FENOLINIŲ JUNGINIŲ EKSTRAHAVIMAS ULTRAGARSU IŠ VAISTINĖS MELISOS (MELISSA OFFICINALIS L.) LAPŲ

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA

JUSTYNA JURGELEVIČ

FENOLINIŲ JUNGINIŲ EKSTRAHAVIMAS ULTRAGARSU IŠ

VAISTINĖS MELISOS (MELISSA OFFICINALIS L.) LAPŲ

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas doc. dr. Giedrė Kasparavičienė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis Data

FENOLINIŲ JUNGINIŲ EKSTRAHAVIMAS ULTRAGARSU IŠ VAISTINĖS MELISOS (MELISSA OFFICINALIS L.) LAPŲ

Magistro baigiamasis darbas

Recenzentas Darbo vadovas

doc. dr. Giedrė Kasparavičienė

Darbą atliko Magistrantė Justyna Jurgelevič

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 8

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

1.1. Fenolinių junginių ekstrakcijos proceso apibūdinimas ... 10

1.1.1. Maceracija ... 10

1.1.2. Perkoliacija ... 11

1.1.3. Soksleto aparatas ... 11

1.1.4. Ekstrakcija ultragarsu ... 12

1.1.5. Mikrobangomis skatinama ekstrakcija (MSE) ... 13

1.1.6. Superkritinių skysčių ekstrakcija ... 14

1.2. Fenoliniai junginiai ... 14

1.3. Antioksidacinis aktyvumas ... 15

1.4. Vaistinės melisos (lot. Melissa officinalis L.) apibūdinimas ... 16

1.5. Vaistinės melisos cheminė sudėtis ... 17

1.6. Vaistinėje melisoje esančių junginių biologinis aktyvumas ... 17

1.7. Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 19

2. TYRIMO METODIKA ... 21

2.1. Tiriamasis objektas ... 21

2.2. Naudota aparatūra ... 21

2.3. Naudoti reagentai ... 21

2.4. Augalinės žaliavos nuodžiūvio ir smulkumo nustatymas ... 22

2.5. Tiriamųjų ekstraktų technologija ... 22

2.7. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH●) radikalinio

sujungimo metodu ... 24

2.8. Stabilumo tyrimas ... 25

2.9. Tyrimo metu gautų duomenų statistinis vertinimas ... 25

3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APIBENDRINIMAS ... 26

3.1. Augalinės žaliavos kokybės vertinimas ... 26

3.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 27

3.3. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ... 32

3.4. Stabilumo tyrimas ... 39 3.5. Rezultatų aptarimas ... 41 4. IŠVADOS ... 43 5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 44 6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 45 PRIEDAS ... 51

SANTRAUKA

J. Jurgelevič magistro baigiamasis darbas/ darbo vadovas doc. dr. G. Kasparavičienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto; Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra – Kaunas.

Pavadinimas: Fenolinių junginių ekstrahavimas ultragarsu iš vaistinės melisos (Melissa officinalis L.) lapų.

Darbo tikslas: Naudojant ultragarsą ekstrahuoti fenolinius junginius iš vaistinės melisos (Melissa officinalis L.) lapų, įvertinti veiksnių – tirpiklio, laiko, ekstrahento ir tiriamosios medžiagos santykio bei dalelių dydžio įtaką, nustatant bendrą fenolinių junginių kiekį bei antioksidacinį aktyvumą.

Darbo uždaviniai: Ekstrahuoti fenolinius junginius iš vaistinės melisos lapų naudojant ultragarsą; nustatyti ekstrakcijos tirpiklių, ekstrakcijos laiko, ekstrahento ir tiriamosios medžiagos santykio bei dalelių dydžio įtaką fenolinių junginių išsiskyrimui; nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį; nustatyti antioksidacinį aktyvumą DPPH metodu; atlikti stabilumo tyrimą.

Tyrimo metodai: Spektrofotometriškai nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis ir antioksidacinis aktyvumas DPPH laisvojo radikalo inaktyvinimo metodu.

Tyrimo rezultatai: Bendras fenolinių junginių kiekis vaistinės melisos vandeniniame ekstrakte iš papildomai nesmulkintos žaliavos įvairavo nuo 13,6 mg/ml iki 51,49 mg/ml, iš papildomai smulkintos – 16,23 mg/ml iki 63,26 mg/ml, etanoliniame ekstrakte iš papildomai nesmulkintos žaliavos svyravo nuo 15,86 mg/ml iki 71,37 mg/ml, iš papildomai smulkintos žaliavos nuo 18,73 mg/ml iki 78,49 mg/ml. Nustatytas vandeninių ekstraktų iš papildomai nesmulkintų lapų antioksidacinis aktyvumas buvo nuo 37,6% iki 84,87%, iš papildomai smulkintos žaliavos nuo 69,2% iki 81,83%; etanolinių ekstraktų iš papildomai nesmulkintos žaliavos – nuo 78,16% iki 89,48%, iš papildomai smulkintos žaliavos – nuo 75,62% iki 90,63%. Atlikus stabilumo tyrimą buvo nustatyta, kad vandeniniuose ekstraktuose fenolinių junginių sumažėja >10proc., etanoliniuose – <10proc. Antioksidacinis aktyvumas sumažėjo tiek vandeniuose, tiek etanoliniuose ekstraktuose.

Tyrimo išvados: Didžiausias fenolinių junginių kiekis išsiskiria naudojant tirpiklį etanolį 50% (V/V), ekstrahuojant santykiu 1:10, 10 – 15min. iš papildomai smulkintos vaistinės augalinės žaliavos. Buvo nustatyta, kad ekstrahavimo faktoriai neturi reikšmingos įtakos antioksidaciniam aktyvumui. Nepriklausomai nuo išekstrahuoto fenolinių junginių kiekio, visos ištraukos pasižymėjo dideliu antioksidaciniu aktyvumu. Stabilumo tyrimo metu, įvertinus bendro fenolinių junginių kiekio pokyčius, nustatyta, kad vandeniniai ekstraktai stabilūs neišlieka, etanoliniai – išlieka.

SUMMARY

The master thesis by Justyna Jurgelevič. The research supervisor is assoc. prof. dr. G. Kasparavičienė; Lithuanian University of Health Sciences, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Department of Drug Technology and Social Pharmacy, Kaunas.

The topic of the master thesis: Extraction of phenolic compounds from lemon balm (Melissa officinalis L.) leaves using ultrasound.

The aim of the research: the extraction of phenolic compounds from Lemon Balm (Melissa officinalis L.) leaves using ultrasound and evaluation of the influence of the following factors: solvent, time of extraction, material solvent ratio and particle size, while determining the total phenolic compounds and antioxidant activity.

The objectives of the research: to extract phenolic compounds from lemon balm leaves by ultrasound; to determine the influence of extraction solvent, extraction time, material solvent ratio and particle size to extraction of phenolics; to determine the total amount of phenolic compounds; to determine the antioxidant activity by DPPH method; to perform stability testing.

The methods of the research: the total amount of phenolic compounds and the antioxidant activity using DPPH free radical were determined spectrophotometrically.

The results of the research: the total amount of phenolic compounds in lemon balm aqueous extract varied from 13.6 mg/ml to 51.49 mg/ml, from reduced particle size varied from 16.23 mg/ml to 63.26 mg/ml, in ethanolic extract varied from 15.86 mg/ml to 71.37 mg/ml, from reduced particle size varied from 18.73 mg/ml to 78.49 mg/ml. Antioxidant activity of aqueous extracts varied from 37.6 % to 84.87 %, from reduced particle size varied from 69.2 % to 81.83 %; ethanolic extracts varied from 78.16 % to 89.48 %, from reduced particle size varied from 75.62 % to 90.63 %. The stability test results showed that in the aqueous extracts the amount of phenolic compounds decreased > 10 %, in ethanolic extracts <10 %. Antioxidant activity decreased in both water and ethanol extracts.

The conclusion: The maximum amount of phenolics was extracted using a solvent of ethanol 50% (v/v), ratio of 1:10, 10-15 min extraction time and reduced particle size of herbal material. It was found that the extraction factors have no significant effect on antioxidant activity, regardless of the amount of extracted phenolic compounds; all extracts had significant antioxidant activity. The long-term stability testing and variation of amount of phenolic compounds showed that aqueous extracts do not remain stable, ethanolic extracts – remain.

SANTRUMPOS

AA antioksidacinis aktyvumas

Ach acetilcholinas

BFJK bendras fenolinių junginių kiekis

CD cukrinis diabetas

CNS centrinė nervų sistema

DPPH 2,2-difenil-1-pikril-hidrazilo radikalas

FJ fenoliniai junginiai

FJK fenolinių junginių kiekis

GABA-T GABA transaminazė

HSV-1 1 tipo Herpes simplex virusas

LR laisvieji radikalai

MTL mažo tankio lipoproteinai

MSE mikrobangų skatinama ekstrakcija

OS oksidacinis stresas

p reikšmingumo lygmuo

Ph. Eur. Europos farmakopėja

PPAR peroksisominių proliferatorių aktyvinami receptoriai RRE rozmarino rūgšties ekvivalentas

RNS reaktyvios azoto formos ROS reaktyvios deguonies formos VAŽ vaistinė augalinė žaliava

ĮVADAS

Fenoliniai junginiai – tai gerai žinomos fitocheminės medžiagos, turinčios platų pritaikymą medicinoje, dėl to dažnai tampa mokslinių tyrimų centru. Yra nustatyta, kad jie pasižymi antiuždegiminiu, antimikrobiniu, antivirusiniu, antialerginiu, priešvėžiniu poveikiu, bet plačiausiai yra tyrinėjamos jų antioksidacinės savybės [1]. Antioksidacinės savybės yra svarbios apsaugai nuo laisvųjų radikalų, kurie sukelia oksidacinį stresą. Tai reiškinys, kuris siejamas su pernelyg dideliu reaktyvių deguonies formų (ROS) ir reaktyvių azoto formų (RNS) radikalų susidarymu ir jų veikla organizme [2–4]. Dėl laisvųjų radikalų kiekio padidėjimo organizme gali išsivystyti tokios patologijos, kaip vėžys, cukrinis diabetas (CD), širdies ir kraujagyslių sistemos patologijos, nervų sistemos, inkstų ir kepenų sutrikimai, reumatoidinis artritas, autoimuninės, uždegiminės ir neurodegeneracinės ligos bei nutukimas [1,5,6].

