1.2 Analisi dell’espressione di Ft312B-WRKY nel clone I-214 e Eridano ... 97

Indice

4. DISCUSSIONE ... 92

1. WRKY ... 96

1.1 Isolamento del trascritto Ft312B-WRKYnel clone I-214... 96

1.2 Analisi dell’espressione di Ft312B-WRKY nel clone I-214 e Eridano ... 97

2. WAK ... 98

2.1 Isolamento del trascritto Ft32C-WAK nel clone I-214 e Eridano ... 98

2.2 Analisi dell’espressione di Ft32C-WAK nel clone I-214 e Eridano ... 99

2.3 Isolamento della sequenza promotrice del gene Ft32C-WAK H nel clone I-214100

4. DISCUSSIONE

Dato l’interesse verso i meccanismi molecolari legati alla risposta e alla tolleranza delle piante nei confronti dello stress da ozono (O

), è stato in passato intrapreso un lavoro di tipo trascrittomico per l’identificazione dei geni modulati in seguito ad un trattamento acuto con questo inquinante ambientale in due cloni di pioppo ibridi, Populus deltoides x maximowiczii (clone Eridano) e Populus x euoramericana (clone I-214), rispettivamente sensibile e tollerante all’O

. Mediante l’utilizzo dell’ibridazione sottrattiva soppressiva (SSH, suppressive subtractive hybridization) è stato possibile ottenere due librerie sottrattive di cDNA costituite dai trascritti dei geni up-regolati nei due cloni di pioppo in seguito all’esposizione acuta all’O

(Rizzo et al., 2007). I trascritti isola ti sono stati identificati grazie alla comparazione in diverse banche dati geniche e suddivisi in categorie funzionali (Tabella 4.1).

La nostra attenzione si è concentrata sulla categoria “trasduzione del segnale”: a questa categoria appartengono geni i cui prodotti sembrano implicati nella trasduzione del segnale a partire dalla sua percezione nei compartimenti extracellulari (Ft32C-WAK) fino alla sua trasmissione nei compartimenti cellulari e all’attivazione della risposta (Ft33B-CaBP, Fs23A-LRP e Ft312B-WRKY).

L’analisi preliminare dell’espressione di questi geni, precedentemente svolta mediante RT- PCR Relaitva sia sul clone Eridano che sul clone I-214, ha evidenziato in particolare l’aumento del trascritto Ft312B-WRKY in entrambi i cloni di pioppo e l’aumento del trascritto Ft32C-WAK solo nel clone di pioppo I-214 (Figura 4.1).

Le WAK (wall-associated kinase) sono una famiglia di recettori caratterizzati da una porzione citoplasmatica con funzione chinasica e un dominio extracellulare di legame alla parete, che appartengono alla famiglia delle proteine RLK (receptor-like kinase) (vedi Introduzione , par. 4). Numerosi dati in letteratura evidenziano la presenza, nelle regioni

promotrici dei geni codificanti per le proteine RLK, di elementi W-box. Le W-box sono

specifiche sequenze di DNA riconosciute e legate dai fattori di trascrizione appartenenti

alla famiglia WRKY (vedi Introduzione , par. 3). Nel suo lavoro Tosti et al. (2006) ha nno

evidenziato che in Arabidopsis thaliana gli elementi W-box sono sovra-rappresentati in

quasi tutte le sequenze promotrici dei geni codificanti per proteine RLK indotte da un

trattamento acuto con l’O

. Inoltre l’interazione RLK/WRKY è stata osservata in

particolari programmi fisiologici delle piante, come quello legato alla risposta di difesa

Tabella 4.1

(Du e Chen, 2000; Rocher et al., 2005). Queste osservazioni unite ai preliminari dati sperimentali sull’ espressione dei trascritti appartenenti alla categoria “trasduzione del segnale” ci hanno indotto ad approfondire la nostra conoscenza sul ruolo di Ft32C-WAK e Ft312B-WRKY nella risposta allo stress da ozono nel nostro sistema vegetale.

