentracija, kuri atitinka gyvybingų ląstelių kiekį, nustatyta spektrofotometriškai, absorbciją matuojant 570 nm ir 630 nm bangos ilgiuose.
Išmatuotos absorbcijos vertės normalizuotos nuo 0 iki 1, kur 0 atitinka neigiamą, o 1 – teigiamą kontrolę. Gauti duomenys analizuoti Microsoft Office Excel 2007 programa, nustatomos junginių koncentracijos, slopinančios 50 proc. ląstelių gyvybingumą (EC50).
2.4.
Hsp90 slopiklių ir priešvėžinių junginių kombinacinio poveikio tyrimas
Ląstelių suspensijos paruoštos anksčiau aprašytu būdu (žr. 2.3. skirsnį). Į 96 šulinėlių plokšteles pilama po 100 μl suspensijos taip, kad kiekviename šulinėlyje būtų po 5000 PANC-1 arba MIA PaCa-2 ląstelių. Ląstelės inkubuojamos 24 val. 37 ºC temperatūroje, 5 proc. CO2 turinčioje aplinkoje.Kombinaciniam (sinergistiniam) efektui nustatyti paruoštos Hsp90 slopiklių ICPD47 ir ICPD62 kombinacijos su GEM, DOX ir 5-FU. Kombinacijos ruošiamos taip, kad junginių santykis kombinacijoje būtų pastovus – 5:1, 1:1 ir 1:5, remiantis nustatytomis tiriamųjų junginių EC50 vertėmis.
Tiriamųjų junginių kombinacijų tirpalai ruošiami DMSO. Šie tirpalai skiedžiami mitybine terpe, gaminat serijinius praskiedimus, ir pilami po 100 μl į 96 šulinėlių plokšteles su ląstelėmis.Kaip teigiama kontrolė naudojama mitybinė terpė be ląstelių, o kaip neigiama kontrolė – ląstelės, inkubuojamos mitybinėje terpėje su 0,25 proc. DMSO (tokia pati DMSO koncentracija buvo visuose šulinėliuose su tiriamaisiais junginiais). Toliau tyrimas tęsiamas, anksčiau aprašytu būdu (žr. 2.3. skirsnį).
Nustatomas kiekvieno junginio ir junginių derinių skirtingų koncentracijų poveikis ląstelių gyvybingumui, šie duomenys suvedami į CompuSyn programą (The ComboSyn, Inc), kuri pagal Chou-Talalay metodo algoritmą apskaičiuoja kombinacijos indeksą (CI) kiekvienai naudoto derinio koncentracijai. Kai CI < 1, stebima sinergistinė sąveika, kai CI = 1, stebimas adityvinis poveikis, kai
CI > 1 – pasireiškia antagonistinė sąveika [52,53].
2.5.
Poveikio vėžio ląstelių sferoidams tyrimas
Vėžio ląstelių sferoidams formuoti buvo taikomas 3D Bioprinting metodas. Šiuo metodu buvo formuojami sferoidai iš MIA PaCa-2 ir PANC-1 ląstelių. Šios ląstelių linijos įprastai sferoidų nesuformuoja, dėl to jos maišomos su žmogaus fibroblastais santykiu 1:1 (toks santykis nustatytas eksperimentiškai). 6 šulinėlių plokštelės šulinėliuose atskirai inkubuojamos kasos vėžio ląstelės ir žmogaus fibroblastai (apie 250 000 ląstelių viename šulinėlyje). Po 10-12 val. nuo inkubavimo pradžios į kiekvieną šulinėlį įpilama po 10 μl nanodalelių NanoShuttle ir ląstelės inkubuojamos dar 8-10 val.
Ląstelės tripsinizuojamos, gaminamos suspensijos DMEM Glutamax mitybinėje terpėje. Suspensijos sumaišomos lygiais santykiais ir išpilstomos į 96 šulinėlių labai mažo prilipimo plokšteles po 50 μl taip, kad kiekviename šulinėlyje būtų po 2000 kasos vėžio ląstelių ir 2000 fibroblastų. Paruošta plokštelė dedama ant magnetinės plokštelės ir inkubuojama 37 °C temperatūroje, 5 proc. CO2
Sferoidai iš PANC-1 ir MIA PaCa-2 ląstelių susiformuoja per 72 val. Tuomet sferoidai kiekviename šulinėlyje fotografuojami fazių kontrastiniu mikroskopu, naudojant 10× padidinimo objektyvą. Mitybinė terpė pakeičiama nauja terpe su konkrečiomis tiriamųjų junginių ir skirtingų junginių kombinacijų, kai EC50 santykis 1:5, koncentracijomis. Kaip neigiama kontrolė naudojama terpė
su 0,5 proc. DMSO (tokia DMSO koncentracija buvo visuose šulinėliuose). Sferoidai fotografuojami kas 2 dienas, terpė keičiama kas 4 dienas.
