3 Materiali e Metodi

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3 Materiali e Metodi

3.1 Ceppi batterici

DH5α:

supE44, ∆(lacZYA-argFV168), deoR, endA1, gyrA96 hsdR17(rk-mk+), recA1, relA. È il ceppo di E. coli utilizzato per amplificare i vettori plasmidici, è difettivo per la restrizione e codifica i geni recA1 e relA1 per migliorare la stabilità dei plasmidi ricombinanti. Contiene, inoltre, il marcatore φ80lacZ∆M15 che permette la α-complementazione del gene della β-galattosidasi e la selezione dei ricombinanti in un test bianco-blu.

BL21: B F-, dcm, ompT, hsdS(rB-, mB-), gal λ(DE3) [pLysS, CamR]. Ceppo di

E. coli difettivo per le proteasi Lon e OmpT, utilizzato per l’espressione delle

proteine di fusione.

3.2 Vettori

pcDNA3: è un vettore di espressione per cellule eucariotiche in cui è presente il promotore del citomegalovirus (CMV), l'origine di replicazione di SV40, il gene per la resistenza all’ampicillina per la selezione in batteri, il segnale di poliadenilazione di BGH (Bovine Growth Hormone) per la corretta terminazione all’estremità 3’ dell’mRNA della proteina inserita nel vettore; il gene per la resistenza alla neomicina per selezione in cellule eucariotiche; il sito multiplo di clonaggio (MCS) e a monte di quest’ultimo e le sequenze dei promotori per RNA polimerasi SP6 e T7 (Figura 13).

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pGEX6p: vettore di espressione batterico usato per l'espressione della proteina

desiderata in fusione con la glutathione-S-trasferasi (GST) di Schistosoma japonicum. Inoltre tra GST e la proteina d’interesse è presente un sito di taglio specifico per la proteasi trombina che può essere sfruttato per recuperare separatamente le due parti della proteina di fusione. Il plasmide contiene l’origine di replicazione pBR22, il gene per la resistenza all'ampicillina, e l’MCS in cui poter inserire la sequenza di interesse (Figura 14).

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pRSET B:

vettore di espressione batterico derivato dalla famiglia pUC. Consente l'inserzione di sequenze a valle e in frame con un tratto di 6 istidine che funge da tag (6X His Tag). Contiene il gene per la resistenza all'ampicillina, origine di replicazione procariotica, promotore T7 e l’MCS (Figura 15).

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3.3 Clonaggio

Al fine di produrre una proteina ricombinante facilmente purificabile, la proteina di nostro interesse è stata clonata nei vettori pGEX-6-p e pRSET B. La sequenza codificante la proteina di interesse (VEGF165) era disponibile in laboratorio nel

vettore di espressione eucariotico pcDNA3 pertanto tramite il software SNAPGENE è stato progettato il clonaggio scegliendo per ogni vettore gli opportuni enzimi di restrizione in modo tale da tagliare e inserire la sequenza in

frame con il tag.

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28 3.3.1 Clonaggio in pGEX-6-p

Per il clonaggio in pGEX-6-p sono stati scelti gli enzimi di restrizione EcoRI e XhoI che tagliano rispettivamente 5’ 3’ la sequenza di interesse contenuta in pcDNA3 generando estremità “appiccicose” adatte all’inserimento in frame nel nuovo vettore.

Il vettore plasmidico pcDNA3 contenente la nostra sequenza è dunque digerito con EcoRI e XhoI in modo da tagliare l’inserto e renderlo disponibile per il clonaggio in frame con la GST nel nuovo vettore pGEX-6-p anch'esso tagliato nel sito multiplo di clonaggio con gli stessi enzimi di restrizione.

Tabella 5: Reazione di digestione enzimatica pcDNA3-VEGF165

(1,5µg/µl) componente quantità DNA 10 µg 6,6 µl EcoRI 10U 3 µl XhoI 10U 3 µl Buffer tango 2X 12 µl H2O 35,4 µl 60 µl

Tabella 6: Reazione di digestione enzimatica pGEX-6-P( 5 µg/µl)

componente quantità DNA 10 µg 2 µl EcoRI 10U 3 µl XhoI 10U 3 µl Buffer tango 2X 12 µl H2O 40 µl 60 µl

La reazione di digestione enzimatica così allestita è incubata per 2h a 37°C. Per verificare l’avvenuta digestione effettuiamo una corsa elettroforetica su gel d’agarosio in cui dovremmo osservare la presenza di due bande con peso

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molecolare corrispondente all’inserto e al vettore linearizzato.

3.3.2 Clonaggio in pRSET B

Scegliamo di utilizzare per il clonaggio gli enzimi di restrizione BamHI e XhoI che tagliano all’esterno della sequenza di interesse contenuta in pcDNA3 generando estremità “appiccicose” adatte all’inserimento in frame nel nuovo vettore pRSET B. Il vettore plasmidico pcDNA3 contenente la nostra sequenza è dunque digerito con gli enzimi scelti in modo da tagliare l’inserto e renderlo disponibile per il clonaggio in frame con le istidine nel nuovo vettore pRSET B anch’esso tagliato nel sito multiplo di clonaggio con gli stessi enzimi di restrizione.