Clone Numero di

Identificazione Identificazione putativa^a Categoria funzionale

Ft33B AJ698916 Calmodulin-like protein Trasduzione del segnale Ft32C AJ698917 Wall-associated kinase Trasduzione del segnale

Ft312B AJ698918 WRKY transcription factor Trasduzione del segnale-Transcrizione Fs23A AJ698919 Leucine-rich repeat protein Trasduzione del segnale-Risposta di difesa Ft35A AJ698922 Ascorbate peroxidase Risposta di difesa

Ft311B DQ377969 Glutathione S-transferase Risposta di difesa Fs16D AJ698921 Pathogenesis -related protein Risposta di difesa Ft31D DQ377961 Metallothionein 3 Risposta di difesa Ft37A DQ377962 Metallothionein 2 Risposta di difesa Fs13B AJ698925 O-methyltransferase Metabolismo secondario

Ft33C AJ698920 Phenylalanine ammonia-lyase Metabolismo secondario-Risposta di difesa Ft38B AJ698928 Demethylmenaquinone

methyltransferase-like

Metabolismo secondario-Risposta di difesa

Ft39D AJ698929 Glutamine synthetase Metabolismo Ft45G DQ377964 Cytosolic aldolase Metabolismo Ft312A DQ377965 Chloroplast aldolase Metabolismo Ft41D DQ377966 Aldehyde dehydrogenase Metabolismo Fs14C AJ698924 Vacuolar ATPase subunit H Metabolismo Fs35H AJ698923 Cytochrome P450 Metabolism

Ft38A DQ377968 Phospholipase D Metabolismo -Trasduzione del segnale Ft32A DQ377967 Photosystem I subunit III Energy-Metabolism

Ft43A DQ377963 PsbY protein Energy-Metabolism Fs14F AJ698931 Chloroplast ATPase subunit Energy-Metabolism

Ft42C AJ698930 Histone H2B Ciclo cellulare e processamento del DNA Ft312C AJ698927 Pelota-like protein Ciclo cellulare e processamento del DNA Ft310B DQ377970 40S ribosome protein S7 Sintesi proteica

Ft38D AJ698926 Endoplasmatic reticulum retrieval protein

Destino proteico

Ft36D Ft37D Ft42A Fs32B Fs36D Fs31D Fs26D

- - - - - - -

Poplar unknown protein^b Poplar unknown protein Poplar unknown protein Poplar unknown protein Poplar unknown protein Poplar unknown protein Poplar unknown protein

Geni sconosciuti Geni sconosciuti Geni sconosciuti Geni sconosciuti Geni sconosciuti Geni sconosciuti Geni sconosciuti a Identificazione basata sulla similarità di sequenza.

bCloni di cDNA che risultano simili con proteine sconosciute nel genoma di Populus trichocarpa.

Figura 4.1. RT-PCR Relative (sinistra) dei trascritti Ft33B-CaBP (A),

Fs23A-LRP (B), Ft312B-WRKY (C), Ft32C-WAK (D).

1. WRKY

1.1 Isolamento del trascritto Ft312B-WRKYnel clone I-214

Avendo isolato solo una porzione verso l’estremità 3' del trascritto Ft312B-WRKY, il primo passo è stato quello di isolare l’intero trascritto nel clone I-214, utilizzando una coppia di primer disegnati sulla sequenza del gene di Populus trichocarpa (fgenesh1_pm.C_LG_VI000803) più simile (99%) alla porzione del trascritto a nostra disposizione. L’amplificato ottenuto (Figura 3.2, Risultati par. 1) è stato clonato e sequenziato.

La sequenza aminoacidica dedotta presenta il dominio WRKY, definito sia dalla sequenza

aminoacidica WRKYGQK che dal motivo zinc finger-like, che caratterizza questa

superfamiglia di fattori di trascrizione (Figura 3.3A, Risultati par. 1). Il dominio WRKY

è indispensabile per il legame agli elementi W-box (Eulgem et al., 2000). Il numero dei

domini WRKY e le caratteristiche del motivo zinc finge-like sono gli elementi grazie ai

quali è possibile distinguere i membri di questa famiglia. Confrontando la sequenza

aminoacidica di Ft312B-WRKY con le sequenze aminoacidiche di tutti i membri della

superfamiglia WRKY di A. thaliana (Figura 1.10, Introduzione par. 3.2), Ft312B-

WRKY è risultato più simile ai membri appartenenti al Gruppo II, sottogruppo a. Le

proteine WRKY appartenenti al gruppo IIa presentano nella porzione N-terminale un

motivo leucine zipper (Figura 3.3A, Risultati par. 1) che sembra mediare

l’omodimerizzazione o l’eterodimerizzazione tra i membri di questo sottogruppo (Xu et

