4. Conclusioni.
Nel presente lavoro mi sono dedicato alla caratterizzazione delle differenze, a livello molecolare, tra ERK1 ed ERK2 in particolare allo studio del dominio N-terminale delle due proteine e della regione 3’UTR nei rispettivi trascritti. Il risultato di questa indagine mostra che le porzioni di proteina e di mRNA di ERK1 ed ERK2 conferiscono alle proprietà dinamiche e funzionali . Mi sono avvalso dell’utilizzo di tecniche di imaging in vivo per lo studio dei processi che stanno alla base del meccanismo di traffico nucleo-plasmatico di ERK1 e 2 , utilizzando proteine di fusione con GFP.
Ho messo in evidenza una sostanziale differenza tra ERK 1 e 2, nella capacità di attraversare la membrana nucleare, che è determinata da un breve dominio presente all’N-terminale di ERK 1.
Dal momento che il nucleo è il sito nel quale si osserva l’inattivazione del segnale originato a livello della membrana cellulare, la velocità di permeazione attraverso la membrana nucleare è un parametro critico nel determinare l’efficienza del “signaling” al nucleo.
Nel presente lavoro ho fornito evidenze biochimiche, funzionali del fatto che ERK 1 e 2 presentano differenti capacità di mobilità, inoltre ho ipotizzato che l’ N-terminale di ERK 1 ( assente in ERK2 ) è necessario per determinare le differenze
nelle proprietà di permeazione.
Dal momento che, il tasso di mobilità nucleo-plasmatica e la sua possibile modulazione, sono regolatori importanti del segnale al nucleo, si può ipotizzare che la loro regolazione possa rappresentare un probabile target di controllo molecolare o farmacologico del pathway di trasduzione del segnale.
Inoltre, dalla caratterizzazione delle sequenze nella regione 3’ UTR dei trascritti si evidenzi la presenza di elementi consensus implicati nei processi responsabili della stabilizzazione e destabilizzazione dei messaggeri, nonché del fenomeno della poliadenilazione citoplasmatica.
Ho dimostrato che, questi elementi sono presenti nel trascritto di ERK2, ma non in quello di ERK1. Dal risultato dei saggi di RACE-PAT e LM-PAT, si nota che il grado di poliadenilazione del trascritto di ERK2 risulta essere modulato in relazione alla stimolazione extracellulare.
Questa evidenza indica chiaramente che l’mRNA di ERK2 è sottoposto effettivamente al processo di poliadenilazione citoplasmatica.
4.1 Comunicazione bidirezionale tra nucleo e citoplasma
Il nucleo rappresenta la stazione finale dell’azione di ogni “pathway” di segnalazione che controlla l’espressione genica in risposta a cambiamenti dell’ambiente extracellulare.
Il passaggio attraverso la membrana nucleare delle molecole di traduzione del segnale avviene, non soltanto al momento dell’attivazione, ma anche in maniera continua grazie ad un processo di shuttling che consente un flusso stazionario nella comunicazione molecolare tra nucleo e citoplasma (Xu e Massague, 2004), infatti la velocità di shuttling determina la capacità dei target nucleari di percepire l’ambiente extracellulare.
Quando il pathway è attivato, l’accumulo di ERK prosegue a causa di una serie di fattori, tra i quali un incremento della sua affinità per le ancore nucleari (Costa et al., 2006 ; Lenormande et al., 1998 ; Mandl et al., 2005), e cambiamenti nell’equilibrio tra meccanismi di importazione ed esportazione (Adachi et al., 200 ; Kondoh et al., 2005).
La traslocazione è un evento cruciale, nel processo di signaling, nell’espressione genica (mediata da ERK), nella proliferazione, nel differenziamento ed anche nella elongazione del neurite. Tutti questi eventi di fatto richiedono l’ingresso della proteina attivata nel nucleo (Brunet et al., 1999 ; Cowley et al., 1994 ; Kim et al., 2000 ; Robinson et al., 1998.).
L’accesso di ERK al nucleo si attua attraverso un processo di diffusione facilitata nel quale ERK permea i pori nucleari in seguito ad una interazione diretta con domini specifici delle nucleoporine (Matsubayashi et al., 2001 ; Whitehurst et al., 2002 ).
L’efficienza di questo processo è testimoniata dal fatto che ERK 2- GFP trasloca attraverso la membrana nucleare con una cinetica poco più lenta, ma trascurabile della GFP.