Tiriamųjų junginių ir junginių kombinacijų poveikis 3D kultūroms vertintas pagal sferoidų skersmens pokytį, analizė atlikta naudojantis ImageJ programa (Nacionalinis sveikatos institutas, angl.
National Institutes of Health).
2.6.
Hsp90 slopiklių ir hipertermijos sinergistinio poveikio tyrimas
Ląstelių suspensijos paruošiamos anksčiau aprašytu būdu (žr. 2.3. skirsnį). Į dvi (viena kontrolinė, kita bus veikiama hipertermija) 96 šulinėlių plokšteles pilama po 100 μl suspensijos taip, kad kiekviename šulinėlyje būtų po 5000 PANC-1 arba MIA PaCa-2 ląstelių. Ląstelės inkubuojamos 24 val. 37 ºC temperatūroje, 5 proc. CO2 turinčioje aplinkoje.
Po 24 val inkubacijos, viena plokštelė šildoma 43 ºC temperatūroje vandens vonelėje 30 min. Po hipertermijos poveikio, nuo ląstelių nusiurbiama terpė ir į kiekvieną šulinėlį įpilama po 100 µl naujos 37 ºC temperatūros terpės. Tada supilami mitybinėje terpėje paruošti tiriamųjų junginių ICPD47 ir ICPD62 tirpalai ir tyrimas tęsiamas anksčiau aprašytu būdu (žr. 2.3. skirsnį).
2.7.
Statistinis duomenų apdorojimas
Gauti duomenys apdoroti Microsoft Office Excel 2007 programa, apskaičiuojant trijų nepriklausomų eksperimentų metu gautų rezultatų vidurkius ir santykinius nuokrypius. Patikimumui vertinti taikytas Studento t kriterijus, skirtumai laikyti statistiškai patikimais, kai reikšmingumo lygmuo
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1.
Tiriamųjų junginių poveikis vėžio ląstelių gyvybingumui
Hsp90 slopikliai ir priešvėžiniai junginiai tarpusavyje pasižymėjo skirtingu gyvybingumą slopinančiu aktyvumu (8 pav.). Junginiai abiejose ląstelių linijose veikė panašiai. Hsp90 slopiklių grupėje EC50 vertės tarp ląstelių linijų skyrėsi tik paveikus ICPD47, o priešvėžinių junginių – 5-FU,
tačiau tik ICPD47 poveikis statistiškai buvo reikšmingas (p < 0,05). ICPD62 buvo aktyvesnis už ICPD47 apie devynis kartus MIA PaCa-2 ląstelių linijoje ir šešis kartus PANC-1 linijoje. Junginio ICPD62 EC50
vertė MIA PaCa-2 ir PANC-1 ląstelių linijose atitinkamai – 0,45 ± 0,06 ir 0,41 ± 0,08 μM, o ICPD47: 3,91 ± 0,9 ir 2,38 ± 0,25 μM.
8 pav. Tiriamųjų junginių EC50 verčių palyginimas tarp skirtingų ląstelių linijų (* p < 0,05, n = 3).
