CAPITOLO 4
4.1 RACCOLTA DEL SEME E PREPARAZIONE DEI
CAMPIONI
Nella raccolta dei campioni di seme sono stati impiegati stalloni di razze diverse: Maremmana, Tiro Pesante Rapido, purosangue Arabo, Avelignese e altre. Tutti i soggetti erano presenti nell'Istituto di Incremento Ippico (Parco di San Rossore - Migliarino - Massaciuccoli, Pisa).
Prelievo del seme
Lo stallone, in presenza di una cavalla in calore, era fatto montare su un manichino per raccoglierne così il seme con vagina artificiale opportunamente preparata.
Le vagine artificiali usate erano la “Colorado” e la “Missouri” a seconda del cavallo e di come questi fosse stato abituato al prelievo. La temperatura dell’acqua usata per riempire la guaina interna doveva essere tale da garantire una temperatura di 42-50°C al momento del salto. La separazione della frazione post-spermatica nel caso in cui non fosse stata effettuata al momento del prelievo veniva eseguita immediatamente dopo la raccolta mediante garza.
Il seme filtrato era messo a bagnomaria a 37 °C per 6 minuti circa e prima della raccolta di due aliquote da 10ml per soggetto erano valutati i parametri di motilità e delle altre caratteristiche seminali.
4.2 DETERMINAZIONE DELLE CARATTERISTICHE
SEMINALI
4.2.1) % motilità e parametri cinetici
Dopo aver posto 5 µl di seme in una camera di Makler, le caratteristiche della motilità erano valutate utilizzando il sistema computerizzato Hamilton Thorn Motility Analyser (HTMA; IVOS version 10; Hamilton Thorn Research Danvers, MA, USA) e un microscopio a contrasto di fase.
I parametri cinetici determinati erano:
a) Motilità totale (%):percentuale di spermatozoi (spz) mobili
b) Motilità progessiva (%): percentuale di spermatozoi con motilità progressiva
c) VAP (µ/sec): velocità media del percorso effettivo d) VCL (µ/sec): velocità curvilinea
e) VSL (µ/sec): velocità lineare
g) LIN (VSL/VCL) (%): misura che valuta quanto si discosta la traiettoria dello spermatozoo rispetto ad una ipotetico percorso rettilineo.
4.2.2) Test eosina - nigrosina
Un’aliquota di 50 µl di seme fresco era diluita in 100 µl di eosina (1% in soluzione fisiologia) e agitata su vortex ; dopo 1 minuto erano aggiunti 50 µl di nigrosina (10% in acqua). Dopo agitazione, 5 µl della soluzione erano stratificati su vetrino portaoggetti e letti al microscopio (25x). Venivano contati almeno 100 spermatozoi e quelli che presentavano colorazione rosa della testa erano considerati "non-vitali"
4.2.3) Test Ipoosmotico (HOS – Test)
Un aliquota di 50 µl di seme fresco era diluita in 450 µl di H2O distillata. Dopo incubazione a 37°C per 5’, venivano prelevati 10 µl, depositati su vetrino portaoggetti e coperti con vetrino coprioggetto. Alla lettura del vetrino al microscopio venivano contati almeno 100 spermatozoi : quelli che presentavano il flagello arrotolato (aventi la membrana del flagello funzionante) erano considerati Hos positivi (Hos +).
4.2.4) Analisi morfologica
Un’aliquota di 10 µl di seme fresco era diluita 1:10 in tampone formolo salino (5 g. NaHCO3 + 10 ml H-CHO al 10% e portati ad 1 litro con H2OD) e depositati su vetrino portaoggetti. Dopo averli coperti con vetrino coprioggetto erano letti al microscopio (40x) almeno 100 spermatozoi e classificati nelle seguenti classi morfologiche:
a) Spz normali ; b) Spz con flagello Avvolto; c) Spz con Flagello Angolato; d) Flagelli isolati; e) Spz con Anomalie della Testa; f) Forme senza flagello; g) Forme duplici; h) Forme in lisi; i) Spz immaturi.
4.2.5) Concentrazioni spermatozoi
La concentrazione degli spermatozoi era valutata tramite tecnica
spettrofotometrica utilizzando lo spettofotometro Ultrospec 2000 (Pharmacia Biotech).
4.3 DETERMINAZIONE DELL’
α-TOCOFEROLO,
COENZIMA Q
10E DIPEPTIDI ISTIDINICI
Da ogni eiaculato erano prelevate due aliquote di 10 ml. Una aliquota era usata per la determinazione del dell'α-tocoferolo e del coenzima Q10 mentre l'altra era utilizzata per la determinazione dei dipeptidi istidinici. Gli spermatozoi di ciascuna aliquota erano separati dal plasma seminale mediante centrifugazione (10 min a 1000g). Il pellet di spermatozoi che ne risultava veniva lavato con 5ml di soluzione fisiologica e dopo nuova centrifugazione, il sovranatante risultante era scartato, mentre gli spermatozoi venivano risospesi in soluzione fisiologica fino ad un volume finale di 1,2 ml; 10 µl di tale sospensione, opportunamente diluiti, erano utilizzati per la determinazione della concentrazione degli spermatozoi con camera di Thoma.