Tiriamuoju objektu pasirinkta vaistinė melisa (lot. Melissa officinalis L.), mokslinės literatūros duomenimis, kaupia didelius kiekius fenolinių junginių (FJ), tarp jų ir daug rozmarino rūgšties, kuri yra siejama su stipriomis antioksidacinėmis savybėmis [7]. Antioksidacinės medžiagos gali būti naudojamos ligų gydyme ir prevencijoje [1,8,9], todėl yra svarbu nustatyti fenolinių junginių įvairavimą bei ryšį tarp jų ir antioksidacinio aktyvumo.

Fenoliniai junginiai bus ekstrahuojami ultragarsu, nes tai suteikia galimybę kontroliuoti ekstrakcijos parametrus (temperatūrą ir laiką), kas aktualu termolabiliems fenoliniams junginiams, tai pat dėl greitos, pigios ekstrakcijos ir grynų komponentų išgavimo [10].

Darbo naujumas: Tyrimo metu gauti rezultatai papildo jau esamus turkų mokslininkų Alev Emine İNCE ir kt. (2013) atlikto tyrimo rezultatus. Lyginant su minėtu tyrimu, šiame darbe plačiau ir smulkiau išnagrinėta įvairių faktorių įtaka ekstraktų kokybiniams rodikliams. Vertinta buvo net tik laiko bei ekstrahento ir tiriamosios žaliavos santykio įtaka, bet ir dalelių dydžio bei tirpiklio įtaka fenolinių junginių išgavimui. Be to, buvo nustatytas kiekvieno ekstrakto antioksidacinis aktyvumas ir įvertintas ekstraktų stabilumas.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: naudojant ultragarsą ekstrahuoti fenolinius junginius iš vaistinės melisos (Melissa officinalis L.) lapų, įvertinti veiksnių: tirpiklio, laiko, ekstrahento ir tiriamosios žaliavos santykio, bei dalelių dydžio įtaką, nustatant bendrą fenolinių junginių kiekį bei antioksidacinį aktyvumą.

Darbo uždaviniai:

1. Ekstrahuoti fenolinius junginius iš vaistinės melisos lapų naudojant ultragarsą.

2. Nustatyti ekstrakcijos tirpiklių, ekstrakcijos laiko, ekstrahento ir tiriamosios medžiagos santykio, bei dalelių dydžio įtaką fenolinių junginių išsiskyrimui.

3. Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį.

4. Nustatyti antioksidacinį aktyvumą DPPH metodu. 5. Atlikti ilgalaikį stabilumo tyrimą.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Fenolinių junginių ekstrakcijos proceso apibūdinimas

Ekstrahavimas – tai cheminių medžiagų išgavimas iš tirpalo arba sausos medžiagos, naudojant atitinkamą tirpiklį, nesimaišantį su ekstrahuojamu mišiniu [11]. Šis procesas laikomas pagrindiniu žingsniu paruošiant mėginius cheminei medžiagų analizei [12,13].

Fenolinių junginių ekstrakcijai yra naudojami tiek tradiciniai ekstrakcijos metodai (maceracija, perkoliacija, ekstrakcija Soksleto aparatu), tiek naujos kartos metodai (ekstrakcija ultragarsu, mikrobangų ekstrakcija, superkritinių skysčių ekstrakcija ir kt.) [14,15]. Pagrindinis reikalavimas, keliamas visiems išvardintiems metodams, tai aukštos kokybės veikliųjų medžiagų išgavimas [12].

Ekstrakcijos proceso išeiga priklauso nuo:

 Dalelių dydžio. Smulkinimas palengvina difuzijos procesą, reikšmingai padidindamas paviršiaus plotą tarp žaliavos dalelių ir tirpiklio [12,16,17];

 Tirpiklio. Poliniams junginiams ekstrahuoti yra naudojami poliniai tirpikliai. Yra nustatyta, kad fenoliniai junginiai geriausiai ekstrahuojasi, kai naudojamas tirpiklis – metanolis, etanolis, etilacetatas ir t.t. [12,16];

 Temperatūros. Temperatūros kėlimas greitina ekstrakciją, bet reikia atsižvelgti į tai, kad fenoliniai junginiai aukštoje temperatūroje suyra [12,16,17];

 Laiko. Ilgėjant ekstrakcijos proceso trukmei, išekstrahuotų junginių kiekis didėja. Tačiau norint išvengti fenolinių junginių oksidacijos, sąlygotos ilgo ekstrakcijos proceso, reikia siekti to, kad išekstrahuotų junginių maksimumas būtų pasiektas kuo greičiau [12,16,17];

 Balastinių medžiagų buvimo (pvz. pektinų) [12,16];

 Ekstrakcijos metodo [12,16].

1.1.1. Maceracija

Maceracija – tai seniausias, paprasčiausias ir ilgą laiką pagrindiniu laikytas ekstrakcijos metodas. Šio proceso metu stambiai susmulkinta žaliava bei tirpiklis yra patalpinami į stiklinį indą, kuris užkemšamas kamščiu. Procesas vykdomas kambario temperatūroje, mažiausiai 3 dienas, dažnai purtant. Po to ištrauka nupilama, likusi žaliava nuspaudžiama, išplaunama nedideliu kiekiu švaraus tirpiklio ir vėl nuspaudžiama [11,17]. Dabar šis ekstrakcijos metodas yra naudojamas vis rečiau dėl

proceso efektyvumą mažinančių veiksnių – ilgai vykstančio difuzijos proceso, didelio sunaudojamo ekstrahento kiekio (tirpiklis nuolat garuoja), didelių energijos sąnaudų (išbrinkusią žaliavą sunku maišyti), taip pat dėl ne pilno žaliavos išekstrahavimo, bei kartu su aktyviaisiais junginiais išsiekstrahuojančių didelės molekulinės masės balastinių medžiagų (gleivių, pektinų, baltymų). Šio metodo privalumai – paprastas naudojimas ir nesudėtinga aparatūra [11,18]. Siekiant gauti didesnę išeigą, dažniau yra naudojami tokie maceracijos metodai:

1) Cirkuliacinė maceracija, kurios metu iš apatinės maceratoriaus dalies susidariusi ištrauka periodiškai nupilama ir vėl užpilama ant žaliavos viršaus.

2) Frakcinė maceracija, kai ekstrahentas dalijamas į kelias porcijas, kuriomis žaliava užpilama kelis kartus.

3) Ultragarsinė maceracija – žaliavos ir ekstrahento mišinio veikimas ultragarsu [11].

1.1.2. Perkoliacija

Pagrindiniai perkoliaciją sudarantys etapai – žaliavos brinkinimas, pakrovimas į perkoliatorių, užpylimas ekstrahentu ir pati perkoliacija. Perkoliacijos esmė – pro ekstrahuojamos žaliavos sluoksnį tam tikru greičiu leidžiamas ekstrahentas, o tuo metu ištirpusios ekstrakcinės medžiagos difunduoja iš žaliavos į tirpiklį [11,17]. Šis metodas yra pranašesnis už maceraciją, nes žaliava nuolat plaunama vis naujomis tirpiklio porcijomis ir šitaip palaikomas didelis koncentracijos skirtumas, sudaromos palankios intensyvios difuzijos ir visiško žaliavos ekstrahavimo sąlygos [11]. Ekstrahentas, judėdamas pro augalinės žaliavos sluoksnį, nenutrūkstamai nuplauna nuo žaliavos dalelių paviršiaus ekstrahuotas medžiagas ir perneša jas į kitus žaliavos sluoksnius. Ekstrahuojama žaliava nejuda, o juda sotusis ekstrahuotų medžiagų ekstrahento srautas. Šiuo metodu galima išekstrahuoti 95% ekstraktyvų, esančių žaliavoje. Svarbu pasirinkti tinkamą perkoliacijos greitį tam, kad spėtų įvykti difuzija tarp ląstelėse esančių ištirpusių medžiagų ir ekstrahento [11,17]. Šio metodo trūkumas – ekstrahentu naudojant alkoholio ir vandens mišinį, alkoholiui išgaravus, ištrauka lieka vandeninė. Naudojant alkoholį kaip ekstrahentą, kartu su alkoholiu išgaruoja ir išekstrahuoti junginiai. Procesas ilgai trunka ir nėra ekonomiškas, reikalauja didelių tirpiklių kiekių [17].

1.1.3. Soksleto aparatas

Ilgą laiką (beveik šimtmetį) ekstrakcija Soksleto aparatu buvo plačiausiai naudojamas ekstrahavimo metodas, kurio privalumai pranoko trūkumus. Principo esmė – sausa analizuojama

medžiaga dedama į kapsulę, kuri talpinama į distiliavimo kolbą su tirpikliu. Kolba sujungiama su šaldytuvu ir virinama, kol skystis pasiekia persipylimo lygį. Perdistiliuotas ekstrahentas ir ištirpinta medžiaga kartu su ekstrahentu sifoninio vamzdelio pagalba įtraukiama ir grąžinama atgal į distiliavimo kolbą (į bendrą ekstrahento kiekį). Operacija yra kartojama tol, kol ekstrahavimas baigiasi [19]. Privalumai – nuolatos tiekiamos šviežios ekstrahento porcijos, todėl veikliosios medžiagos lengviau pereina į tirpiklį, procesas nereikalauja filtravimo ir yra paprastas naudoti. Trūkumai – reikalingi dideli ekstrahento kiekiai, ilgas bandinio paruošimo laikas, metodas nėra ekonomiškas, netinkamas šilumai jautrioms medžiagoms ekstrahuoti [19,20]. Šiuo metu tradicinį Soksleto aparatą keičia automatizuoti įrengimai – tiriamoji medžiaga yra veikiama mikro arba ultragarso bangomis. Taip pagreitėja ekstrakcijos procesas, sunaudojama mažiau ekstrahento, padidėja produkto išeiga ir kokybė, tačiau procesas reikalauja didelių finansinių išlaidų ir nėra universalus [19].