al., 2006). Questo tipo di associazione è stata trovata in vivo sia in orzo che in riso (Shen et

al., 2007; Xie et al., 2006). L’abilità dei fattori di trascrizione WRKY tipo IIa di formare

combinazione di dimeri con funzioni potenzialmente diverse spiega in parte i dati

contraddittori riguardanti le loro capacità di agire sia come regolatori positivi che negativi

nella risposta di difesa da stress biotici (Wang et al., 2006; Xe et al., 2006). La sovra-

espressione di uno dei WRKY di tipo IIa può modificare l’equilibrio esistente tra le

associazioni dimeriche dei vari membri, e quindi modificare il tipo di risposta da loro

dipendente (Euglem e Somssich, 2007).

L’analisi dell’intera sequenza aminoacidica ci ha rassicurato sul fatto che i primer precedentemente utilizzati per l’analisi preliminare dell’espressione del gene Ft312B- WRKY mediante RT-PCR Relativa (Figura 4.1) sono stati disegnati in modo che l’amplificazione sia risultata tipo-specifica, e quindi in grado di amplificare selettivamente solo il trascritto Ft312B-WRKY.

1.2 Analisi dell’espressione di Ft312B-WRKY nel clone I-214 e Eridano

Utilizzando la stessa coppia di primer è stato possibile analizzare l’andamento dell’espressione del gene Ft312B-WRKY, mediante RT-PCR Relativa, sia durante il trattamento acuto con l’O

(1, 2, 4, 5 ore durante il trattamento, figura 3.4A, Risultati par.

2), sia dopo (1, 4, 12, 24, 48 ore dopo il trattamento, figura 3.4B, Risultati par. 2). Questa

analisi ci ha permesso di osservare che, nel clone I-214, l’attivazione del gene Ft312B- WRKY avviene dopo 2 ore di esposizione, e continua, a parte una diminuzione dopo 4 ore, fino ad 1 ora dopo il trattamento, per poi diminuire fino a sparire quasi completamente dopo 24 ore dall’esposizione e aumentare nuovamente dopo 48 ore. Al contrario, nel clone sensibile Eridano, l’attivazione si verifica dopo 5 ore di esposizione, raggiunge e mantiene il suo picco fino ad 1 ora dopo il trattamento, e decresce fino a sparire 48 ore dopo lo stress.

Ciò che emerge dall’analisi del pattern di espressione di Ft312B-WRKY è un’attivazione precoce di questo trascritto nel clone tollerante (I-214) rispetto ad un’attivazione più tardiva nel clone sensibile (Eridano) durante il trattamento acuto, periodo in cui vengono attivate la maggior parte delle risposte. L’attivazione si mantiene anche dopo il trattamento in entrambi i cloni, diminuendo progressivamente in maniera del tutto paragonabile fino alle 12 ore dall’esposizione, a parte una seconda attivazione alle 48 ore nel clone tollerante, durante la fase di recupero.

Un’analisi del pattern espressivo del trascritto OsWRKY03 in riso effettuata da Liu et al.

(2005) in seguito al trattamento con diverse molecole segnale e agenti stressanti biotici e

abiotici, ha mostrato che il trascritto, dopo i trattamenti, presentava un comportamento del

tutto analogo a Ft312B-WRKY nel clone tollerante, con una diminuzione dopo 12 ore e un

successivo aumento dopo 48 ore. Analisi aggiuntive hanno condotto gli autori ad attribuire questa diminuzione al fatto che la raccolta dei campioni delle foglie alle 12 ore dopo l’esposizione cadeva di notte, e quindi, essendo l’espressione luce-dipendente, la diminuzione dipendeva esclusivamente dall’assenza di luce. Questa spiegazione non è altrettanto applicabile al nostro caso, poichè tutti i campionamenti sono stati effettuati di giorno: sembra quindi che l’attivazione di Ft312B-WRKY e di tutti i geni da lui regolati sia indispensabile durante la fase di recupero della risposta tollerante.

2. WAK

2.1 Isolamento del trascritto Ft32C-WAK nel clone I-214 e Eridano

Per quanto riguarda Ft32C-WAK abbiamo proceduto in maniera del tutto analoga al trascritto Ft312B-WRKY. Utilizzando una coppia di primer disegnati sulla sequenza del gene di Populus trichocarpa (eugene3.00061998) più simile (95%) alla porzione del trascritto a nostra disposizione (anche in questo caso prossima all’estremità 3') è stato possibile ottenere un amplificato di 2253 bp (Figura 3.5, Risultati par. 3). Il prodotto di PCR è stato clonato in vettore plasmidico e lo screening delle colonie ci ha permesso di identificare e isolare due forme del trascritto Ft32C-WAK, chiamate H e L (Figura 3.8, Risultati par. 3).