Tabella 7: Reazione di digestione enzimatica pcDNA3-VEGF165

(4µg/µl) componente quantità DNA 10 µg 2,5 µl BamHI 10U 0.5 µl XhoI 10U 0.5 µl Buffer tango 2X 4 µl H2O 12,5 µl 20 µl

Tabella 8: Reazione di digestione enzimatica pRSET B(0.8 µg/µl)

componente quantità DNA 10 µg 12,5 µl BamHI 10U 1 µl XhoI 10U 1 µl Buffer tango 2X 4 µl H2O 1,5 µl 20 µl

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La reazione di digestione enzimatica così allestita è incubata per 2h a 37°C. In particolare il vettore pRSET B è digerito con i due enzimi di restrizione separatamente, nella reazione è posto dapprima l'enzima XhoI e lasciato agire per due ore e poi aggiunto il secondo enzima BamHI anche esso incubato per due ore a 37°C. Per verificare l’avvenuta digestione effettuiamo una corsa elettroforetica su gel d'agarosio in cui dovremmo osservare la presenza di due bande corrispondenti all’inserto e al vettore linearizzato.

3.3.3 Corsa elettroforetica su gel d'agarosio

Le dimensioni dei frammenti sono state stimate in presenza di marcatori con lunghezza in paia di basi (bp) e peso molecolare noto (DNA Ladder 1Kb Plus - Invitrogen).

Tabella 9: Composizione Gel d'agarosio 1% (50 mL)

componente quantità

Agarosio 0.5 g

Bromuro d'etidio 2,5 µl

TBE 1X 50 mL

3.3.4 Eluizione del DNA dal gel d’agarosio

I frammenti di DNA corrispondenti all’inserto e al vettore vengono eluiti dal gel seguendo il protocollo del kit di eluizione NucleoSpin (Macherey Nagel). Tagliamo il gel in corrispondenza delle bande del DNA di interesse e poniamo i pezzetti, di cui valuteremo il peso, in due eppendorf. Per ogni 100mg di gel d’agarosio aggiungiamo 200 µl di binding buffer NT1. Incubiamo per 5-10 min a 50°C in modo che il gel si sciolga completamente. La soluzione viene così caricata in apposite colonnine e centrifugata per 30 secondi a 11000 xg. Eliminiamo il sopranatante e laviamo la membrana a cui si è legato il DNA con 700 µl di buffer NT3 per eliminare eventuali impurità. Centrifughiamo nuovamente per 30 secondi ad 11000 xg. Eliminiamo il sopranatante e ripetiamo

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la centrifuga per 1 min per eliminare il buffer completamente. A questo punto eluiamo il nostro DNA in 15 µl di H2O. Incubiamo per 1 min a RT e

centrifughiamo per recuperare l’eluato per 1 minuto a 11000 xg.

Possiamo quantificare il DNA eluito tramite corsa elettroforetica su gel d’agarosio in modo tale da preparare la successiva reazione di ligation.

3.3.5 Reazione di ligazione

Il frammento di DNA corrispondente all’inserto è unito al DNA del vettore vuoto in un rapporto 3:1. La quantificazione su gel del DNA eluito ci permette di calcolare i ng di inserto da usare per la reazione di ligasi secondo la seguente formula:

𝑛𝑔 𝑣𝑒𝑡𝑡𝑜𝑟𝑒 ∗ 𝐾𝑏 𝑖𝑛𝑠𝑒𝑟𝑡𝑜 𝐾𝑏 𝑣𝑒𝑡𝑡𝑜𝑟𝑒 ∗ 3

Usiamo per la reazione di ligation l'enzima T4 DNA ligasi (Fermentas) che catalizza la formazione di legami fosfodiesterici inserendo l’inserto nel vettore. Incubiamo la reazione overnight (ON) a 16°C.

Tabella 10: Reazione di ligation Pgex-6-p - VEGF

componente quantità DNA inserto 1,8 µl DNA vettore 100ng 5 µl Ligasi T4 1 µl Buffer di reazione 2 µl H2O a volume

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Tabella 11: Reazione di ligation pRSET B - VEGF

componente quantità DNA inserto 2,5 µl DNA vettore 50ng 0,5 µl Ligasi T4 1 µl Buffer di reazione 1 µl H2O a volume 3.3.6 Trasformazione batterica

La trasformazione è il processo con cui induciamo l’ingresso di DNA plasmidico in cellule batteriche competenti (DH5 o BL21). Ad un’aliquota di 100 μl di cellule competenti si aggiungono 5-10 ng di DNA plasmidico e si lascia in ghiaccio per 30 min affinchè avvenga la trasformazione. Successivamente si sottopone a shock termico a 42°C per 45 secondi e poi ancora qualche secondo in ghiaccio. Si aggiungono 800 μl di brodo di crescita (LB) e si incuba a 37°C per 40 min per riattivare il metabolismo. Si centrifuga a 12000 xg per 1 minuto, si elimina quasi completamente il sopranatante e si risospende il pellet. Si piastrano le cellule su terreno solido selettivo e si lasciano crescere a 37°C ON. Il giorno seguente sulla piastra Petri saranno cresciute le colonie: l’antibiotico (ampicillina) fa sì che crescano solo le cellule che hanno assunto il plasmide poiché esso contiene il gene che conferisce la resistenza.