1.1.4. Ekstrakcija ultragarsu

Ultragarsas, ekstrakcijos išeigos padidinimui, mokslinių tyrimų laboratorijose pradėtas naudoti 1950-aisiais metais, tam panaudojant paprastą, valymui skirtą ultragarso vonelę [21,22]. Ultragarsas skleidžia garso bangas, viršijančias 20 kHz, šie mechaniniai virpesiai didina skvarbą, sukelia įtrūkimus arba ardo biologines ląstelių sieneles, taip palengvindami medžiagų išsiskyrimą [10,23].

Ekstrakcijos išeigos padidėjimas yra aiškinamas slėgio ir kavitacinių reiškinių susidarymu. Pagrindinę įtaką skysčio terpei daro garso bangų spaudimas, kuris prisideda prie jau veikiančio hidrostatinio slėgio. Sprogimo metu pagaminami kavitaciniai burbuliukai, kurie sukelia makroturbulenciją, greitus dalelių susidūrimus, spartinančius sūkurių ir vidinės difuzijos plitimą. Kavitacijos sukelti turbulentiniai srautai greitina tirpiklio įsiskverbimą į ląsteles ir nukreipia greitai judančią tirpiklio srovę iš ląstelės vidaus į paviršių. Kavitacija medžiagos paviršiuje sukuria mikro srautų susidūrimus, taip sukeldama ląstelės suardymą [10,21].

Ištraukos išgavimui įtakos turi ne tik laikas, temperatūra ir tirpiklio parinkimas, bet taip pat ir bangų dažnis ir ultragarso bangos pasiskirstymas. Fenolinių junginių išgavimui ultragarsas naudojamas tiek statiniuose, tiek ir dinaminiuose režimuose. Statinėje sistemoje ekstrakcija vyksta uždarame kapiliare, kuriame nėra nuolatinio tirpiklio padavimo. Dinaminėje sistemoje tirpiklis tiekiamas nepertraukiamai, todėl veikliosios medžiagos efektyviai absorbuojamos. Nepertraukiamas išgautų medžiagų perdavimas apsaugo termolabilius junginius nuo degradacijos šilumos poveikyje [10].

Du labiausiai paplitę ultragarso bangų patekimo į mėginį keliai – zondų ir vonios sistemos. Zondų sistemoje zondas, skleidžiantis ultragarso bangas, visą laiką liečiasi su mėginiu, o vonios

sistemoje ultragarso bangos veikia visus mėginius, esančius vonioje. Naudojant zondų sistemą, egzistuoja didelė mėginio užterštumo rizika, vonios sistema pasižymi didele išeiga [10,23,24].

Ekstrakcija ultragarsu suteikia galimybę reguliuoti ekstrakcijos temperatūrą. Tai yra aktualu termolabiliems junginiams (pvz. fenoliniams junginiams), kurių išgavimas gali vykti žemoje temperatūroje, tirpalui lengvai įšilus nuo mechaninių judesių. Tai ne tik nesuardo termolabilių junginių, bet ir pagreitina patį ekstrakcijos procesą. Ekstrahuojant fenolinius junginius svarbu kontroliuoti ir ekstrahavimo laiką, nes per ilgas ekstrahavimas gali pakenkti ekstrakto kokybei. Ekstrakcija ultragarsu, dėl didelio efektyvumo išeigos ir greičio požiūriu, dažnai naudojama išgauti junginius, pasižyminčius dideliu antioksidaciniu aktyvumu [25].

Šiuo metu tai vienas iš perspektyviausių ekstrahavimo metodų, kuris leidžia išgauti chemiškai grynus ir biologiškai aktyvius junginius iš natūralių augalinių žaliavų, be to, ekstrakcijai galima naudoti visus žinomus tirpiklius. Tai nebrangi, paprasta ir efektyvi alternatyva tradiciniams metodams [10,23]. Pagrindiniai privalumai – greitesnė difuzija ir kinetika, trumpas ekstrakcijos laikas, galimybė veikti nepertraukiamai ir žemoje temperatūroje, o lyginant su ekstrakcija mikrobangomis, šis metodas yra pigesnis ir paprastesnis naudoti. Ekstrakcija ultragarsu tinkama termolabiliems junginiams ekstrahuoti, kurie gali pakisti aukštos temperatūros poveikyje, ekstrahuojant juos Soksleto aparatu [10,23]. Bet metodas turi ir trūkumų – ultragarsas gali ne tik pakeisti molekulių struktūrinę konformaciją, erdvinę orientaciją ir savybes, bet ir suardyti molekulių grandinę į atskirus fragmentus [18].

1.1.5. Mikrobangomis skatinama ekstrakcija (MSE)

Mikrobangos – tai elektromagnetinės bangos, susidedančios iš elektrinio ir magnetinio lauko, kurie vibruoja statmenai vienas kito atžvilgiu, sukeldami dažnių svyravimus nuo 0,3 GHz iki 300 GHz. Mikrobangos sukelia molekulių judėjimą iš medžiagos ar tirpiklio, sąveikaudamos su poliariniu komponentu, ko pasekoje mėginys įšyla [10,26]. Šylant augalinė žaliava praranda savo drėgmę, garų poveikyje žaliavos ląstelės išsipučia, vėliau plyšta, išleisdamos į aplinką savo aktyviuosius komponentus [10].

Ekstrahuojant fenolinius junginius svarbu parinkti tinkamą tirpiklį, atsižvelgiant į jo virimo temperatūrą ir dielektrines savybes. Kuo didesnė tirpiklio dielektrinė konstanta, tuo daugiau jis sugeria mikrobangų energijos ir tuo didesnė išeiga gaunama. Polifenoliai dėl savo struktūroje esančių hidroksilo grupių yra dipoliai, galintys sugerti energiją, todėl šis metodas gali būti naudojamas fenoliniams junginiams išgauti [10]. Mikrobangų ekstraktoriuje galima nustatyti galią, taip išvengiant temperatūros pertekliaus ir apsaugant termolabilius junginius nuo degradacijos [24]. Lyginant su kitais

metodais, šis metodas gana pigus, trumpa junginių išgavimo trukmė (dažniausiai iki 30 min.), ekstrakcijai reikalingi maži tirpiklio kiekiai [10,24,27].

1.1.6. Superkritinių skysčių ekstrakcija

Ekstrakcija superkritiniais skysčiais – tai procesas, kuomet naudojami kritiniai tirpikliai su skirtingomis fizikinėmis savybėmis, tokiomis kaip tankis, difuzijos koeficientas, klampumas ir dielektrinė konstanta. Dėl superkritinių skysčių mažo klampumo ir sąlyginai aukšto difuzijos koeficiento, vyksta greitas medžiagų pernešimas [28].

Dažniausiai naudojamas ekstrahentas – CO2 dujos. Jos yra chemiškai stabilios, mažai

toksiškos, nėra degios, be to, turi švelnią kritinę temperatūrą (31,2º) [10,28], būtiną termolabilių junginių ekstrakcijai ir jų išskyrimui iš mėginio [10].

Fenoliniai junginiai sunkiai tirpsta polinėse CO2 dujose [24], dėl to jos nėra tinkamos

poliarinių fenolinių junginių ekstrakcijai. Šių trūkumų pašalinimui ir ekstrahavimo išeigos padidinimui rekomenduojama ekstrakciją papildyti modifikatoriais, padidinančiais polinių junginių tirpumą. Modifikatoriais gali būti tokie poliniai tirpikliai, kaip etanolis, metanolis, acetonas ir etilo acetatas [10,24].

Metodo privalumai – reikalingi labai maži tirpiklių kiekiai, trumpas ekstrakcijos laikas, lengvas veikliųjų medžiagų išskyrimas iš mėginio, junginiai apsaugoti nuo oro, šviesos poveikio, užteršimo rizika žymiai mažesnė negu ekstrahuojant kitais metodais. Metodo trūkumas – labai brangi įranga [10,28].

1.2.

Fenoliniai junginiai

Fenoliniai junginiai yra labiausiai paplitusios fitocheminės medžiagos. Tai antriniai augalų metabolitai, kurie yra svarbūs fiziologiniams ir morfologiniams procesams [29-31]. Jie apsaugo augalus nuo UV spindulių, turi įtakos jų augimui ir reprodukcijai [29,32]. Fenoliniai junginiai tai pat apsaugo nuo ligų sukėlėjų, turi priešmikrobinių ir priešgrybelinių savybių. Kai kurie fenoliniai junginiai sintezuojasi kaip atsakas į patogeną, pvz., pažeidus augalo ląstelės sienelę, pažeidimo vietoje pradeda kauptis fenoliniai junginiai, kurie stabdo tolimesnę ląstelių žūtį bei mikroorganizmų dauginimąsi [33]. Fenoliniai junginiai turi įtakos augalo spalvai, skoniui, kvapui ir oksidaciniam stabilumui [30].

Fenoliniai junginiai gali būti klasifikuojami į skirtingas grupes, priklausomai nuo fenolinių žiedų kiekio, struktūrinių elementų, jungiančių tuos žiedus ir hidroksilo grupių, esančių aromatiniame žiede. Jie plačiai klasifikuojami į penkias klases – fenolines rūgštis, flavanoidus, stilbenus, kumarinus ir taninus [30,32].

Fenolinės rūgštys yra skirstomos į dvi grupes: hidroksibenzenkarboksi rūgštys ir hidroksicinamono rūgštys. Hidroksibenzenkarboksi rūgštys sudarytos iš C6-C1 struktūros. Tarpusavyje rūgštys skiriasi aromatinio žiedo hidrosilo ir metoksi grupių pakaitais. Šioms rūgštims priskiriamos p-hidroksibenzoinė, protokatechininė, vanilino, siringo ir galo rūgštys. Antroji grupė turi būdingą C6-C3 struktūrą su trijų anglies atomų šonine grandine. Šiai grupei priklauso p-kumarino, kofeino, ferulo ir sinapo rūgštys [30,34].