Le sequenze aminoacidiche dedotte delle due forme presentano tutti i domini funzionali tipici dei recettori chinasici appartenenti alla famiglia WAK (vedi Risultati par. 3, Introduzione par.4.4), e differiscono principalmente nella porzio ne extracellulare (60% di

similarità), mentre risultano praticamente identiche nella porzione citoplasmatica (97%). In

Arabidopsis thaliana sono stati identificati 5 membri appartenenti alla famiglia delle WAK

(He et al., 1999). Tra i membri di questa famiglia, la porzione extracellulare N-terminale

risulta la più variabile (40-60% di similarità), mentre il dominio serina-treonina chinasico

C-terminale risulta più conservato (86%). L’elevata similarità tra i domini serina-treonina

chinasici delle Ft32C-WAK H e L (97,5%) fa supporre che possano rappresentare due

forme diverse di uno stesso membro anziché due membri distinti della famiglia WAK,

Al fine di verificare l’esistenza delle due forme anche nel clone Eridano, il trascritto Ft32C-WAK è stato isolato utilizzando la stessa coppia di primer utilizzati per l’isolamento del trascritto nel clone I-214. Il prodotto di amplificazione (Figura 3.9, Risultati par. 3) è stato clonato, e lo screening delle colonie ci ha confermato l’esistenza anche nel clone Eridano delle due forme H e L. Anche in questo caso il maggior grado di variabilità si riscontra nella porzione extracellulare (60%) mentre risultano praticamente identici i domini serina-treonina chinasici (97,7%).

2.2 Analisi dell’espressione di Ft32C-WAK nel clone I-214 e Eridano

Vista l’elevata similarità delle Ft32C-WAK H e L, soprattutto nella porzione intracellulare, è stato necessario progettare due distinte coppie di primer in grado di amplificare selettivamente le due forme al fine di analizzare il loro comportamento espressivo durante il trattamento con l’ozono. Le due coppie di primer sono state disegnate nella regione extracellulare, a monte del dominio EGF (Figura 3.6, Risultati par. 3), sia per il clone I- 214 che Eridano.

Inizialmente l’analisi di espressione è stata condotta per entrambe le forme mediante RT- PCR Relativa durante il trattamento (Figura 3.11 e 3.12, Risultati par. 4). Il risultato che l’ana lisi ha mostrato è che solo la Ft32C-WAK H viene attivata durante il trattamento acuto con l’ozono: per questo motivo abbiamo deciso di analizzare più estensivamente il pattern espressivo della sola forma H (Figura 3.12, Risultati par. 4). Il trascritto della forma H presenta un notevole incremento dopo 2 ore di trattamento nel clone I-214;

l’attivazione persiste fino a 1 ora dopo l’esposizione, per poi sparire a 24 ore e aumentare nuovamente in fase di recupero (48 ore). Il pattern espressivo di Ft32C-WAK H che si riscontra nel clone Eridano è di un debole aumento (poco significativo) dopo 5 ore di trattamento che si mantiene a livelli bassi anche dopo la fine dell’esposizione.

Confrontando l’RT-PCR Relativa effettuata con Ft32C-WAK H con quella di Ft312B-

WRKY si può notare che, al contrario del clone Eridano in cui un’attivazione cospicua di

Ft312B-WRKY dopo 5 ore di trattamento induce solo un debole aumento di Ft32C-WAK

H, nel clone I-214 l’andamento dell’espressione dei due trascritti risulta estremamente concordante. Questo dato avvalora l’ipotesi di un possibile legame funzionale tra i due geni durante la risposta di difesa allo stress da ozono nel clone I-214. Date le numerose evidenze sperimentali riportate in letteratura riguardanti sia la presenza delle W-box nelle sequenze promotrici, sia l’interazione osservata tra fattori di trascrizione WRKY e membri della famiglia RLK, soprattutto in specifici programmi di difesa, ci è sembrato particolarmente interessante isolare la sequenza promotrice del gene Ft32C-WAK H nel clone I-214. Peraltro l’interazione diretta dei fattori di trascrizione WRKY e la loro attività di regolatore trascrizionale è stata dimostrata per molti geni implicati nella risposta di difesa sia da stress abiotici (Marè et al., 2004; Zou et al. 2006) che biotici (Kim e Zhang, 2004; Rocher et al., 2005).