Ogni volta che si effettua una trasformazione, bisogna aver cura di controllare l’efficacia dell’antibiotico piastrando, in parallelo, 100 μl di cellule batteriche in assenza di DNA plasmidico.

3.3.7 Estrazione di DNA plasmidico su piccola scala mediante lisi alcalina – “MINIPREP”

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maniera sterile un inoculo di un clone che viene posto in un tubo batteriologico contenente 4 ml di brodo di coltura LB con ampicillina (100 μg/ml).

Il tubo è incubato ON a 37°C in agitazione, affinché la coltura batterica raggiunga la fase di crescita stazionaria. La coltura viene quindi centrifugata a 10000 xg per 1 min allo scopo di ottenere un pellet di cellule batteriche.

Il pellet viene risospeso in 400 μl di “soluzione 1”. Alla suddetta sospensione si aggiungono 400 μl di “soluzione 2” e la miscela viene mescolata delicatamente invertendo il tubo. In questo passaggio si ha la lisi della cellula batterica a carico del NaOH e del Sodio dodecil solfato (SDS). La reazione di lisi alcalina non deve procedere per una durata superiore a 5 min, trascorsi i quali si aggiungono 400μl di “soluzione 3”, necessaria a far precipitare le membrane e le pareti delle cellule lisate, insieme al DNA cromosomico, che ad esse è associato.

Dopo una centrifugazione di 25 min a 14000 xg viene recuperato il sopranatante, contenente il DNA plasmidico e l’RNA a basso peso molecolare.

Si aggiungono 0.6 volumi di isopropanolo alla fase acquosa contenente il DNA plasmidico e si lascia 10 min a temperatura ambiente.

In questo modo il DNA plasmidico e l’RNA a basso peso molecolare precipitano e vengono recuperati mediante centrifugazione (30 min a 14000 xg). Il pellet ora si presenta piccolo e traslucido, questo viene lavato con etanolo (EtOH) al 70% e poi risospeso in 10 μl di H2O bidistillata o milli-Q contenente RNAsi A ad una

concentrazione di 100 μg/ml, allo scopo di eliminare l’RNA a basso peso molecolare.

La concentrazione di DNA estratto e purificato e l’avvenuto clonaggio viene stimato sottoponendo un’aliquota, digerita con gli opportuni enzimi di restrizione, ad elettroforesi su gel di agarosio e quantificato con la lettura allo spettrofotometro a 280 nm.

Tabella 12: Composizione soluzione S1

Componente

Glucosio 50 mM

Tris-HCl pH 8 25 mM

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Componente

NaOH 0.2 M

SDS 1,00%

Componente

Potassio acetato pH 5,3 3 M

3.3.8 Estrazione di DNA plasmidico su media scala - “MIDI-PREP”

Il kit prevede l’utilizzo di colonnine cromatografiche QIAGEN a scambio ionico commercialmente disponibili insieme alle soluzioni necessarie per il loro impiego. Con questa tecnica è possibile estrarre da 80 a 140 μg di DNA altamente purificato.

Partendo da una coltura batterica di 100 ml, ottenuta dopo incubazione a 37°C in agitazione ON del clone scelto contenente il plasmide di interesse, si procede alla centrifugazione della stessa a 2000 xg per 30 min.

Il pellet così ottenuto viene risospeso in 4 ml di soluzione P1; quindi si aggiungono 4 ml del buffer di lisi P2, si capovolge delicatamente e si lascia a temperatura ambiente (RT), per 5 min. Dopo aver aggiunto 4 ml di soluzione neutralizzante P3 a 4°C ed aver capovolto delicatamente, si incuba in ghiaccio per 15 minuti. Segue una centrifugazione a 4°C per 30 min a 15000 xg. Il sovranatante è rimosso velocemente e centrifugato alle stesse precedenti condizioni, al fine di ottenere un lisato meno torbido possibile. Si equilibra una colonnina cromatografica AX-100, caricandola con 3 ml di soluzione N2 permettendone lo svuotamento per gravità. Si carica quindi la colonnina equilibrata con il lisato, ciò risulta nell’immobilizzazione del DNA da parte della resina. Si libera il DNA dai sali e dall’RNA residuo mediante due lavaggi di 4 ml ciascuno con la soluzione N3. Si procede infine con l’eluizione del DNA dalla colonnina, con 5 ml di soluzione N5. L’eluato viene precipitato, dopo aggiunta di 0,7 V di isopropanolo, mediante centrifugazione a 4°C per 30 min a 15000 xg. Il

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pellet viene lavato con EtOH al 70% e risospeso in TE pH 8.0 (o in H2O milli-Q).