Fenoliniai junginiai, randami maiste, yra viena svarbiausių žmonių mitybos racione esančių natūralių antioksidantų grupių. Jų natūraliai randama vaisiuose, daržovėse, grūduose, arbatoje ir eteriniuose aliejuose [30,35]. Epidemiologiniai ir klinikiniai tyrimai įrodo, kad mitybos raciono papildymas fenoliniais junginiais gerina žmonių sveikatą, mažina riziką susirgti ir užkerta kelią daugelio degeneracinių ligų, tokių kaip vėžys, širdies ir kraujagyslių ligos, medžiagų apykaitos sutrikimai, vystymąsi [29,35,36]. Antioksidacinis ir antiuždegiminis aktyvumas priklauso nuo ypatingų fenolinių junginių cheminių struktūrų. Aromatinės savybės ir konjuguota sistema su keliomis hidroksi grupėmis, yra geri elektronų ir vandenilio atomų donorai. Būtent jie neutralizuoja laisvuosius radikalus ir kitas reaktyvias deguonies formas [35].

Dauguma fenolinių junginių maiste egzistuoja esterių, glikozidų ir polimerų formoje. Tam, kad fenoliniai junginiai būtų absorbuoti žmogaus organizme, jie turi būti hidrolizuoti žarnyno fermentų ir mikrofloros. Prieš absorbciją junginiai yra modifikuojami, pirmiausia juos konjuguojant skrandžio ląstelėse, o vėliau kepenyse metilinant, sulfoninant ir/arba glukoronizuojant. Po metabolizmo kepenyse metabolizuoti junginiai patenka į kraują ir yra išnešiojami po audinius [30,31].

1.3. Antioksidacinis aktyvumas

Oksidacinis stresas išsivysto dėl atsiradusio disbalanso tarp oksiduojančių medžiagų ir antioksidantų [3]. Oksidacinis stresas – tai reiškinys, siejamas su pernelyg dideliu reaktyvių deguonies formų (ROS) ir reaktyvių azoto formų (RNS) radikalų susidarymu ir jų veikla organizme [2–4]. Oksidacinio streso poveikis priklauso nuo susidariusių radikalų tipo bei sudėties, jų susidarymo vietos ir susidarymo intensyvumo [2,37].

ROS laisvieji radikalai – tai superoksido anijonas (O2-), peroksilo radikalas (HOO•),

RNS laisvasis radikalas – peroksinitritas (ONOO-_{). Laisvieji radikalai susidaro mitochondrijose}

normalaus metabolizmo metu, per ksantinų oksidazę, uždegiminius procesus, fagocitozę, išemiją ir intensyvaus fizinio krūvio metu. Išorės veiksniai tai pat gali skatinti laisvųjų radikalų gamybą, pvz., rūkymas, aplinkos teršalai, radiacija, vaistai, pesticidai, pramoniniai tirpikliai ir ozonas [3,6]. Pusiausvyra tarp ROS gamybos ir neutralizavimo yra labai jautri, ir jeigu šis balansas yra linkęs į padidėjusią ROS produkciją, ląstelės pradeda kentėti nuo oksidacinio streso [6].

Dėl ROS ir RNS pakitimų (padidėjimo) organizme gali išsivystyti tokios patologijos, kaip vėžys, CD, širdies ir kraujagyslių sistemos patologijos, įskaitant aterosklerozę, insultą ir hipertenziją, nervų sistemos, inkstų ir kepenų sutrikimai, reumatoidinis artritas, autoimuninės ligos, uždegiminės ligos, neurodegeneracinės ligos, susijusios su senėjimu, katarakta, nutukimu ir kt. [5,6].

Žmogaus antioksidantinė sistema yra padalinta į dvi grupes – fermentinius antioksidantus ir ne fermentinius antioksidantus [38]. Fermentiniai antioksidantai - glutationo peroksidazė, katalazė, superoksido dismutazė. Nefermentiniai – vitaminas A, fermentų kofaktoriai (Q10), azoto junginiai (šlapimo rūgštis), peptidai (glutationas), fenoliniai junginiai ir kt. [6].

Kai antioksidantas sunaikina laisvuosius radikalus, jis pats oksiduojasi. Todėl antioksidantų ištekliai turi būti nuolatos atnaujinami. Antioksidantai selektyviai veikia tik konkrečias sistemas, kitose sistemose tas pats antioksidantas gali būti neveiksmingas [38].

Antioksidantai gali veikti keliais būdais: 1) kaip laisvųjų radikalų inhibitoriai oksidacijos reakcijos metu, kurie slopina lipidų laisvųjų radikalų susidarymą (prevenciniai antioksidantai); 2) nutraukdami grandininę oksidavimo reakciją (grandinės nutraukimo antioksidantai); 3) slopindami singuletinį deguonį; 4) per sinergizmą su kitais antioksidantais; 5) kaip reduktoriai, kurie paverčia hidroperoksidus stabiliais junginiais; 6) kaip metalų absorbentai, kurie paverčia metalinius prooksidantus į stabilius junginius; 7) kaip prooksidacijos fermentų inhibitoriai (lipogenazė) [3,6].

1.4. Vaistinės melisos (lot. Melissa officinalis L.) apibūdinimas

Vaistinė melisa (lot. Melissa officinalis L.) – daugiametis 30-100 cm aukščio žolinis malonaus citrinos kvapo augalas. Šakniastiebis labai šakotas, šaknys gelsvos. Stiebas status, keturbriaunis, šakotas, apaugęs plaukeliais. Lapai kotuoti, kiaušiniški arba apskritai rombiški, 3-8 cm ilgio ir 2-6 cm pločio, šiek tiek raukšlėti, kraštai dantyti, viršūnės smailios, viršus plaukuotas, blizgantis. Žiedai viršutinių lapų pažastyse, susitelkę po 3-12 netikruose menturiuose. Vainikėlis balsvas arba šviesiai rausvas [39].

Šeima: Notreliniai (Lūpažiedžiai) – Lamiaceae (Labiateae) [7,39,40]. Vaistinė žaliava: Melisų lapai (Melissae folium) [39].

Paplitimas: Plačiai auga Centrinėje ir Pietinėje Europoje, Mažojoje ir Pietvakarių Azijoje, taip pat sutinkama ir tropinėse šalyse (Brazilijoje) [38,39].

1.5. Vaistinės melisos cheminė sudėtis

1. Hidroksicinamono rūgštys:

a. rozmarino rūgštis (RA) iki 6 proc. b. p-kumarino rūgštis

c. kofeino rūgštis

2. Eteriniai aliejai iki 0,37 proc. a. monoterpenai

b. seskviterpenai

Tarp jų svarbiausi: citralis, citronelalis, geraniolis, nerolis, linalolis ir kt.; 3. Flavanoidai (kvercetinas, kempferolis, apigeninas, luteolinas);

4. Taninai;

5. Triterpeninės rūgštys (ursulo ir oleanoliko rūgštis); 6. Askorbo rūgštis;

7. Rauginės medžiagos; 8. Saponinai [7,39,41–43]

1.6. Vaistinėje melisoje esančių junginių biologinis aktyvumas

Viena seniausių vaistinės melisos indikacijų – nervų sistemos sutrikimų, tokių kaip nemiga, stresas ir kt., gydymas [40,44,45]. Klinikiniai tyrimai rodo, kad standartizuotas melisos ekstraktas sumažina nerimo apraiškas ir su nerimu susijusius simptomus pacientams, sergantiems nerimo sutrikimais [40]. Dėl streso ir nervinės įtampos pasireiškia gerybiniai širdies plakimai. Buvo atliktas dvigubai aklas, randomizuotas, placebo kontroliuojamas tyrimas tam, kad įvertinti sauso melisos ekstrakto, naudojamo gerybinio širdies plakimo gydyme, susijusio su nervine įtampa ir stresu, efektyvumą ir saugumą. Tyrime dalyvavo 71 savanoris. Tiriamieji suskirstyti į dvi grupes – vienai grupei ambulatoriškai 14 dienų buvo skiriama po 500 mg du kartus dienoje liofilizuoto vandeninio M. officinalis L. lapų ekstrakto, o kitai grupei skirtas placebas. Rezultatai parodė, kad pacientų, naudojusių melisos ekstraktą, vidutinis širdies susitraukimo dažnis suretėjo ir žymiai sumažėjo pacientų nerimas. Be to, M. officinalis L. ekstraktas nesukėlė jokių rimtų šalutinių poveikių [46].

Teigiamas poveikis pasireiškė dėl M. officinalis L. gebėjimo slopinti GABA transaminazę (GABA-T). Šį poveikį lemiantys veiklieji junginiai – polifenoliai, flavanoidai ir terpenai, nors visgi svarbiausią vaidmenį atliko rozmarino ir ursolo rūgštys [44,45].

Dėl fenolinių junginių – kofeino, p-kumarino ir rozmarino rūgšties – yra nagrinėjamas vaistinės melisos antivirusinis aktyvumas prieš 1 tipo Herpes simplex virusą (HSV-1). Rozmarino rūgštis slopina HSV-1 prisirišimą prie motininių ląstelių, slopina viruso replikaciją ir baltymų sintezę [47,48]. Antivirusiniam vandeninio melisos ekstrakto poveikiui nustatyti buvo užaugintos dvi ląstelių padermės. Viena ląstelių padermė buvo jautri, o kita rezistentiška acikloviro poveikiui (acikloviras – pagrindinis vaistas vartojamas HSV-1 gydyme). Veikiant ekstraktu, viruso įsiterpimas į ląsteles buvo inhibuotas atitinkamai 80% ir 96% [48]. Melisos ekstraktas turi įtakos viruso prisirišimui ir įsiskverbimui. Buvo įrodyta, kad antivirusinis poveikis efektyviausias ankstyvosiose stadijose, atsiradus pirmiems simptomams, stabdo infekcijos plitimą į sveikąsias ląsteles, blokuodamas kelią tarp ląstelių šeimininkų ir viruso receptorių. Be to, nustatyta, kad melisos vandeninis ekstraktas yra mažai toksiškas [47,48].