Literatūroje aprašytuose ICPD junginių tyrimuose nustatytos ICPD47 EC50 vertės buvo 6,0 ir
2,5 µM, o ICPD62 – 0,69 ir 0,70 µM, atitinkamai, U2OS ir HeLa ląstelių linijose [31,64]. Taigi, bendri dėsningumai tarp šių junginių EC50 verčių, kai ICPD62 yra beveik 10 kartų aktyvesnis už ICPD47,
išlieka. Gautus rezultatus galima paaiškinti tuo, kad šių junginių jungimosi su Hsp90 konstantos taip pat skiriasi, priklausomai nuo junginių struktūros: ICPD47 rezorcinolio grupės 5-ojoje padėtyje yra chloras, o ICPD62 analogiškoje pozicijoje chloro grupė pakeista etilo tilteliu (6 pav.), kuris geriau jungiasi prie Hsp90 baltymo N-domeno ir apsprendžia didesnį junginio aktyvumą, slopinant Hsp90 šaperoninį baltymą [42,64]. 0 1 2 3 4 5
ICPD47 ICPD62 DOX GEM 5-FU
EC 50 (µM) MIA PaCa-2 PANC-1 *
Priešvėžinių junginių grupėje ląstelių gyvybingumą labiausiai slopino DOX, jo EC50 vertės
MIA PaCa-2 ir PANC-1 ląstelių linijose atitinkamai buvo 0,08 ± 0,03 ir 0,07 ± 0,03 μM. (8 pav.). Šio tyrimo metu nustatyta, kad Hsp90 slopikliai pasižymi citotoksiniu poveikiu kaip ir DOX. Tokius rezultatus mokslinėje literatūroje demonstruoja ir kiti Hsp90 slopiklių grupės junginiai, nors jų
EC50 varijuoja nuo 0,01 µM iki daugiau nei 10 µM [9,70,71]. GEM ir 5-FU priklauso antimetabolitų klasei ir turi labiau citostatinį poveikį ir vėžio ląstelių gyvybingumą slopina atitinkamai iki 40 ir 30 proc. [65, 66].
Apibendrinus gautus rezultatus, galima teigti, jog Hsp90 slopikliai ICPD47 ir ICPD62 mažina kasos vėžio ląstelių linijų gyvybingumą ir galėtų būti pritaikomi kaip priešvėžiniai junginiai mono- arba kompleksinėje terapijoje. ICPD62 pasižymėjo didesniu aktyvumu, nei tos pačios klasės junginys ICPD47 bei klinikinėje praktikoje naudojamas 5-FU.
3.2.
Hsp90 slopiklių ir priešvėžinių junginių kombinacinio poveikio tyrimas 2D
kultūrose
Sienkiant įvertinti, ar Hsp90 slopikliai ir skirtingą veikimo mechanizmą turintys priešvėžiniai junginiai gali veikti sinergistiškai, buvo taikytas Chou-Talalay metodas, kuriuo buvo nustatyta, kad daugumoje kombinacijų pasireiškė sinergistinė sąveika (CI < 1), priklausomai nuo junginių derinio koncentracijos paveiktos frakcijos (fa) (9 pav.). Paveikta frakcija – tai žuvusių vėžio ląstelių dalis, esant atitinkamai junginių derinio koncentracijai (C).
Stipriausia sinergistinė sąveika MIA PaCa-2 ląstelių linijoje pasireiškė naudojant ICPD47 su GEM 1:5 (CI = 0,22; C = 0,27 µM) bei ICPD62 su GEM 1:1 (CI = 0,26; C = 0,13 µM), o PANC-1 ląstelių linijoje stipriausias sinergizmas toje pačioje frakcijoje buvo nustatytas naudojant ICPD62 su GEM 5:1 (CI = 0,17; C = 0,21 µM) ir ICPD47 su 5-FU 1:5 (CI = 0,31; C = 1,65 µM). Visi ICPD47 su 5-FU deriniai MIA PaCa-2 ląstelių linijoje veikė antagonistiškai, o PANC-1 linijoje antagonistiškai veikė visi ICPD47 ir ICPD62 deriniai su DOX. Stipriausia antagonistinė sąveika (CI > 1) pasireiškė naudojant ICPD47 su DOX 5:1 (CI = 1,61; C = 1,08 µM) MIA PaCa-2 linijoje ir ICPD62 su DOX 1:5 (CI = 3,08; C = 0,54 µM) PANC-1 ląstelių linijoje.
9 pav. CI vertės MIA PaCa-2 (A) ir PANC-1 (B) ląstelių linijose, kai fa = 0,5. *p < 0,05.