Per stimare la quantità del DNA estratto, è possibile sottoporre un’aliquota ad elettroforesi su gel di agarosio e lettura allo spettrofotometro (280 nm).

Tabella 15: Composizione soluzione P1

Componente

RNasi A 100 μg/ml

Tris-HCl pH 8 50 mM

EDTA pH 8 10 mM

Componente

NaOH 0.2 M

SDS 1,00%

Componente

Potassio acetato pH 5,5 3 M

Tabella 18: Composizione soluzione N2

Componente

Tris-HCl 100 mM

EtOH 15,00%

KCl+H3PO4 pH 6.3 900 mM

Componente

Tris-HCl 100 mM

EtOH 15,00%

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Componente

Tris-HCl 100 mM

EtOH 15,00%

KCl+H3PO4 pH 8.5 1000 mM

3.4 Produzione proteina ricombinante

3.4.1 Induzione dell’espressione della proteina

Una singola colonia di BL21 trasformata con il vettore pGEX-VEGF o con il vettore pRSET B è incubata in 10 ml di LB-Amp (100μg/ml) ON a 37°C in agitazione (precrescita).

I 10 ml della precrescita sono incubati in un volume finale di 100ml di LB-Amp (100μg/ml) e posti in agitazione fino al raggiungimento di una OD= 0,6-0,7 corrispondente alla fase esponenziale di crescita. L’IPTG è aggiunto alla concentrazione finale di 1mM e il tutto incubato 3-4 ore a 37°C in agitazione. Il preparato è centrifugato 20 min a 2000 xg a RT e il precipitato è suddiviso in 2 tubi da 50 ml. Il pellet così ottenuto può essere conservato a -20°C. A questo punto si procede all’estrazione proteica dai pellet per ottenere una buona quantità di proteina.

3.4.2 Estrazione proteica mediante lisi chimica Il pellet è risospeso in 1 ml di PBS freddo contenente:

Tabella 21: Composizione buffer di lisi

componente

Lisozima (50 μg/ml) 4 μl

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Tabella 21: Composizione buffer di lisi Inibitori di proteasi mix 200X

(P8340-Sigma)

10 μl

Dopo incubazione in ghiaccio per 30 min, si aggiunge: Tabella 22: Composizione buffer di lisi

componente

Triton 10% 100 μl

MgCl2 1M 10 μl

DNAsi (10mg/ml) 11 μl

e nuovamente in ghiaccio per 30 min.

Il preparato è centrifugato per 20 min a 4°C a 20000 xg; il sovranatante contenente l’estratto proteico totale citosolico è recuperato in tubi da 2ml. Per recuperare la proteina di interesse da eventuali corpi inclusi, il pellet è risospeso in urea 4M e lasciato in agitazione a 4°C ON. Successivamente il tubo è centrifugato a 20000 xg a 4°C per 15 minuti e il sovranatante contenente l’estratto proteico derivato dai corpi inclusi è recuperato.

3.4.3 Purificazione proteica

Per ogni 100 ml di crescita batterica trasformata con il vettore pGEX-6-P-VEGF sono stati usati 75 μl di resina Glutatione-Sefarosio 4B (GE healtcare) (20% EtOH); per il vettore pRSET B sono stati usati 75μl di resina HisPur™ Ni-NTA (Thermo-Scientific). Per la resina Glutatione-Sefarosio si effettuano dei lavaggi con PBS freddo e poi si aggiunge ad essa l’estratto proteico totale e si incuba per 1 h a 4°C su bascula. Si centrifuga a 600 xg per eliminare il sopranatante.

Dopo avere effettuato 3 lavaggi con 1 ml di PBS freddo, si centrifuga a 600 xg per 1 min, si recupera il flow-through ed si effettuano due lavaggi della resina con 250 μl di PBS 1X freddo, centrifugando a 600 xg per 1 min. La proteina di fusione, così purificata e attaccata alla resina, può essere eluita.

Per la resina HisPur™ Ni-NTA si effettua un lavaggio con 150 μl di equilibration

buffer (PBS + imidazolo 10mM, pH 7.4) e si centrifuga a 700xg per 2 min. Si

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un volume uguale di equilibration buffer. Dopo 30 min di incubazione su bascula a 4°C, si centrifuga per 2 min a 700 xg per recuperare il flow-through. Si effettuano due lavaggi della resina con 150 μl di buffer (PBS + imidazolo 25mM, pH 7.4). Dopo centrifuga per 2 min a 700 xg, la proteina può essere eluita.

Alla resina Glutatione-Sefarosio 4B si aggiungono 75 μl di buffer di eluizione. Dopo incubazione su bascula a RT per 10 min e a 4°C per 5 min, si centrifuga a 600 xg per 1 min e si recupera delicatamente il sopranatante contenente la proteina di interesse.

Tabella 23: Composizione buffer di eluizione (GST-VEGF)

componente

Tris-HCl pH 8 50 mM

GSH 10 mM

Alla resina HisPur™ Ni-NTA si aggiungono 75 μl di eluition buffer (PBS + Imidazolo 250mM), si centrifuga per 2 min a 700xg e si recupera delicatamente il sopranatante.