Etanoliniai vaistinės melisos lapų ekstraktai tai pat gali būti naudojami insulino rezistentiškumui, dislipidemijai ir hipercholesterolemijai gydyti [40]. Melisos ekstraktas aktyvina peroksisominių proliferatorių aktyvinamus receptorius (PPAR), kurie atsakingi už gliukozės ir lipidų apykaitą. Buvo atliktas tyrimas, kurio metu žiurkės, sergančios 2 tipo CD, buvo gydomos vaistinės melisos eteriniu aliejumi, skiriant po 200 mg/kg per dieną, 6 savaites. Jau po 2 savaičių buvo pastebėtas gliukozės, cholesterolio ir trigliceridų koncentracijų sumažėjimas kraujyje, bei sumažėjęs atsparumas insulinui [49]. Eteriniame aliejuje, išgautame iš melisos lapų, buvo nustatyta rozmarino rūgštis, apigeninas, kvercetinas ir liuteolinas, visi šie junginiai buvo indentifikuoti kaip PPAR ligandai [49]. P. Jandaghi ir kt. (2016) atliko dvigubai aklą, placebu kontroliuojamą, randomizuotą tyrimą, kuriame dalyvavo 58 tiriamieji, sergantys hiperlipidemija. Tiriamieji buvo suskirstyti į dvi grupes. Pirmosios grupės pacientai 2 mėnesius 3 kartus per dieną gaudavo M. officinalis L. lapų miltelių kapsules po 1000 mg, kitos grupės pacientai – placebo. Tyrimo pabaigoje buvo nustatytas žymus mažo tankio lipoproteinų (MTL) sumažėjimas [50].

Melisos ekstraktai dėl savo cheminių ir farmakologinių savybių dažnai pasirenkami Alzheimerio ligos sukeltam drebuliui valdyti. Juose gausu flavanoidų ir fenolinių rūgščių, kurios turi apsauginį poveikį neuronų funkcijai, sukelia anksiolitinį, sedatyvinį, hipnotizuojantį poveikį [51,52]. Raminamasis efektas pasireiškia per monoamino oksidazės (MAO) ir acetilcholinesterazės (AChE) inhibavimą, bei dėl giminingumo GABA-benzodiazepinų receptoriams [52]. Efektui nustatyti buvo atliktas 4 savaites trunkantis dvigubai aklas, placebu kontroliuojamas, randomizuotas tyrimas. Tyrime buvo naudotas melisos eterinis aliejus aromaterapijai, donepezilas (vaistas Alzeimerio ligos gydymui) ir placebas. Du kartus per dieną tiriamieji įmasažuodavo eterinį aliejų į rankas ir žastą. Tiriamųjų

grupė, kurioje buvo taikoma aromaterapija, parodė geresnius rezultatus, nei donepezilo ir placebo grupės [53]. Rezultatai parodė, kad melisos ekstrakto aromaterapija yra veiksminga gydant lengvo ir vidutinio sunkumo Alheimerio ligą [40,53].

Manoma, kad melisos ekstraktai, dėl savo antioksidacinių savybių, gali būti naudojami Greivso ligos gydyme. Duomenys rodo, kad melisos ekstraktas, tiesiogiai jungdamasis prie skydliaukės receptorių, blokuoja tiroidus stimuliuojančius receptorius, bei tuo pačiu veikia ir patį tiroidus stimuliuojantį hormoną. Tokiu būdu pasireiškia antitiroidinės melisos ekstrakto savybės [40,54,55].

Atlikta daug tyrimų, kurie parodo, jog fenoliniai junginiai, o ypač RA, veiksmingai apsaugo organizmą nuo žalingo laisvųjų radikalų poveikio. M.A. Encalada ir kt.(2011) vykdė in vitro tyrimą, kurio metu atliko M. officinalis L. ekstrakto citotoksiškumo analizę prieš žmogaus storosios žarnos vėžines ląsteles. Nustatyta, kad veikiant vėžines ląsteles 5μg/ml 50% etanoliniu melisos ekstaktu, po 72 val, ląstelių proliferacija sumažėjo 40%. Atskirai vertintos ir RA citotoksinės savybės. Veikiant ląsteles 1,000 μg/ml RA, ląstelių skaičius reikšmingai sumažėjo dar prieš vertinimą (24 h) [56]. Autorių nuomone, RA mažina vėžinių ląstelių proliferaciją [56,57], o antioksidantai yra puiki priemonė vėžinių ligų prevencijai [56].

Vaistinė melisa jau ilgą laiką yra vartojama skrandžio ir žarnyno funkciniams sutrikimas gydyti: pilvo skausmams, pilvo pūtimui, diegliams, pykinimui ir virškinimo sutrikimui [7,40,57]. Taip pat slopina skrandžio ir žarnyno lygiųjų raumenų susitraukimus. Spazmolitinis poveikis pasireiškia dėl citralio, komponento, randamo eteriniame aliejuje. In vivo atliktame tyrime, panaudojant žiurkių klubines žarnas, nustatyta, kad eterinis aliejus ir citralis pasižymi stipriu raumenų susitraukimus slopinančiu poveikiu sukeltu KCl, 5-HT ir Ach [42].

Mokslinėje literatūroje tai pat yra duomenų, kad vaistinė melisa dėl RA pasižymi antialerginiu poveikiu [40,58]. Vaistinė melisa gali būti vartojama amenorėjai gydyti [38], o etanolinės ištraukos gali būti naudojamos galvos ir dantų skausmams malšinti, nes pasižymi ciklooksigenazę-2 (COX-2) slopinamuoju poveikiu [40,59]. Taip pat tinka vartoti karščiuojant ir sergant lėtiniu bronchitu [40].

1.7. Literatūros apžvalgos apibendrinimas

Fenoliniai junginiai dėl savo antioksidacinių savybių pastaruoju metu dažnai tampa įvairių tyrimų objektu. Šių junginių ekstrakcijai iš augalinių žaliavų gali būti naudojami įvairūs metodai: maceracija, perkoliacija,, ekstrakcija Soksleto aparatu, ekstrakcija ultragarsu, mikrobangomis skatinama ekstrakcija ir kiti. Tačiau pasirenkant ekstrakcijos metodą būtina atsižvelgti į metodo privalumus ir trūkumus siekiant išgauti kuo didesnį fenolinių junginių kiekį ir kokybišką ekstraktą.

Mokslinės literatūros duomenimis, vaistinė melisa (lot. Melissa officinalis L.) kaupia didelius kiekius fenolinių junginių, tarp jų ir daug RA, kurių veikla siejama su stipriomis antioksidacinėmis savybėmis.

Dėl oksidacinio streso organizme gali išsivystyti tokios patologijos, kaip vėžys, CD, širdies ir kraujagyslių sistemos patologijos, nervų sistemos, inkstų ir kepenų sutrikimai, reumatoidinis artritas, autoimuninės ligos, uždegiminės ligos, neurodegeneracinės ligos, nutukimas ir kt. Antioksidantinės medžiagos gali būti naudojamos šių ligų gydyme ir prevencijoje. Todėl yra svarbu nustatyti fenolinių junginių įvairavimą vaistinės melisos žolėje ir įvertinti antioksidantinio aktyvumo priklausomybę nuo fenolinių junginių kiekio.

2. TYRIMO METODIKA

Tiriamasis objektas

Eksperimentinio tyrimo objektas – sausi vaistinės melisos (Melissa officinalis L.) lapai ir ultragarsinės maceracijos metodu pagamintos ištraukos. Žaliavos gamintojas UAB “Acorus Calamus”, Lietuva. Analizuojami ekstraktai pagaminti iš papildomai nesmulkintos žaliavos (nesmulkinta žaliava), kurios dalelių dydis 2,5 mm- 125 µm ir iš papildomai susmulkintos žaliavos (susmulkinta žaliava), kurios dalelių dydis 1,6mm- 710 µm.

2.2.

Naudota aparatūra

Tyrimams atlikti ir įvertinti buvo naudoti prietaisai bei aparatūra:

 Analitinės svarstyklės „Axis AD510 , Lenkija“,

 Ultragarso vonelė „Ultrasonic bandelin electronic DT 156 BH, Vokietija“,

 Elektroninis smulkintuvas „Delimano Astoria Grinder PCM/2013, Šveicarija“,

 Sietai „Retsch As 200 basic, Vokietija“,

 Centrifuga „Sigma 3-18 KS, Vokietija“,

 UV Spektrofotometras „Model UV-1800 240V IVDD, Shimadzu, Vokietija“,

 Automatinės pipetės „Pipetman gilson, Prancūzija“,

 Drėgnomatis „KERN MLS, Vokietija“.

2.3.

Naudoti reagentai

1. 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH•) radikalas. Chromatografinio grynumo > 99 proc. (Sigma-Aldrich, Vokietija),

2. Etanolis 96 proc. V/V (AB “Vilniaus degtinė”, Lietuva), 3. Folin-Ciocalteu fenolinis reagentas (Darmstadt, Vokietija),

4. Natrio karbonatas, grynumas > 99,5 proc. (Sigma-Aldrich, Vokietija), 5. Išgrynintasis vanduo (LSMU laboratorija).

2.4.

Augalinės žaliavos nuodžiūvio ir smulkumo nustatymas

Vaistinės melisos nuodžiūvio nustatymas. Augalinės žaliavos (Melissa officinalis L.) nuodžiūvis nustatomas drėgnomačiu „KERN MLS“. Tyrimui naudota 1,0 g iki miltelių pavidalo susmulkintų vaistinės melisos lapų. Žaliava džiovinta 105ºC temperatūroje iki pastovios masės ir nustatyta jos drėgmė. Drėgmė vaistinės melisos lapuose neturi būti didesnė kaip 10 proc. (Ph. Eur. 2.2.32). Atlikti trys lygiagretūs drėgmės matavimai 0,01 proc. tikslumu ir apskaičiuotas aritmetinis vidurkis, kuriame žaliavos masės nuokrypio ribos negali būti didesnės kaip 0,5 proc. [60].

Vaistinės melisos smulkumo frakcijų nustatymas. Norint nustatyti analizuojamos augalinės žaliavos dalelių smulkumą ir atskirti norimą frakciją, atliktas sietų analizės testas. 50,0 g augalinės žaliavos persijota pro sietų rinkinį. Sijojant sumaltą augalinę žaliavą buvo naudojami sietai, kurių angelių dydžiai: 2,5 mm, 2 mm, 1,6 mm, 710 µm, 450 µm, 125 µm. Sijojimo laikas 10 min., amplitudė – 60 svyravimų/min. Po sijojimo atskirai sverta ant kiekvieno sieto likusi žaliava, taip pat išbirusi pro apatinį sietą žaliava ir apskaičiuotas kiekvienos frakcijos procentinis kiekis, atsižvelgiant į atsvertą sijoti žaliavos kiekį.