Stipriausios sinergistinė sąveikos visose paveiktose frakcijose (0 > fa > 1) (10 pav.), pasireiškė MIA PaCa-2 ląsteles paveikus ICPD47 su GEM 1:5 (CI < 0,7) ir ICPD62 su DOX 5:1 (CI < 0,7) kombinacijomis, o PANC-1 ląsteles – ICPD62 su GEM 5:1 (CI < 0,5) bei ICPD62 su 5-FU 1:5 (CI < 0,7). ICPD47 ir ICPD62 stipriausiai sinergistiškai veikė deriniuose su GEM abiejose ląstelių linijose.
0 1 2
ICPD47+GEM ICPD47+5-FU ICPD47+DOX ICPD62+GEM ICPD62+5-FU ICPD62+DOX
CI A 5:1 1:1 1:5 * * * * * * * * * 0 1 2 3 4
ICPD47+GEM ICPD47+5-FU ICPD47+DOX ICPD62+GEM ICPD62+5-FU ICPD62+DOX
CI B 5:1 1:1 1:5 * * * * * * * * * * * * * * *
10 pav. Stipriausios sinergistinės sąveikos visose junginių derinių koncentracijose: A – MIA PaCa-2; B – PANC-1.
Tokį stiprų poveikį galima paaiškinti tuo, kad Hsp90 slopikliai lėtina ląstelių metabolizmą, todėl jos tampa jautresnės antimetaboliniu poveikiu pasižyminčiam GEM ir 5-FU [65,67]. Manoma, kad antimetabolitų grupės priešvėžiniai junginiai (pvz., cisplatina) gali jungtis prie Hsp90 šaperoninio baltymo C-domeno ir jo funkciją dar labiau slopinti [74]. Taip pat Hsp90 slopikliai gali mažinti ląstelių atsparumą priešvėžiniams junginiams. Šiuo atveju abi tyrime naudojamos ląstelių linijos yra atsparios GEM [65,68]. Kaiser ir kiti nustatė, kad DOX kombinacijoje su rezorcinolio grupės Hsp90 slopikliais, taip pat gali veikti sinergistiškai didesnėse koncentracijose, tačiau keičiant tyrimo sąlygas, (pvz. ląstelių inkubacijos su skirtingais junginiais eiliškumą) junginių sąveika gali kisti iš sinergistinio į antagonistinį poveikį [47].
Skirtingi Hsp90 slopikliai kombinacijoje su tuo pačiu priešvėžiniu junginiu tuo pačiu santykiu pasižymėjo priešingu poveikiu. MIA Paca-2 ląstelių linijoje ICPD47 su 5-FU 1:1 veikia antagonistiškai visose fa, o ICPD62 su 5-FU 1:1 kombinacija veikia sinergistiškai (11 pav.). Žinoma, kad abu Hsp90 slopikliai turi tokį patį veikimo mechanizmą, bet tokiai sąveikai įtakos gali turėti skirtingas Hsp90 slopiklių aktyvumas – ICPD62 veikia stipriau. Apie tikslesnį Hsp90 slopiklių ir 5-FU sąveikos mechanizmą šiuo metu trūksta žinių.
11 pav. CI priklausomybė nuo Hsp90 slopiklio MIA PaCa-2 ląstelių linijoje. *p < 0,05.
0 1 2 3 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 CI fa ICPD62+5-FU 1:1 ICPD47+5-FU 1:1 * *
Lee ir kiti tyrėjai nustatė, kad rezorcinolio fragmentą turintis Hsp90 slopiklis NVP-AUY922 ir 5-FU, naudojami kartu skirtingais koncentracijų santykiais (1000:1 ir 100:1) žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijose veikia sinergistiškai (CI < 1) [58]. Šio tyrimo metu nustatytas galimas NVP-AUY922 ir 5-FU sąveikos mechanizmas gali būti susijęs su tuo, kad Hsp90 slopiklis mažina sintezuojamos TS kiekį, tai mažina rezistentiškumą 5-FU ir stiprina jo toksinį poveikį [58]. Liu ir jo kolegos nustatė Hsp90 slopiklio SNX-2112 antagonistinę sąveiką žmogaus stemplės vėžio ląstelėse (CI > 1), naudojant šį junginį kartu su 5-FU [59]. Mokslininkai tikslaus šių junginių antagonistinės sąveikos mechanizmo neišaiškino, tačiau padarė prielaidą, kad 5-FU gali konkuruoti dėl prisijungimo prie Hsp90 N-domeno su SNX-2112, arba 5-FU gali aktyvinti SNX-2112 slopinamus vėžio signalinius kelius [59]. Taigi, šie literatūroje aprašyti tyrimai įrodo, kad skirtingi Hsp90 slopikliai kombinacijoje su tuo pačiu priešvėžiniu junginiu gali pasižymėti priešingomis sąveikomis.