In entrambi i casi i passaggi di eluizione sono ripetuti per 3 volte in modo da ottenere 3 frazioni eluite.

3.4.4 Dialisi

Allo scopo di rimuovere dall’estratto proteico l’urea e dalle frazioni eluite il GSH, utilizziamo membrane da dialisi con un cut-off di 12000-14000 Da che permettano la diffusione dell’urea (60 Da) e del GSH (330 Da), rispettivamente, impedendo quella della proteina di fusione (49 kDa). La dialisi è effettuata utilizzando come dializzato PBS 1X in rapporto 100:1 col campione.

Prima di caricare il campione, si equilibra la membrana per circa 1h in H2O e

successivamente si taglia la lunghezza desiderata. Un’estremità è chiusa con apposite pinzette allo scopo di caricare il campione, dopodiché si sigilla anche l’altra estremità con una pinzetta. La membrana caricata col campione è posta nel

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recipiente contenente il dializzato e si pone in agitazione tramite un’ancoretta magnetica a 4°C per 4h. Il dializzato è sostituito circa ogni ora in modo tale da garantire un continuo passaggio per osmosi delle sostanze da eliminare. Al termine della dialisi si recupera il campione che viene conservato in aliquote a – 80°C.

3.4.5 Determinazione concentrazione proteica

Abbiamo effettuato una quantificazione diretta della proteina ottenuta tramite lettura allo spettrofotometro con lunghezza d'onda a 280 nm. Per ogni lettura lo strumento è stato precedentemente tarato tramite misure di campioni di BSA a concentrazioni nota, in tal modo costruiamo opportune rette di taratura da cui grazie alle legge di Lamber-Beer, calcoliamo con precisione la concentrazione del nostro campione.

3.4.6 Elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE)

L’elettroforesi viene condotta in condizioni denaturanti in presenza di SDS (SDS-PAGE) che consente la separazione delle proteine in base al loro peso molecolare e non alla loro carica. Ogni campione proteico caricato è diluito in una soluzione di Dye che contiene SDS e β-mercaptoetanolo. L’SDS è un detergente anionico che si lega alla molecola proteica in un rapporto costante di 1,4 g di SDS ogni grammo di proteina conferendo una carica netta negativa. In questo modo tutte le proteina hanno lo stesso rapporto carica/massa e dunque si muoveranno verso il catodo soltanto in base al loro peso molecolare. Il β-mercaptoetanolo è un agente riducente che contribuisce alla denaturazione delle proteine riducendo i ponti di solfuro. In aggiunta gli estratti proteici trattati con il Dye vengono fatti bollire a 100°C per 5 min in modo tale da garantire la totale denaturazione.

La corsa elettroforetica avviene su un gel di poliacrilammide costituito da una parte superiore detta Stacking Gel e una parte inferiore detta Resolving Gel. Lo

stacking gel contiene una bassa percentuale di acrilammide (5%) ed ha un pH 6,8.

Il resolving gel presenta un pH 8,8 ed una concentrazione maggiore di acrilammide (10%) pertanto le maglie sono più strette e le proteine qui si separano

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40 in base al loro peso molecolare.

Il gel, colato in due vetrini con uno spessore di 1,5mm, dopo essersi polimerizzato è immerso in un tampone di corsa (Tris-Glicina) che permette il passaggio della corrente. Negli appositi pozzetti sono caricati i campioni e il marker di peso molecolare (PageRuler Plus Prestained Protein Ladder- Thermoscientific). La corsa è effettuata per 1 h con un voltaggio costante di 150 mV e l’amperaggio viene impostato a 300 mA in modo che sia libero di oscillare.

3.4.7 Western Blot

Al termine della corsa elettroforetica, trasferiamo le proteine separate con la SDS-PAGE dal gel di poliacrilammide ad una membrana di polivinildifluoruro (Immobilon-P PVDF membrane - Millipore) in modo tale da poter poi identificare la proteina di interesse tramite anticorpi specifici. Il trasferimento avviene applicando una corrente elettrica in un ambiente a pH basico (comunemente pH 8,5). In tal modo, le proteine migreranno verso l’anodo, in quanto ad un pH basico buona parte delle proteine è carica negativamente. È stato effettuato il trasferimento in wet immergendo in tampone di corsa la membrana e il gel in un supporto così preparato: spugna, foglio di carta 3MM precedentemente equilibrata nel tampone di trasferimento, gel, membrana precedentemente equilibrata in metanolo, foglio di carta 3MM e spugna. Mettiamo dal lato dell’anodo un blocchetto di ghiaccio e impostiamo il trasferimento settando, quindi, per un’ora una corrente costante di 100mV e amperaggio a 300mA. Trascorsa l’ora si smonta l’apparato di trasferimento e si pone la membrana in blocking solution (5%

non-fat milk) ON a 4°C. Successivamente togliamo la blocking e la incubiamo per 1h

in una soluzione contenente l’anticorpo primario anti-VEGF(147) (sc-507 Santa Cruz Biotechnology) prodotto in coniglio. Abbiamo usato una diluizione di 1:200 in blocking solution.