4.2 ERK1 e 2 non sono intercambiabili: l’effetto dell’N-terminale sul trafficking.
Per lungo tempo si è ritenuto che ERK1 e 2 fossero isoforme della stessa proteina.
Questa prospettiva originava dal fatto che essi presentassero una estesa omologia e condividessero attivatori a monte e substrati a valle.
Soltanto recentemente è stato chiarito che, mentre ERK2 è la chinasi più attiva, ERK1 contribuisce in maniera molto minore al processo globale di signaling.
In uno dei modelli proposti ERK1 funzionerebbe come agonista parziale di ERK2 rispetto al legame con MEK, attenuando perciò parzialmente la fosforilazione di ERK2 e la sua attivazione a seguito dello stimolo (Vantaggiato et al., 2006).
Questo modello d’altra parte, non permette l’identificazione dei determinanti strutturali delle differenze tra ERK1 e 2 né esclude la possibilità che meccanismi addizionali a valle possano contribuire ulteriormente a questa capacità di signaling differenziale.
Con questo lavoro sostengo di aver identificato sia uno di questi meccanismi, che un possibile determinante strutturale in ERK1 che stabilisce tale differenza.
La maggior parte dei domini funzionali che sono stati mappati sulle chinasi ERK inclusa una sequenza consensus per MEK, il dominio catalitico, due sequenze consensus per le nucleoporine, (Matsubayashi et al., 2001 ; Whitehurst et al., 2002) sono presenti sia su ERK1 che su ERK2 . Ciononostante, le differenze di sequenza più evidenti sono localizzate all’N-terminale di ERK1 dove una sequenza di circa 18 residui non era stata precedentemente associata con una specifica funzione (Ebel et al., 2001).
Ho ipotizzato che questa sequenza sia necessaria e sufficiente per determinare le differenze nel tasso di shuttling tra ERK1 e 2.
Per questo ERK1 agirebbe come una sorta di dominate negativo competitore di ERK2 per la sua azione nucleare (Vantaggiato et al., 2006), dal momento che compete con l’attivatore ma è meno efficiente sui target nucleari.
Una interpretazione funzionale ulteriore del ruolo dell’N-terminale di ERK1 è che questo determini una segregazione dell’azione catalitica su substrati citoplasmatici, dal momento che le evidenze disponibili indicano un effetto esclusivamente sul trafficking nucleare.
Probabilmente questo è il motivo per il quale esistono due forme di ERK: ERK1 controllerebbe soltanto target citoplasmatici mentre solo ERK2 avrebbe la capacità di interagire sia con substrati citoplasmatici che con target nucleari , infatti si può immaginare un contesto nel quale il targeting del pathway Ras-ERK è regolato dalla concentrazione relativa di ERK1 e 2
La possibilità che esista una eventuale regolazione durante lo sviluppo o attività dipendente delle relative concentrazioni, è un argomento sul quale stiamo ancora lavorando.
Una indicazione importante circa l’importanza dell’ N-terminale nella regolazione dell’interazione con altre proteine deriva dalla struttura cristallina di ERK2
È stato infatti dimostrato che le porzioni N e C terminali sono localizzate sulla superficie della molecola e che mutazioni del dominio chinasico hanno effetto sul legame di MEK.
4.3 Conseguenze funzionali sulla velocità di trafficking
Dal momento che l’attivatore di ERK , MEK, è localizzato principalmente nel citoplasma (Adachi et al., 2000) il mantenimento di un livello funzionale di ERK attivato nel nucleo, dipende sostanzialmente dall’ingresso di ERK attivato.
Si suppone che la diversa efficacia di ERK1 e 2 potrebbe dipendere almeno i parte da alcune differenze nel loro trafficking nucleare.
Infatti le misure delle costanti di tempo di scambio nucleo citoplasmatico hanno mostrato che ERK1 attraversa la membrana nucleare più lentamente di ERK2.
Altri lavori svolti nello stesso laboratorio mostrano che le diverse velocità di trafficking portano ad una più protratta permanenza di ERK1 nel nucleo rispetto a ERK2 come esemplificato dalla lenta perdita di accumulo nucleare in seguito al blocco di MEK 1
Infatti il modello suggerisce che le diverse cinetiche mostrate in questo esperimento da ERK1 e 2 possono essere spiegati dalle differenze nello shuttling nucleo-citoplasmico.