Kombinacijos sąveikos toje pačioje ląstelių linijoje gali skirtis, naudojant tų pačių junginių kombinacijas, pagamintais skirtingais santykiais. Tokį poveikį geriausiai pademonstravo ICPD62 su DOX kombinacija (12 pav.). Šie junginiai santykiu 5:1 veikė sinergistiškai visose koncentracijose, santykiu 1:1 veikė sinergistiškai mažesnėse koncentracijose, o santykiu 1:5 visose koncentracijose veikė antagonistiškai.
12 pav. CI priklausomybė nuo junginių kombinacijos santykio. ICPD62 su DOX kombinacijų sąveika skirtingais santykiais MIA PaCa-2 vėžio ląstelių kultūrose. * p < 0,05.
Apibendrinant galima teigti, kad stipriausios sinergistinės sąveikos pasireiškia MIA PaCa-2 ląsteles paveikus ICPD47 su GEM 1:5 ir ICPD62 su DOX 5:1 kombinacijomis, o PANC-1 ląsteles – ICPD62 su GEM 5:1 bei ICPD62 su 5-FU 1:5. Taip pat nustatyta, kad sinergistinė sąveika priklauso nuo daugelio veiksnių – Hsp90 slopiklio jungimosi stiprumo su baltymu, priešvėžinio junginio veikimo
0 1 2 3 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 CI fa ICPD62+DOX 5:1 ICPD62+DOX 1:1 ICPD62+DOX 1:5 * *
mechanizmo, skirtingo junginių santykio kombinacijoje, skirtingos kombinacijos tirpalo koncentracijos bei ląstelių linijos. Todėl, norint parinkti tinkamiausią junginių derinį tolimesniems tyrimams in vivo sistemose, būtina įvertinti visus šiuos veiksnius.
3.3.
Hsp90 slopiklių ir priešvėžinių junginių kombinacinis poveikis sferoiduose
Kuriamų vaistų efektyvumas įprastai tiriamas 2D ląstelių kultūrose, tačiau jų efektyvumasin vivo neretai skiriasi. Taip yra dėl skirtingos monosluoksniu augančios ląstelių kultūros (2D sistema)
ir naviko trimatės struktūros (3D sistema) prigimties [75]. Tyrimais nustatyta, kad toks efektyvumo skirtumas 3D modeliuose atsiranda dėl skirtingos ląstelių paviršiaus receptorių ekspresijos, ekstraląstelinio matrikso sintezės, ląstelių tankumo ir pakitusio metabolinių funkcijų, lyginant su 2D kultūromis [75,76]. Vertinant priešvėžinių junginių efektyvumą 3D ląstelių modeliuose, tiksliau atsiskleidžia biologinės ir fizikocheminės mikroaplinkos funkcijos bei jų įtaka junginių efektyvumui. Juose yra labiau atkartojamos in vivo vėžio ląstelių tarpusavio sąveikos, maisto medžiagų ir vaistų paskirstymas naviko stromoje. Šie veiksniai daro labai didelę įtaką ląstelių reakcijai į vaistus [76]. Todėl tyrimai ląstelių sferoiduose leidžia geriau prognozuoti junginio poveikį gyvame organizme. Siekiant įvertinti Hsp90 slopiklių ir tiriamųjų priešvėžinių junginių kombinacinį poveikį prieš vėžio ląsteles imituojant in vivo sąlygas, jais buvo veikiami kasos vėžio ląstelių sferoidai (13 pav.).