Dopodiché si effettuano 3 lavaggi per 10 min in TBST 0,1 % (TBS1X + Tween 0,1%) per eliminare eventuali interazioni aspecifiche e reincubiamo la membrana per 1 h con l'anticorpo secondario anti-coniglio coniugato con l’enzima perossidasi (1:16000). Si effettuano infine altri 3 lavaggi per 10 min in TBST 0,1%.

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41 Rivelazione per chemioluminescenza

Un substrato dell’enzima perossidasi, coniugato all’anticorpo secondario, è il luminolo la cui catalisi provoca emissione di luce. Quest’ultimo viene fornito grazie all’utilizzo di un kit commerciale chiamato ECL (Pierce). La perossidasi coniugata con l’anticorpo secondario reagisce con l’H2O2 presente in soluzione,

libera O2 provocando la reazione luminosa del luminolo in corrispondenza delle

bande di interesse. Dopo aver lasciato la membrana nella soluzione di ECL per non più di 2 minuti si pone la membrana in una sorta di “libro” usato per esporre una lastra fotografica. Tale lastra sarà posizionata sopra la membrana per un tempo variabile, a seconda dell’intensità del segnale viene poi messa rapidamente in soluzione di sviluppo; appena compaiono le bande la lastra viene messa in acqua e poi spostata in una vaschetta contenente un fissativo. Infine, dopo averle lavate in acqua, vengono poste ad asciugare per la valutazione delle bande corrispondenti alla proteina di interesse.

3.5 Funzionalizzazione di nanoparticelle magnetiche

Abbiamo usato nanoparticelle magnetiche (MNP) commerciali (nanomag® D -spio) con un core di ossido di ferro del diametro di 50 nm, rivestite con un guscio organico che espone gruppi COOH. Tali MNP si presentano già in soluzione ad una concentrazione di 5 mg/ml.

Il processo di funzionalizzazione è stato ottenuto tramite una chimica covalente. Ad una dispersione di nanoparticelle con concentrazione 2 mg/ml è stato aggiunto il catalizzatore 1-Etil-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide idrocloride (EDAC, Sigma) al 15% a pH debolmente acido (6) inducendo l’attivazione dei gruppi carbossilici che sporgono dalla superficie delle MNP. Dopo 10 minuti, si aggiunge la proteina ricombinante (rapporto MNP:proteina 3,5:1 w/w) o la poli-L-lisina (PLL) (rapporto MNP:polipeptide 3,5:1 w/w), e si lascia ad incubare per 1h in agitazione in un becker con ghiaccio in modo tale da far avvenire la formazione di un legame peptidico tra i gruppi carbossilici precedentemente attivati e gruppi amminici della proteina ricombinante. Avvenuta la reazione, si centrifuga il campione a 18000 xg per 40 minuti a 4°C, insieme ad un’aliquota di MNP non

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42

funzionalizzate che viene utilizzata come campione di controllo. Recuperato il sopranatante da entrambi i campioni, il pellet è risospeso in H2O e centrifugato

nuovamente a 4°C 18000 xg per 40 minuti. Al termine della centrifuga, il sovranatante è nuovamente recuperato e il pellet è risospeso in glicerolo al 20% in acqua. Le nanoparticelle funzionalizzate sono dunque conservate in aliquote a -20°C ed utilizzate entro 2 mesi dalla preparazione. La quantità di proteina ricombinante legata alla superficie delle MNP è calcolata per differenza, misurando l’assorbanza a 280nm dei sopranatanti recuperati derivanti dai lavaggi sopra descritti. La concentrazione è poi calcolata tramite una retta di taratura ottenuta con concentrazioni note di albumina.

3.6 Caratterizzazione di nanoparticelle magnetiche

Le immagini in microscopia elettronica a trasmissione (TEM) sono state eseguite tramite un microscopio FEI Tecnai T20 (operante a una tensione di 200 kV) presso l’INA dell’Università di Saragozza (Prof G. Goya). Il potenziale Zeta e la dimensione delle nanoparticelle sono state valutate tramite (Zetasizer -Malvern Instrument) disponibile presso il Dipartimento di Chimica e Chimica Industriale dell’Università di Pisa (Prof F. Chiellini). In particolare, la DLS (dynamic light

scattering) è una tecnica che consente di misurare il diametro idrodinamico di

proteine o biomolecole in generale, polimeri, emulsioni, microemulsioni, micelle, liposomi, o colloidi in generale, nanoparticelle, dendrimeri, ecc. dispersi o solubilizzati in un liquido. La DLS è la tecnica d’elezione per rivelare la presenza di aggregati, anche in proporzioni infinitesimali, e quindi la bontà di una nano formulazione.