2.5. Tiriamųjų ekstraktų technologija

Vaistinės melisos lapų ekstraktai buvo gaminti maceracijos metodu ultragarso vonelėje, santykiu 1:10, 1:20 ir 1:30. Atsveriamas tikslus kiekis išdžiovintų vaistinės melisos lapų (gamintojas „Acorus calamus“, Lietuva) – 1 g, 0,5 g, 0,33 g (0,01 g tikslumu), užpilama 10 ml ekstrakcijos tirpikliu. Ekstrakcijos tirpiklis – išgrynintas vanduo arba 50% (V/V) etanolis. Ekstrahuojama 5 min., 10 min., 15 min. ir 30 min., kambario temperatūroje, 35 kHz.

Gautas ekstraktas centrifuguojamas 5 min., 4700 apsisukimų/min. greičiu. Vėliau ekstraktas perfiltruojamas pro sudrėkintą išgrynintu vandeniu filtro popierių į tamsaus 25 ml stiklo buteliuką.

Kiekvieno skirtingo augalinės žaliavos santykio ir tirpiklio (1:10, 1:20, 1:30) buvo pagaminta po 2 etaloninius ekstraktus, tokiomis pačiomis sąlygomis. Ekstraktai gaminti masės-tūrio metodu. 1 lentelėje pateiktos vaistinės melisos lapų ekstraktų gamybos sąlygos.

1 lentelė. Vaistinės melisos lapų ekstraktų gamybos sąlygos

I būdas II būdas III būdas IV būdas

Žaliavos ir tirpiklio santykis 1:10; 1:20; 1:30 1:10; 1:20; 1:30 1:10; 1:20; 1:30 1:10; 1:20; 1:30 Žaliava Nesmulkinti vaistinės melisos lapai Smulkinti vaistinės melisos lapai Nesmulkinti vaistinės melisos lapai Smulkinti vaistinės melisos lapai Ekstrahentas Išgrynintas vanduo Išgrynintas vanduo 50 proc. (V/V) etanolis 50 proc. (V/V) etanolis Ekstrahavimo laikas 5 min.; 10 min.; 15 min.; 30 min. 5 min.; 10 min.; 15 min.; 30 min. 5 min.; 10 min.; 15 min.; 30 min. 5 min.; 10 min.; 15 min.; 30 min.

2.6. Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu

Bendras fenolinių junginių kiekis, išreikštas rozmarino rūgšties ekvivalentu (RRE), nustatytas naudojant standartinį Folin-Ciocalteu metodą, kuris yra pagrįstas kolorimetrine oksidacijos/redukcijos reakcija [61].

Buvo pagaminti darbiniai tirpalai: 7,5% vandeninis natrio karbonato tirpalas bei Fiolin-Ciocalteu reagento tirpalas su išgrynintu vandeniu santykiu 1:10.

Vėliau buvo gaminami ekstraktų skiedimai: ekstraktai, kurie buvo pagaminti santykiu 1:10 skiedžiami 100 kartų, ekstraktai – 1:20 skiedžiami 50 kartų, ekstraktai – 1:30 skiedžiami 25 kartus.

Reakcija atlikta mėgintuvėliuose. Jai buvo imta 2,5 ml Folin-Ciocalteu (skiesto 1:10) tirpalo, pridedant 0,5 ml tiriamojo tirpalo ir 2 ml 7,5% natrio karbonato tirpalo. Tirpalai laikomi 30 min. kambario temperatūroje, kol tirpalų spalva iš žalsvos pasikeičia į mėlyną.

Po 30 min. spektrofotometru matuojama absorbcija 765 nm bangos ilgyje. Palyginamasis tirpalas – išgrynintas vanduo. Gautus rezultatus, koncentraciją, kurią parodo spektrofotometras padauginame iš praskiedimo. Koncentracija išreiškiama – RRE mg/ml. Nubrėžiama kalibracinė kreivė naudojant rozmarino rūgšties 30 proc. (V/V) etanolinį tirpalą (0,0625-1,0 mg/ml). Kreivė pavaizduota 1 paveiksle.

1 pav. Rozmarino rūgšties koncentracijos ir optinio tankio priklausomybės kreivė (R2_=0,9989)

2.7. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH●)

radikalinio sujungimo metodu

Antioksidacinis aktyvumas (AA) nustatomas 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH●) laisvojo radikalo sujungimo metodu. AA įvertinamas matuojant, kiek procentų stabilaus DPPH radikalo neutralizuoja tiriamoje medžiagoje esantys ir antioksidaciniu aktyvumu pasižymintys junginiai.

Pirmiausiai yra ruošiamas etaloninis DPPH tirpalas. Atsveriama 0,01 g DPPH radikalo (0,001 g tikslumu), ištirpinama 96 proc. (V/V) etanolyje, 250 ml tūrio matavimo kolboje iki žymos. Pagamintas tirpalas paliekamas 24h, kad pilnai ištirptų DPPH radikalo milteliai. Etaloninio DPPH tirpalo koncentracija 0,1 mM.

Reakcija atliekama 1 cm pločio kiuvetėse. Į jas, naudojant automatines pipetes, išpilstoma po 2,9 ml etaloninio DPPH tirpalo, tada pridedama 0,1 ml tiriamojo tirpalo. Paliekama 30 min. tamsioje vietoje, kambario temperatūroje.

Eksperimento metu nustatyta, kad ekstraktus, pagamintus santykiu 1:10, reikia skiesti 50 kartų, nes dėl savo intensyvios rudos spalvos, DPPH tirpalo spalva nepakankamai išblunka.

Po 30 min. spektrofotometru išmatuojama mėginių absorbcija 515 nm bangos ilgyje. 96 proc. (V/V) etanolis naudotas kaip palyginamasis tirpalas. Taip pat matuojama etaloninio DPPH tirpalo absorbcija.

Tirpalų aktyvumas apskaičiuojamas inaktyvinto DPPH kiekio procentais:

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Ab so rb cija Koncentracija mg/ml

AA = (A0– At)/A0 × 100 proc.;

kur: AA – antioksidacinis aktyvumas %; A0 – gryno DPPH absorbcija;

At – tiriamojo tirpalo absorbcija po 30 min.

2.8. Stabilumo tyrimas

Ilgalaikio stabilumo testo tikslas yra ištirti bendro fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo pakitimus ekstraktų laikymo metu. Iš visų skirtingų vaistinės melisos lapų ekstraktų tyrimui buvo pasirinkti tie ekstraktai, kurie turėjo didžiausią kiekį fenolinių junginių. Ekstraktai laikyti tamsaus stiklo buteliukuose kambario temperatūroje. Tyrimo trukmė – 6 mėnesiai. Po 6 mėn. atlikti pakartotiniai tyrimai: bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymo tyrimas ir antioksidacinio aktyvumo nustatymo tyrimas. Pagaminti ekstraktai buvo laikomi įprastinėse laikymo sąlygose, t.y. 25±2ºC temperatūroje, esant 60±5 proc. santykinei drėgmei.

Europos vaistų agentūros duomenimis, veikliųjų medžiagų grupei leidžiamos degradacijos ribos turi būti apibrėžiamos ne didesniu kaip ±10 proc. šių junginių kitimu [62,63].

2.9. Tyrimo metu gautų duomenų statistinis vertinimas

Statistinė duomenų analizė atlikta naudojantis “MS Excel 2013” (Microsoft, JAV) ir SPSS 20.0 (SPSS Inc., JAV) programomis. Šių programų pagalba susisteminti duomenys, apskaičiuoti vidurkiai, standartiniai nuokrypiai, paklaidos, pokyčiai bei nubraižyti grafikai, apskaičiuoti Spirmeno koreliacijos koeficientai.

3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APIBENDRINIMAS

3.1. Augalinės žaliavos kokybės vertinimas

Augalinės žaliavos analizė atlikta pagal sk. 2.4 nurodytą metodiką. Nustatytas vaistinės melisos lapų (lot. Melissa officinalis L. folium) nuodžiūvis su „KERN MLS“ drėgnomačiu. Augalinės žaliavos smulkumo frakcijų nustatymui atliktas sietų analizės testas. Gauti rezultatai pateikti 2 ir 3 lentelėse.

2 lentelė. Papildomai nesmulkintų melisos lapų žaliavos analizės rezultatai

Tiriamasis

rodiklis Žaliavos smulkumo frakcijos (%)

Bandymo Nr. Sietas Nr.1 (2,5 mm) Sietas Nr.2 (2 mm) Sietas Nr.3 (1,6 mm) Sietas Nr.4 (710 µm) Sietas Nr.5 (430 µm) Sietas Nr.6 (125 µm) 1. 0,63 1,05 11,84 53,98 17,37 15,13 2. 0,6 1,04 11,88 54,0 17,38 15,11 3. 0,61 1,05 11,86 54,0 17,32 15,16 Vidurkis 61±0,01 1,045±0,05 11,86±0,02 53,99±0,01 17,35±0,03 15,13±0,03 ± standartinis nuokrypis, n=3

3 lentelė. Papildomai susmulkintų melisos lapų žaliavos analizės rezultatai

Tiriamasis

rodiklis Žaliavos smulkumo frakcijos (%)

Bandymo Nr. SietasNr.1 (2,5 mm) Sietas Nr.2 (2 mm) Sietas Nr.3 (1,6 mm) Sietas Nr.4 (710 µm) Sietas Nr.5 (450 µm) Sietas Nr.6 (125 µm) 1. 0,5 1,97 5,12 49,95 22,58 19,72 2. 0,6 1,85 6,0 52,02 21,24 17,87 3. 0,55 1,92 5,02 53,51 20,38 19,04 Vidurkis 0,55±0,05 1,91±0,06 5,38±0,54 51,83±1,79 21,4±1,11 18,89±0,94 ± standartinis nuokrypis, n=3

Melisos lapų nuodžiūvis matuotas 3 kartus, apskaičiuotas bandymų vidurkis. Nustatyta, kad melisos lapų nuodžiūvis yra 7,72±0,02 proc., tai atitinka augalinei žaliavai keliamus reikalavimus (<10 proc.) [60].