Indicazioni cinetiche mostrano un più esteso tempo di permanenza di ERK1 nel nucleo, dove l’inattivazione domina sull’attivazione. Quindi si può considerare ERK1 come un dominante negativo rimanendo più a lungo nel nucleo causando una estesa defosforilazione rispetto a ERK2.
4.4. Regolazione della trascrizione di ERK2.
La sede finale della regolazione della traduzione di una proteina è il compartimento citoplasmatico, dove la cellula può attuare diversi programmi di induzione o inibizione della traduzione del RNA messaggero. Uno di questi sistemi di regolazione del trascritto è l’allungamento citoplasmatico della coda di adenosine al 3’. Dalla caratterizzazione delle due sequenze nucleotidiche della regione 3’ UTR di ERK1 ed ERK2 è emersa una sostanziale differenza nella presenza di motivi atti a consentire e regolare la poliadenilazione citoplasmatica.
Il trascritto di ERK2 presenta, nella regione sopra citata, due elementi regolatori : il primo è costituito dai sequenze CPE e PAE posti ad una distanza ottimale (otto nucleotidi) l’uno dall’altro ed entrambi a monte dalla catena di adenosine ; il secondo costituito da due motivo TTTTTAT consecutivi, anch’esso posto ad una corretta distanza ed a monte dalla coda di adenosine ( Fox et al.,1989; McGrew et al.,1989; Huarte et al.,1992; reviewed in Richter,1996).
Al contrario il trascritto di ERK1 non presenta ulcun elemento regolatore della poliadenilazione citoplasmatica. Sia il saggio di RACE-PAT che di LM-PAT hanno evidenziato in ERK2 una netta differenza del tasso di poliadenilazione della coda dei trascritti tra cellule poste in condizioni di privazione da nutrienti (100-250 pb) e stimolate con FGF (100-circa 1500 pb).
Dal momento che l’mRNA di ERK2 subisce un drastico aumento dell’estensione della coda al 3’, in seguito ad uno stimolo esterno ( FGF4 ), il trascritto può avere due destini: rimanere nel citoplasma come trascritto dormiente, come osservato nelle spine dendritiche dei neuroni ; oppure può essere indirizzato verso la traduzione. Il mantenimento dei trascritti silenti è un meccanismo presente negli organismi in sviluppo, ed è stato osservato anche nell’adulto nei processi di apprendimento e memoria. Questo processo è stato interpretato come un meccanismo che consente un rapida traduzione di trascritti specifici che non necessita di una trascrizione de novo.
L’evidenza che ERK2 subisce una regolazione di questo tipo può essere interpretata come uno sbilanciamento fra la disponibilità di ERK1 ed ERK2 in favore del secondo. Questo
favorirebbe ERK2, che come descritto precedentemente è un effettore più efficace di ERK1. Si può ipotizzare che questo meccanismo consenta alla cellula di rispondere in modo appropriato a precisi stimoli extracellulari.
5. Discussioni.
Gli esperimenti condotti in laboratorio hanno evidenziato aspetti diversi della regolazione di ERK1 ed ERK2. Mentre il time leaps immaging non mette in evidenza significative differenze nella cinetica di traslocazione in seguito ad una stimolo, gli esperimenti di FRAP, effettuati in condizioni di equilibrio in cellule private di nutrienti e in cellule stimolate, indicano cinetiche di shuttling diverse tra le due proteine. Nel primo tipo di condizione sperimentale ERK2 ha una cinetica di shuttling circa 3,7 volte maggiore di quella di ERK1, mentre nella condizione opposta ERK2 è 3,1 volte più veloce di ERK1. In entrambi i casi ERK2 ha una cinetica maggiore di ERK1 e si riscontra un aumento della velocità di entrambe le proteine quando sono stimolate. Inoltre l’analisi della regione 3’UTR ha evidenziato la presenze di sequenze consensus regolatrici della stabilità, destabilità e di poliadenilazione citoplasmatica in ERK2, ma non ne ha indicato la presenza in ERK1 dove sono presenti solo tre sequenze destabilizzatrici. Da qui, l’ipotesi che ERK 2 sia regolato anche a livello post-trascrizionale . Gli esperimenti di RACE- PAT e di LM-PAT infatti hanno indicato che ERK2, in seguito ad uno stimolo, è regolato a livello post-trascrizionale da un meccanismo di poliadenilazione citoplasmatica.