Kasos vėžio ląstelės įprastinėmis sąlygomis nėra linkusios formuoti sferoidinių struktūrų ir joms reikia specialių sąlygų [76,77]. Todėl buvo nutarta formuoti sferoidus iš kasos vėžio ląstelių ir žmogaus fibroblastų santykiu 1:1 3D Bioprinting metodu. Fibroblastai yra kasos ir kitų organų navikų stromos sudedamoji dalis, kuri svarbi auglio formavimuisi ir vystymuisi bei padeda palaikyti jo struktūrą [78,79]. Šiuo būdu abi linijos suformavo sferoidus po 3 dienų, tačiau MIA PaCa-2 linijos sferoidai susiformavo gana taisyklingos formos, nedideli (344 ± 8,4 µm skermens) lygiais kraštais, o PANC-1 – kiek didesni (401 ± 13,8 µm skermens), netaisyklingos formos ir nelygiais kraštais (13 pav.). Remiantis literatūros šaltiniais, skirtingos kasos vėžio linijų ląstelės pasižymi skirtingu fenotipu ir genotipu, todėl pasižymi skirtingomis agregacinėmis savybėmis ir skirtingai formuoja sferoidus. Longati ir kolegos, taikydami kitą sferodų formavimo metodą, formavo kasos vėžio MIA PaCa-2, PANC-1, BxPC-3 ląstelių linijų sferoidus ir gavo skirtingos formos ir dydžio darinius: MIA PaCa-2 linija sferoidų nesuformavo, PANC-1 suformavo iki 500 µm skermens netaisyklingos formos sferoidus, o BxPC-3 – mažus kompaktiškus sferoidus [77].
13 pav. Sferoidų dydžio kitimas per 12 dienų
MIA PaCa-2 sferoidų augimą slopino beveik visi junginiai ir visos kombinacijos. ICPD47 ir 5-FU kombinacijos aktyvumas buvo stipriausias, po 12 d. inkubacijos su šiuo deriniu sferoidų skermuo reikšmingai sumažėjo 1,6 karto, tuo tarpu kontrolinėje grupėje sferoidai sumažėjo 1,1 karto (14 pav.) (p < 0,05).
Hsp90 slopikliai ir priešvėžiniai junginiai bei jų kombinacijos PANC-1 linijos sferoiduose veikė priešingai – nuo pat pirmos dienos (13 pav.) sferoidus inkubuojant su tiriamaisiais junginių ir junginių derinių tirpalais, sferoidai palaipsniui augo, ir apytiksliai po 3 dienų pasiekė 500 µm dydį, kuris literatūroje įvardijamas kaip kritinis, nes centrinėje sferoido dalyje formuojasi nekrotinė zona [77]. Tačiau pastebėta, kad sferoidai, inkubuojami su kai kuriais junginiais, augo lėčiau, o po 12 dienų inkubacijos dalis sferoidų suiro arba jų centre atsirado ląstelių praretėjimų (13 pav.). Tokie rezultatai rodo, kad junginių citotoksinis poveikis gali pasireikšti ne tik sferoidų mažėjimu, bet ir ląstelių agregacijos mažinimu ir adhezijos slopinimu, dėl ko jų skersmuo didėja [81]. PANC-1 sferoidai po 12 dienų visiškai suiro veikiami GEM (C = 0,24 µM) (13 pav.), o veikiant ICPD47 su GEM kombinacija, skermuo reikšmingai padidėjo tik 2,15 karto (14 pav.), kai kontrolinėje grupėje sferoidai padidėjo 2,85 karto (p < 0,05). Tokį skirtingą tiriamųjų junginių ir jų kombinacijų efektą PANC-1 linijos sferoiduose galėjo lemti juose susiformavęs ekstraląstelinis matriksas, kuris veikia kaip mechaninis
barjeras junginių difuzijai [77], o dėl sumažėjusio ląstelių adhezyvumo sferoido centrinėje dalyje, sferoidai galėjo plėstis ir pradėti irti iš centrinės dalies [81].
14 pav. Sferoidų skersmuo po 12 d. inkubacijos su Hsp90 slopikliais ir priešvėžiniais junginiais ir jų kombinacijomis; A – MIA PaCa-2, B – PANC-1. * visi sferoidai suiro.