 Nesmulkintos analizuojamos žaliavos dalelių dydis yra nuo 2,5 mm iki 125 µm;

 Smulkintos analizuojamos žaliavos didžiausias kiekis prabyrėjo pro sietą Nr. 3 (angelių dydis 1,6 mm) – 51,83±1,79 proc., analizuojamos frakcijos dalelių dydis nuo 1,6 mm iki 710 µm.

3.2.

Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas

Ekstrahuojant ultragarso pagalba, skleidžiamos bangos sudaro kavitacines pūsleles šalia mėginio audinių, ten sprogsta suardydamos biologines ląstelių sieneles, taip palengvindamos, šiuo atveju, fenolinių junginių (FJ) pernašą į tirpiklį [10]. Turkų mokslininkai Alev Emine İNCE ir kt. (2013) tyrė ultragarso ekstrakcijos sąlygų ir ekstrakcijos faktorių – ekstrahavimo laiko bei tirpiklio ir medžiagos santykio įtaką fenolinių junginių išeigai iš Melissa officinalis L. lapų. Nustatė, kad ekstrahavimo laikas ir santykis turi įtakos fenolinių junginių ekstrakcijos išeigai [64].

Fenolinių junginių kiekio įvairavimas vaistinės melisos vandeniniuose ekstraktuose pagamintuose iš nesmulkintų lapų. Didžiausias fenolinių junginių kiekis (FJK) nustatytas ekstrahuojant 15 min. santykiu 1:10, tai yra 51,49±2.83 mg/ml. Mažiausias kiekis – ekstrahuojant santykiu 1:30 15 min. – 13,6±0,99 mg/ml. Rezultatai parodė, kad FJK išsiskyrimui įtakos turi ekstrahavimo laikas bei žaliavos ir tirpiklio santykis. Fenolinių junginių kiekis augalo vandeniniame ekstrakte iš nesmulkintos žaliavos pateiktas 2 pav.

*FJK tarp ekstraktų 1:10 5 min. ir 10 min., tarp ekstraktų 1:20 5 min. ir 15 min. ir tarp ekstraktų 1:30 10 min. ir 15 min. nėra statistiškai patikimo skirtumo (p>0,05), tarp visų kitų p<0,05.

2 pav. Fenolinių junginių kiekio įvairavimas vaistinės melisos vandeniniuose ekstraktuose pagamintuose iš nesmulkintų lapų

Anksčiau minėti Alev Emine İNCE ir kt. (2013) tyrimo metu nustatė, kad iš vandeninių Melissa officinalis L. lapų ekstraktų, didžiausias fenolinių junginių kiekis išsiskiria ekstrahuojant 20 min. [64].

Fenolinių junginių kiekio įvairavimas vaistinės melisos vandeniniuose ekstraktuose pagamintuose iš smulkintų lapų. Nustatyta, kad didžiausias FJK išsiskiria ekstrahuojant 15 min. santykiu 1:10 – 63,26±2,02 mg/ml. Mažiausias kiekis – ekstrahuojant 10 min. santykiu 1:30 – 16,23±1,04 mg/ml. FJK išsiskyrimui įtakos turėjo laikas, santykis ir žaliavos smulkumas. FJ kiekis augalo vandeniniame ekstrakte iš susmulkintos žaliavos pateiktas 3 pav.

*

*

*

_*

*FJK tarp ekstraktų 1:30 5 ir 10 min. ir tarp ekstraktų 1:20 5 min. ir 10 min. nėra statistiškai patikimo skirtumo (p>0,05), tarp visų kitų p<0,05

3 pav. Fenolinių junginių kiekio įvairavimas vaistinės melisos vandeniniuose ekstraktuose pagamintuose iš smulkintų lapų

Lyginant fenolinių junginių išsiskyrimą iš vandeninių melisos lapų ekstraktų, didesnis fenolinių junginių kiekis išsiskyrė iš tų ekstraktų, kurie buvo pagaminti iš susmulkintų lapų. Abiem atvejais didžiausias FJK išsiskyrė ekstrahuojant 15 min. santykiu 1:10, 51,49±2.83 mg/ml ir 63,26±2,02 mg/ml atitinkamai. Jis yra 22,86 proc. didesnis už nesmulkintų lapų ekstrakte nustatytą kiekį. Maria S. Giao ir kt. (2009) tyrė išekstrahuoto FJK priklausomybę nuo žaliavos dydžio. Nustatė, kad iš susmulkintos žaliavos yra išgaunamas didesnis veikliųjų medžiagų kiekis, smulkinimas palengvina medžiagų difuziją, reikšmingai padidina paviršiaus plotą tarp žaliavos dalelių ir tirpiklio [65].

Fenolinių junginių kiekio įvairavimas vaistinės melisos etanoliniuose ekstraktuose pagamintuose iš nesmulkintų lapų. Didžiausias FJK buvo nustatytas ekstrahuojant 15 min. santykiu 1:10 tai yra 71,37±4,25 mg/ml. Mažiausias kiekis – ekstrahuojant santykiu 30 min. 1:30 – 15,86±0,92 mg/ml. Rezultatai parodė, kad FJK išsiskyrimui įtakos turėjo laikas, santykis ir tirpiklis. Fenolinių junginių kiekis augalo etanoliniame ekstrakte iš nesmulkintos žaliavos pateiktas 4 pav.

*

_*

*

*

*FJK tarp ekstraktų 1:20 5 min. ir 10 min. ir tarp 1:30 5 min., 10 min., 15 min. nėra statistiškai patikimo skirtumo (p>0,05), tarp visų kitų p<0,05

4 pav. Fenolinių junginių kiekio įvairavimas vaistinės melisos etanoliniuose ekstraktuose pagamintuose iš nesmulkintų lapų

Fenolinių junginių kiekio įvairavimas vaistinės melisos etanoliniuose ekstraktuose pagamintuose iš smulkintų lapų. Nustatyta, kad ekstrahuojant 10 min. santykiu 1:10 išsiskiria didžiausias FJ kiekis - 78,49±8,06 mg/ml, o mažiausias kiekis – ekstrahuojant santykiu 1:30 15 min. – 18,73±5,49 mg/ml. FJK išsiskyrimui įtakos turėjo visi vertinami faktoriai: tirpiklis, laikas, žaliavos smulkumas ir tirpiklis. FJK melisos etanoliniame ekstrakte iš susmulkintos žaliavos pateiktas 5 pav.

*

_*

*

*

*

*FJK tarp ekstraktų 1:10 5 min. ir 15 min. , tarp - 1:20 10 min. ir 15 min. ir tarp - 1:30 5 min., 10 min., 15 min. ir 30 min. nėra statistiškai patikimo skirtumo (p>0,05), tarp visų kitų p<0,05

5pav. Fenolinių junginių kiekio įvairavimas vaistinės melisos etanoliniuose ekstraktuose pagamintuose iš smulkintų lapų

Lyginant fenolinių junginių išsiskyrimą iš etanolinių melisos lapų ekstraktų, didesnis FJK išsiskyrė iš tų ekstraktų, kurie buvo pagaminti iš susmulkintų lapų. Didžiausias FJK išsiskyrė ekstrahuojant santykiu 1:10 iš nesmulkintų lapų ekstraktų per 15 min. – 71,37±4,25 mg/ml, o iš smulkintų lapų ekstraktų – per 10 min. 78,49±8,06 mg/ml. Jis yra 9,98 proc. didesnis už nesmulkintų lapų ekstrakte nustatytą didžiausią kiekį.

Lyginant didžiausią išsiskyrusį FJK iš vandeninių nesmulkintų melisos lapų ekstraktų (63,26±2,02 mg/ml) ir etanolinių nesmulkintų melisos lapų ekstraktų (71,37±4,25 mg/ml), nustatyta, kad veikliųjų medžiagų išeiga padidėjo 38,61 proc., o palyginus smulkintų lapų vandeninius (63,26±2,02 mg/ml) ir etanolinius ektraktus (78,49±8,06 mg/ml), 24,08 proc. daugiau išsiskyrė iš etanolinių.

Svarbią įtaką fenolinių junginių ekstrakcijai turi laikas. 10 – 15 min. užtenka pakankamai pilnai junginių ekstrakcijai, tai parodo, kad medžiagos gerai difunduoja tirpiklyje. Po 15 min. ekstrakcijos išeiga sumažėja. Tai gali būti dėl to, kad esant ilgesniam ekstrakcijos laikui fenoliniai junginiai suyra [64].

Fenolinių junginių ekstrakcijos išeigai įtakos turi ir ekstrahentas. Didesnis fenolinių junginių kiekis išsiskyrė iš ekstraktų, kurių gamybai buvo naudotas 50 proc. (V/V) etanolis. Tyrimų, kuriuos atliko Pascal C. ir kt. (2012), Kasparavičienė ir kt. (2013), metu nustatyta, kad tarp įvairios

*

*

*

*

*

*

_*

_*

koncentracijos etanolių efektyviausias tirpiklis yra 50 proc. (V/V) etanolis. Tiek vanduo, tiek etanolis puikiai tinka fenoliniams junginiams išgauti, dėl savo polinių savybių. Etanolio ir vandens mišiniai didina laidumą bei fenolinių junginių difuziją [66–68].

3.3. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas

Antioksidacinio aktyvumo nustatymas vaistinės melisos vandeniniuose ekstraktuose pagamintuose iš nesmulkintų lapų. Didžiausias antioksidacinis aktyvumas (AA) nustatytas ekstrakte pagamintame santykiu 1:30, ekstrahuotame 15 min. – 84,87±0,33 %. Mažiausias – 1:10, 5 min. – 37,60 ±5,83 % (6 pav.)