Il potenziale Z è invece la tecnica di elezione per determinare la stabilità di una nano formulazione così come la buona riuscita di una funzionalizzazione di superficie. La maggior parte delle nanoparticelle disperse in acqua presenta una carica superficiale, causata da fenomeni di ionizzazione o assorbimento di specie cariche. Le particelle caricate sono circondate in soluzione da diversi strati ionici, la cui composizione risulta diversa da quella del bulk. Quando si muovono in soluzione (movimento Browniano ad esempio) le particelle si spostano insieme ad un doppio strato ionico. Il potenziale Zeta è il potenziale al livello di questo

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doppio strato. La funzionalizzazione di una nanoparticella ovviamente cambierà la sua carica superficiale e questo si rifletterà in un cambiamento nel suo potenziale Z. Inoltre il potenziale zeta risulta essere una misura della forza principale delle interazioni tra le particelle e consente di predire la loro stabilità. In effetti, un valore di potenziale zeta elevato (cioè <-30mV e >+30mV) fa si che le nanoparticelle rimangano lontane l’una dall’altra, respingendosi abbastanza per eliminare la possibilità di agglomerazione, aggregazione e/o flocculazione.

3.7 Embrioni di zebrafish

I pesci zebrafish vengono allevati in vaschette all’interno di appositi impianti automatizzati disponibili presso lo stabulario dell’Unità di Biologia dello Sviluppo del Dipartimento di Biologia. Le condizioni in cui vengono mantenuti prevedono 14 h di luce al giorno, in accordo alle linee guide fornite da ZFin (www.zfin.org). La temperatura dell’acqua viene mantenuta a 28°C con un pH pari a 7,5.

La nutrizione dei pesci avviene tre volte al giorno: 2 volte con Artemia salina, un piccolo crostaceo che acquistato allo stadio di cisti, viene allevato in appositi cilindri (contenenti acqua salata al 25‰) fino all’evento di schiusa; una volta con mangime liofilizzato, di diverso diametro in base alla grandezza degli zebrafish. Per quanto riguarda l’accoppiamento, i pesci vengono introdotti la sera precedente in piccole vasche vasca dotate di appositi fori per la raccolta e l’isolamento delle uova e di un setto per la separazione del maschio e della femmina.

La mattina seguente, all’accensione della luce, il setto viene rimosso e la fecondazione avviene per accoppiamento spontaneo. Le uova fecondate finiscono sul fondo della vasca e possono essere facilmente raccolte (Figura 16).

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Figura 16: Vaschette da riproduzione e recupero delle uova in piastre Petri

Per i nostri esperimenti abbiamo utilizzato una linea di zebrafish transgenica doppio mutante (roy-/-;nacre-/-;Tg(kdrl:egfp)s483_{); per ogni accoppiamento}

otteniamo circa 100-150 embrioni che vengono mantenuti in piastre Petri (10 cm di diametro) nel mezzo E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl, 0,33 mM

MgSO4,0,1% blu di metilene, pH 7,0) alla temperatura di 28°C. Utilizziamo

embrioni a 24 hpf (hour post fertilization) per microiniezioni nello yolk ed embrioni a 48-72 hpf per microiniezioni nell'occhio. In questo periodo non c’è bisogno di fornire cibo in quanto il vitello (yolk) è già di per sé ricco di sostanze nutritizie e tali larve sono classificate come organismi insenzienti.

3.7.1 Microiniezioni

La microiniezione avviene con un microiniettore a olio e gli aghi utilizzati derivano da capillari di vetro del diametro di 1 mm, preparati precedentemente in un puller dove vengono tirati a caldo (i parametri usati sono heat: 550 e pull: 950). Una volta preparata la mix da iniettare, che varia a seconda delle esigenze, si procede a caricare l’ago che montiamo sul micromanipolatore con circa 1μl di soluzione. Impostiamo il volume da microiniettare settando lo strumento a 30 nl per le iniezioni nello yolk e a 4 nl per le iniezioni nell'occhio. Prima di procedere con le iniezioni gli embrioni vengono anestetizzati immergendoli in una soluzione E3 con tricaina 0,16 µg/ml.

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necessario rimuoverlo delicatamente prima di procedere con le iniezioni nello yolk (Figura 17). A questo punto gli embrioni vengono sistemati in una piastrina con una retina sul fondo che permette di orientare gli embrioni con lo yolk verso l'alto. Microiniettiamo circa 30-40 embrioni per ogni gruppo sperimentale: MNP funzionalizzate con il VEGF ricombinante, MNP funzionalizzate con PLL, VEGF commerciale (01-AA010), VEGF ricombinante, MNP non funzionalizzate, PBS 1X

e soluzione derivante dal plasmide vuoto (GST). Dopo le iniezioni gli embrioni vengono mantenuti in acqua zebrafish E3 in incubatore a 28°C fino allo stadio di 72hpf.

Gli embrioni a 48hpf-72hpf da iniettare nell’occhio vengono prima anch’essi anestetizzati con tricaina 0,16 µg/ml e poi sistemati in una piastrina con agar 0,2% in modo da mantenerli fermi. Abbiamo microiniettato nell’occhio un volume fisso di 4 nl in circa 25 embrioni per ogni gruppo: MNP funzionalizzate con VEGF ricombinate, MNP funzionalizzate con PLLe MNP non funzionalizzate.