Vertinant kombinacinį tiriamųjų junginių poveikį, MIA PaCa-2 sferoiduose geriausius rezultatus demonstravo ICPD47 su 5-FU kombinacija. Su šiuo deriniu 12 dienų inkubuoti sferoidai sumažėjo 1,6 karto, o inkubuojant atskirai su ICPD47 ir 5-FU sumažėjo atitinkamai 1,3 ir 1,5 karto (15 pav.). Šioje kombinacijoje galimai pasireiškia silpna sinergistinė sąveika, nustatyta 2D MIA PaCa-2 modeliuose sinergistinio tyrimo metu (CI = 0,96). Taip pat šioje ląstelių linijoje galimai sinergistiškai
0 100 200 300 400 Sfe ro id o s ke rs m u o (µm ) A 200 400 600 800 1000 1200 1400 Sfe ro id o s k e rs m u o ( µ m) B *
veikė ICPD62 su GEM kombinacija (15 pav.), kai sferoidai sumažėjo 1,3 karto, o inkubuojant atskirai su ICPD62 ir GEM – atitinkamai 1,1 ir 1,2 karto, nes 2D modeliuose ši kombinacija veikė sinergistiškai (CI < 1). Tačiau lyginant šios kombinacijos efektyvumą su kontroline grupe, sferoidų dydis sumažėjo tik 1,2 karto ir skirtumas yra statistiškai nereikšmingas (p > 0,05). Kitose kombinacijose sinergistinė sąveika nenustatyta.
15 pav.MIA PaCa-2sferoidų dydžio kitimas, inkubuojant ICPD47+5-FU (A) ir ICPD62+GEM (B). *p < 0,05.
PANC-1 linijos sferoidų augimą labiausiai slopino ICPD47 su GEM kombinacija, lyginant su pavieniais ICPD47 ir GEM. Sferoidus veikiant šiuo deriniu, jų plotas padidėjo 2,15 karto, o veikiant ICPD47 ir GEM, atitinkamai, 2,48 ir 2,17 karto, nuo pradinio sferoidų dydžio (16 pav.), tačiau skirtumas statistiškai nereikšmingas (p > 0,05). Taip pat veikiant šiuo deriniu, kai kurių sferoidų centrinėje zonoje
200 240 280 320 360 400 0 2 4 6 8 10 12 S feroi do s k ers m uo ( µm )
Inkubacijos periodas (dienos)
Kontrolė ICPD47+5-FU ICPD47 5-FU A. 250 290 330 370 0 2 4 6 8 10 12 S feroi do s kers m uo ( µm )
Inkubacijos periodas (dienos)
Kontrolė ICPD62+GEM ICPD62 GEM B. *
susiformavo praretėjimai (13 pav.). Didesnį kombinacijos aktyvumą gali paaiškinti atsirandanti sinergistinė sąveika tarp ICPD47 ir GEM, kuri buvo nustatyta 2D modelyje (CI < 1). Kitose kombinacijose sinergistinė sąveika nenustatyta.
16 pav. PANC-1 sferoidų dydžio kitimas, inkubuojant su ICPD47 ir GEM bei jų kombinacija. *p < 0,05.
Palyginus tyrimo sferoiduose ir MTT testo rezultatus, galima pastebėti, jog Hsp90 slopikliai ir tiriamieji priešvėžiniai junginiai bei jų kombinacijos ląstelių 2D kultūras veikė aktyviau nei 3D kultūras. Viena iš priežasčių gali būti ribota junginio difuzija į sferoidus [77], dėl ko labiau veikiamos arčiau sferoidų kraštų esančios ląstelės, tuo tarpu monosluoksnyje augančios ląstelės junginiu yra veikiamos vienodai. Kita priežastis – sferoiduose esančios ląstelės aktyvuoja įvairius genus, lemiančius padidėjusį atsparumą priešvėžianiams junginiams [77,80].
Eksperimento metu buvo nustatyta, kad Hsp90 slopikliai, priešvėžiniai junginiai ir jų kombinacijos slopina MIA PaCa-2 linijos sferoidų augimą bei skatina irimą, o PANC-1 linijos sferoidų augimą lėtino tik kai kurie junginiai ir jų deriniai. MIA PaCa-2 sferoiduose galimai galimai sinergistiškai veikė tik dvi kombincijos – ICPD47 su 5-FU ir ICPD62 su GEM, o PANC-1 sferoiduose tik ICPD47 su GEM. Taip pat gauti rezultatai rodo, jog poveikiui 3D kultūrose pasiekti reikalingos didesnės junginių koncentracijos nei ląstelių monosluoksnyje.
300 500 700 900 1100 1300 0 2 4 6 8 10 12 Sk e rs m u o (µm )
Inkubacijos periodas (dienos) Kontrolė
ICPD47+GEM ICPD47 GEM