*Antioksidacinio aktyvumo skirtumas tarp ekstraktų 5 min. 1:10, 1:20, 1:30 ir tarp ekstrakto 15 min. 1:30 yra statistiškai patikimas (p<0,05), tarp visų kitų p>0,05

6 pav. DPPH radikalų surišimo geba vaistinės melisos vandeniniuose ekstraktuose pagamintuose iš nesmulkintų lapų

Vertinant tirpiklio ir žaliavos santykio įtaką AA, rezultatai rodo, kad mažėjant žaliavos kiekiui AA didėja, bet skirtumas nėra statistiškai reikšmingas. Vertinant laiko įtaką – po 5 min. išekstrahuota mažiausiai junginių, kurie gali inaktyvuoti laisvuosius radikalus, po 10, 15 ir 30 min. AA yra didesnis, bet statistiškai reikšmingo skirtumo nėra (p>0,05).

Eksperimentinio tyrimo metu, nustatant AA priklausomybę nuo bendro fenolinių junginių kiekio (BFJK), nustatyto vandeniniuose melisos nesmulkintų lapų ekstraktuose, atliktas statistinis įvertinimas. Rezultatai pateikti 4-oje lentelėje.

*

*

*

*

Lentelė 4. Spirmeno ranginės koreliacijos koeficientų matrica Bendras fenolinių junginių kiekis mg/ml Antioksidacinis aktyvumas proc. Bendras fenolinių junginių kiekis mg/ml Koreliacijos koeficientas 1,000 -0,347* Sig. (p-reikšmė) - 0,003 n 72 72 Antioksidacinis aktyvumas proc. Koreliacijos koeficientas -0,347* 1,000 Sig. (p-reikšmė) 0,003 - n 72 72

* Koreliacija yra statistiškai priklausoma (p<0,01).

Atlikus koreliacijos statistinį įvertinimą nustatyta, kad tarp bendro fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo yra statistiškai priklausomas ryšys p=0,003, o koreliacijos koeficientas r=-0,347.

Antioksidacinio aktyvumo nustatymas vaistinės melisos vandeniniuose ekstraktuose pagamintuose iš susmulkintų lapų. Didžiausia laisvųjų radikalų surišimo geba nustatyta ekstrahuojant santykiu 1:30 , 5 min. – 81,83±2,24 %. Mažiausia – ekstrahuojant 30min., santykiu 1:20 – 69,20 ±2,06 % (7 pav.).

*Antioksidacinio aktyvumo skirtumas tarp ekstraktų 5 min. 1:30, 15 min. 1:10, 30 min. 1:30 yra statistiškai patikimas p<0,05, tarp visų kitų nėra p>0,05

7 pav. DPPH radikalų surišimo geba vaistinės melisos vandeniniuose ekstraktuose pagamintuose iš susmulkintų lapų

Rezultatai rodo, kad žaliavos ir tirpiklio santykis neturi įtakos DPPH laisvųjų radikalų surišimo gebai, įtakos turi laikas – po 5 min. AA yra didesnis negu po 30 min.

Didžiausia laisvųjų radikalų surišimo geba yra 1,65 proc. didesnė vandeniniuose ekstraktuose pagamintuose iš susmulkintų lapų, negu iš nesmulkintų.

Tarp FJK, nustatyto vandeniniuose ekstraktuose iš smulkintų melisos lapų, ir DPPH radikalų surišimo gebos, buvo atliktas statistinis įvertinimas. Rezultatai pateikti 5-oje lentelėje.

* * * 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 100.00 5 10 15 30 DP P H rad ik al ų su riš im o geb a, % Laikas, min 1:10 1:20 1:30

Lentelė 5. Spirmeno ranginės koreliacijos koeficientų matrica Bendras fenolinių junginių kiekis mg/ml Antioksidacinis aktyvumas proc. Bendras fenolinių junginių kiekis mg/ml Koreliacijos koeficientas 1,000 -0,411* Sig. (p-reikšmė) - 0,000 n 72 72 Antioksidacinis aktyvumas proc. Koreliacijos koeficientas -0,411* 1,000 Sig. (p-reikšmė) 0,000 - n 72 72

* Koreliacija yra statistiškai priklausoma (p<0,01).

Atlikus koreliacijos statistinį įvertinimą nustatyta, kad tarp bendro fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo yra statistiškai priklausomas ryšys p<0,0001, r=-0,411.

Antioksidacinio aktyvumo nustatymas vaistinės melisos etanoliniuose ekstraktuose pagamintuose iš nesmulkintų lapų. Didžiausias antiradikalinis aktyvumas nustatytas ekstrahuojant santykiu 1:10, 15 min. - 89,48±0,62 % ir 30 min. 89,36±0,89 %. Mažiausias – 5 min. 1:20 – 78,16 ±4,21 % (8 pav.).

*Antioksidacinio aktyvumo skirtumas tarp ekstraktų 15 min. ir 30 min. 1:10 ir kitų ekstraktų yra statistiškai patikimas p<0,05, tarp visų kitų nėra p>0,05

8pav. DPPH radikalų surišimo geba vaistinės melisos etanoliniuose ekstraktuose pagamintuose iš nesmulkintų lapų * * 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 100.00 5 10 15 30 DP P H rad ik al ų su riš im o geb a, % Laikas, min 1:10 1:20 1:30

Gauti rezultatai rodo, kad žaliavos ir tirpiklio santykis neturi įtakos laisvuosius radikalus gebai surišti, skirtumas tarp ekstraktų AA yra statiškai nereikšmingas. Įtakos turėjo laikas, po 15 min. ir 30 min. AA buvo didesnis negu po 5 min., bet statistiškai patikimo skirtumo nėra.

Nustatyta AA priklausomybė nuo BFJK etanoliniuose melisos lapų ekstraktuose iš nesmulkintų lapų, ir atlikto statistinio įvertinimo rezultatai pateikti 6-oje lentelėje.

Lentelė 6. Spirmeno ranginės koreliacijos koeficientų matrica

Bendras fenolinių junginių kiekis mg/ml Antioksidacinis aktyvumas proc. Bendras fenolinių junginių kiekis mg/ml Koreliacijos koeficientas 1,000 0,228* Sig. (p-reikšmė) - 0,054 n 72 72 Antioksidacinis aktyvumas proc. Koreliacijos koeficientas 0,228* 1,000 Sig. (p-reikšmė) 0,054 - n 72 72

* Koreliacija yra statistiškai priklausoma (p<0,01).

Atlikus koreliacijos statistinį įvertinimą nustatyta, kad tarp bendro fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo nėra priklausomybės r=0,228 ir nėra statistiškai reikšmingo skirtumo p=0,054.

Antioksidacinio aktyvumo nustatymas vaistinės melisos etanoliniuose ekstraktuose pagamintuose iš nesmulkintų lapų. Didžiausias antiradikalinis aktyvumas nustatytas ekstrahuojant 15 min. santykiu 1:20 – 90,63±1,99 %. Mažiausias ekstrahuojant 30 min. santykiu 1:20 - 75,62 ±2,53 % (9 pav.).

*Antioksidacinis aktyvumas ekstraktų 30 min. 1:10, 1:20, 1:30 statistiškai skiriasi tarp visų kitų ekstraktų, bet nesiskiria tarpusavyje

9 pav. DPPH radikalų surišimo geba vaistinės melisos vandeniniuose ekstraktuose pagamintuose iš susmulkintų lapų

Rezultatai rodo, kad tirpiklio ir žaliavos santykis antioksidaciniam aktyvumui įtakos neturėjo, įtaką turėjo laikas – po 30 min. AA buvo mažiausias ir reikšmingai skyrėsi nuo visų kitų.

Didžiausia laisvųjų radikalų surišimo geba yra 1,29 proc. didesnė etanoliniuose ekstraktuose pagamintuose iš susmulkintų lapų, negu iš nesmulkintų.

Eksperimentinio tyrimo metu, buvo nustatyta AA priklausomybė nuo BFJK etanoliniuose melisos lapų ekstraktuose iš smulkintų lapų ir atliktas statistinis įvertinimas. Rezultatai pateikti 7-oje lentelėje. * * * 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 100.00 5 10 15 30 DP P JH rad ik al ų su riš im o geb a, % Laikas, min 1:10 1:20 1:30

Lentelė 7. Spirmeno ranginės koreliacijos koeficientų matrica Bendras fenolinių junginių kiekis mg/ml Antioksidacinis aktyvumas proc. Bendras fenolinių junginių kiekis mg/ml Koreliacijos koeficientas 1,000 -0,043 Sig. (p-reikšmė) - 0,727* n 72 72 Antioksidacinis aktyvumas proc. Koreliacijos koeficientas -0,043 1,000 Sig. (p-reikšmė) 0,727* - n 72 72

* Koreliacija yra statistiškai priklausoma (p<0,01).

Atlikus koreliacijos statistinį įvertinimą nustatyta, kad tarp bendro fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo nėra priklausomybės r=-0,043, ir nėra statistiškai reikšmingo skirtumo p=0,727.

Lyginant didžiausią antiradikalinį aktyvumą tarp ekstraktų pagamintų iš nesmulkintų melisos lapų, antiradikalinis aktyvumas etanoliniame ekstrakte buvo 5,34 proc. didesnis, negu vandeniniame, o lyginant laisvųjų radikalų didžiausią surišimo gebą tarp ekstraktų pagamintų iš smulkintų melisos lapų, surišimo geba etanoliniame ekstrakte buvo 5,05 proc. didesnė, negu vandeniniame.

Išanalizavus gautus rezultatus matome, kad visi ekstraktai, pagaminti iš vaistinės melisos lapų, nepriklausomai nuo pagaminimo būdo, pasižymi aukšta laisvųjų radikalų surišimo geba. Marja P. Kahkonen ir kt. (1999) teigė, kad antioksidantų veikla nebūtinai turi būti siejama su dideliu kiekiu fenolinių junginių, turi būti vertinamas pačių ekstraktų antioksidacinis aktyvumas [69]. Galima pritaikyti ir šiam darbui, nes būtent aukščiausias antiradikalinis aktyvumas buvo nustatytas ekstraktuose pagamintuose santykiu 1:30, kur fenolinių junginių kiekis buvo mažiausias. Shahidi ir kt. (1992), jau tada teigė, kad antioksidacinis aktyvumas priklauso ne tik nuo bendro fenolinių junginių kiekio, bet ir nuo konkrečių junginių charakteristikos [70].