Dopo tali iniezioni gli embrioni vengono tenuti per altre 24 h in incubatore a 28°C in mezzo E3.

Figura 17: Embrioni di zebrafish 24hpf. (A) embrioni 24 hpf avvolti dal corion. (B) procedura meccanica di decorionizzazione. (C) embrione zebrafish 24 hpf senza corion

.

3.7.2 Visualizzazione in vivo

Gli embrioni vengono osservati in vivo tramite microscopio a fluorescenza Nikon Eclipse 600. Per la visualizzazione in vivo gli embrioni, anestetizzati, vengono

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posti su vetrino con Metilcellulosa al 3% e osservati con un obiettivo 10X. In tal modo tramite la selezione del filtro FITC che eccita la GFP possiamo osservare in fluorescenza eventuali modificazioni del fenotipo vascolare, catturare immagini con una fotocamera digitale collegata al microscopio ed elaborarle tramite il software NISelements.

3.7.3 Colorazione dei vasi sanguigni

Gli embrioni iniettati nello yolk, dopo la visualizzazione in vivo, allo stadio di 72 hpf vengono fissati in paraformaldeide al 4% e tenuti per 2 h o ON a 4°C. Gli embrioni così fissati vengono lavati con PBS e poi deidratati con concentrazioni crescenti di etanolo (25-50-75-100%); poi trattati con etanolo 100% per 2h a 4°C. Gli embrioni sono reidratati gradualmente con PBT (PBS 1X + Tween 0,1%). Per procedere con la colorazione per la fosfatasi alcalina endogena, i campioni sono equilibrati nel buffer NTMT per 30 minuti a RT e i substrati della fosfatasi sono aggiunti: NBT/BCIP (Nitro-Blue Tetrazolium / 5-bromo, 4-chloro, 3-indolylphosphate). In 500 μl di buffer NTMT si aggiungono 10μl di NBT/BCIP (stock solution 50X-Roche). La reazione di colorazione procede al buio per 10 minuti ed è bloccata aggiungendo PBT, per poi effettuare un post-fissaggio in PFA al 4% per 2h. Per la visualizzazione si elimina la PFA e gli embrioni sono conservati in etanolo.

Tabella 24: Composizione buffer NTMT

componente TrisHCl pH 9.5 0.1M MgCl2 50mM NaCl 0.1M Tween 20% 0.1% H2O a volume

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3.8 Istologia

3.8.1 Inclusione degli embrioni in paraffina

Gli embrioni di zebrafish precedentemente iniettati nell’occhio sono stati inclusi in paraffina per ottenere sezioni trasversali tramite tagli al microtomo. In questa procedura i tessuti vengono disidratati e chiarificati in passaggi graduali di etanolo e xilene per eliminare i residui acquosi e permettere la migliore penetrazione della paraffina nei tessuti. In seguito alla disidratazione vengono effettuati passaggi successivi in paraffina liquida (a 65°C) fino a lasciare gli embrioni, correttamente orientati, in blocchi di paraffina pura solidificata. La paraffina commerciale è solida a temperatura ambiente e fonde a temperature intorno ai 65-70 C°.

Dopo aver montato i blocchetti di paraffina con i nostri embrioni su opportuni supporti, li sistemiamo per il taglio al microtomo. Effettuiamo sezioni trasversali con uno spessore di 10-12μm che vengono posizionate su vetrini gelatinati per ricoperti di acqua microscopio e lasciate ad asciugare ON a 42 C°.

3.8.2 Colorazione per le nanoparticelle

Gli embrioni così sezionati, possono essere utilizzati per effettuare delle colorazioni istologiche. La procedura prevede passaggi successivi e graduali in xilene, xilene/etanolo, etanolo e etanolo/acqua per eliminare la paraffina e re-idratare gli embrioni. Prima di procedere alla colorazione delle MNP effettuiamo il bleaching delle sezioni dell’occhio, coprendo con 1ml di soluzione ogni vetrino su cui puntiamo una lampada accesa per circa 25 minuti, allo scopo di eliminare il pigmento naturale. A questo punto procediamo con la colorazione per il ferro per la visualizzazione delle nanoparticelle (Prussian blue staining, Sigma). Utilizziamo un kit in cui una soluzione di HCl deve essere mescolata in un rapporto 1:1 con una soluzione di ferro cianuro di potassio. La soluzione preparata al momento viene posta su ogni vetrino e lasciata agire per 10 minuti. Terminati i 10 min di reazione i vetrini sono lavati in acqua e si procede alla marcatura cellulare (nuclei e citoplasmi) immergendo i vetrini in una soluzione di

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Pararosanilina allo 0,02%. Lasciamo i vetrini nella soluzione per 5 minuti e poi laviamo in H2O. Montiamo i vetrini coprendo con un coprioggetto usando aqua

poly/mount. Dopo essersi asciugati i vetrini sono pronti per essere visualizzati al microscopio.

Tabella 25: Composizione soluzione per il bleaching

Componente

H2O2 1%

Formammide 5%

SSC 0,5%