2.3 Isolamento della sequenza promotrice del gene Ft32C-WAK H nel clone I-214

Al fine di isolare il promotore di Ft32C-WAK H è stato inizialmente necessario isolare l’intera sequenza ge nica. Il gene Ft32C-WAK H è stato amplificato a partire da DNA gnomico estratto dal clone I-214, utilizzando la stessa coppia di primer che ci hanno permesso di ottenere il trascritto completo. Il prodotto di amplificazione (Figura 3.16, Risultati par. 5) è stato clonato in vettore plasmidico, e, mediante screening delle colonie

è stato possibile isolare l’intera sequenza genica sia della forma H che L. Entrambi i geni Ft32C-WAK H e L presentano 2 introni, il primo tra due domini EGF (EGF ed EGF-Ca

), e l’altro tra il dominio EGF-Ca

e il dominio transmembrana. Questa distribuzione è concorde con quanto presente in letteratura circa l’architettura dei geni dei membri della famiglia WAK (He et al., 1999).

Utilizzando il Genome Walker Universal kit (BD Bioscences Clontech) è stato possibile

isolare il promotore del gene Ft32C-WAK H (vedi Materiali e Metodi per. 15, Risultati

par. 5). Il promotore rappresenta una sequenza che si trova a monte del sito di inizio di

ogni gene e che svolge una funzione regolatoria sulla trascrizione genica che è

fondamentale per la sopravvivenza degli organismi eucarioti. Il promotore consta di una

porzione detta core promoter che è definita come la sequenza minima di DNA contiguo sufficiente a dirigere l’inizio della trascrizione da parte della RNA polimerasi II (Butler et al., 2002). Il core promoter comprende il sito di inizio di trascrizione (TSS, transcription start site) e si può estendere sia a monte che a valle di esso (Butler et al., 2002; Molina e Grotewold, 2005). All’interno del core promoter si possono trovare alcuni elementi a DNA quali: TATAbox, che sono riconosciute specificamente dalle proteine TBE (TATAbox binding protein); l’elemento INR (Initiator element), importante per l’inizio della trascrizione (contiene il sito TSS); l’elemento BRE (TFIIB recognition element), che rappresenta il sito di legame del fattore TFIIB (transcription factor IIB). La proteina TBE e il fattore TFIIB, insieme all’RNA polimerasi II e altri fattori costituiscono il complesso di inizio della trascrizione (PIC, transcription pre-initiation complex).

A monte del core promoter si trovano una serie di sequenze (cis-acting DNA sequences) che rappresentano i siti di riconoscimento di una serie di fattori che svolgono un’importante funzione regolatoria sull’attività trascrizionale della RNA polimerasi II.

Nonostante la presenza di numerosi programmi computazionali per l’interpretazione dei promotori dei geni negli organismi vegetali, non sempre la ricostruzione dell’architettura del promotore basata sulla sola sequenza nucleotidica è affidabile, sia per il fatto che non sempre sono presenti tutti gli elementi del core promoter, sia per il fatto che mancano database che si basino su un’analisi genomica su larga scala (Molina e Grotewold, 2005;

Yamamoto et al., 2007).

Per analizzare la nostra sequenza promotrice ci siamo avvalsi sia di alcuni software

disponibili in rete (PLACE e Softberry) sia del lavoro di Yamamoto et al. (2007). In questo

modo è stato possibile identificare sia il core promoter (Figura 3.17, Risultati par. 5), sia

gli elementi W-box presenti nella “regione regolatoria” che si trova a monte. Quello che

abbiamo potuto costatare è la presenza di un cospicuo numero di elementi W-box,

localizzati tutti in una porzione della “regione rego latoria” piuttosto prossimale al core

promoter (-656bp-+40bp, rispetto al TSS). Questa osservazione avvalora la nostra ipotesi

circa un possibile ruolo di Ft312B-WRKY nella regolazione dell’espressione di Ft32C-

WAK H durante la risposta allo stress da ozono nel clone I-214, anche se sarà necessaria

una prova diretta dell’interazione di Ft312B-WRKY nella regione contenente le W-box nel

promotore di Ft32C-WAK H.