4.3.1) α−TOCOFEROLO E COENZIMA Q10
Estrazione simultanea di α-tocoferolo e Coenzima Q10
Per la determinazione di queste due molecole si utilizzava un sistema di estrazione simultanea (Gazzano e coll., 2003). Il plasma (1ml) e la
sospensione degli spermatozoi (1ml ) erano sottoposti a saponificazione, previa incubazione per 30 min. a 60°C, con 1 ml di Acido Ascorbico 1% (in soluzione acquosa di EDTA 1mM), 1 ml di Etanolo, e 150 µl di una soluzione acquosa satura di KOH. Dopo raffreddamento, i campioni venivano addizionati con 4 ml di una soluzione di BHT allo 0,0025% in n-Esano e agitati su vortex per 5 minuti. Dopo centrifugazione la fase superiore costituita da Esano, (3,5 ml) era trasferita in provetta e portata a secco sotto flusso di azoto a 37°C. I residui secchi erano ripresi una prima volta con 50 µl di metanolo e 20 µl erano iniettati in HPLC per la determinazione dell' α-Tocoferolo. Successivamente i campioni, nuovamente essiccati erano ripresi con 50 µl di Etanolo, e 20 µl erano iniettati in HPLC per la determinazione del Co10 .
Allestimento curva di taratura per la determinazione dell'α-Tocoferolo
Da una soluzione madre di α-tocoferolo (100 nmoli/ml) venivano presi 100µl (10 nmoli/ml) e successivamente con diluizioni 1:2, venivano preparate soluzioni scalari alle seguenti concentrazioni: 10nmoli/100µl; 5nmoli/100µl; 2,5nmoli/100µl; 1,25 nmoli/100µl; 0,625 nmoli/100µl; 0,3125 nmoli/100µl) per l’allestimento della curva
di taratura. Questa veniva ottenuta con tre repliche per ogni punto di concentrazione sia con estrazione che senza estrazione per la valutazione della percentuale di recupero (Gazzano e coll.,, 2003).
Strumentazione e condizioni di sistema per la determinazione dell'α-Tocoferolo
La strumentazione HPLC era costituita da una pompa Jasco PU 1580, un rivelatore fluorimetrico Jasco FP920 settato alle lunghezze d’onda di eccitazione di λex = 286 e di emissione di λem = 330.
Per la separazione dei campioni veniva utilizzata una colonna Sperisorb S5 PC18, Phase Sep; la Fase mobile: 92/8 metanolo/acqua v/v veniva immessa nel circuito al flusso di 1 ml/min..
In tali condizioni operative il tempo di ritenzione dell'α-tocoferolo risultava essere di 7,80 minuti.
Allestimento curva di taratura per la determinazione del Coenzima Q10
Per l’allestimento della curva di taratura del CoQ10 venivano aggiunte a provette contenenti quantità fisse (50 µl) di 2-decaprenil-3,5,6,trimetil-1,4 benzochinone (standard interno), rispettivamente 10, 40, 80, 120 e 200 µl di una soluzione madre di CoQ10 (5µg/ml),
corrispondenti a quantità scalari di: 0,05µg; 0,2µg; 0,4µg; 0,6µg; 1,0 µg di CoQ10. Ogni punto di concentrazione della curva veniva replicato 3 volte.
Strumentazione e condizioni di sistema per la determinazione del Coenzima Q10
La strumentazione HPLC era costituita da una pompa Jasco PU 1580, con rivelatore UV-VIS Jasco 870 settato alla lunghezza d’onda di 275 nm. Per la separazione dei campioni veniva utilizzata una colonna Nucleosil 100-5 C18 Macherey Nagel; la Fase mobile costituita da 80/20 v/v etanolo/metanolo veniva immessa nel circuito al flusso di 1,1 ml/min..
In tali condizioni operative il tempo di ritenzione del Coenzima Q10 era 11,07 minuti mentre quello dello standard interno era di 15,75 minuti .
Reagenti utilizzati per la determinazione del Coenzima Q10 e
dell'α-Tocoferolo
Metanolo ed etanolo per HPLC (Merck); Acido l-Ascorbico (Sigma); α-Tocoferolo (Sigma), EDTA (Ac. Eilendiaminotetraacetico Sigma); Idrossido di potassio (C. Erba reagenti); BHT ((Butilidrossitoluene)
Sigma Aldrich;, Coenzima Q10, 2-decaprenil-3,5,6,trimetil-1,4 benzochinone, α-Tocoferolo, Esano (Merck) .
4.3.2) CARNOSINA, ANSERINA E L-ISTIDINA
Metodica di estrazione della carnosina, anserina e della l-istidina.
Campioni di plasma seminale e di spermatozoi messi in provette Eppendorf erano addizionati con 800 µl di Acido 5-solfo-salicilico (SSA), agitati su vortex per 1 minuto e successivamente centrifugato a 10700 rpm per 20 minuti. Il sovranatante veniva passato su lana di vetro e 300 µl di filtrato erano trasferiti in Eppendorf ed addizionati con 900 µl di SSA; la miscela era agitata su vortex per 1 minuto e mantenuta in frigo per 15 minuti. La sospensione veniva successivamente centrifugata a 12000 rpm per 3 minuti e 20 µl di sovranatante erano iniettati in HPLC.
Allestimento curva di taratura per la determinazione della Carnosina, dell'Anserina e della l-Istidina.
La soluzione madre era ottenuta addizionando 20 mg di carnosina e 20 mg di anserina e l-istidina a 200 ml di acido 5-solfosalicilico con
concentrazioni finali di ciascun composto di 100 µg/ml. Partendo da una soluzione di 12.5 µg/ml, quantità scalari dei composti (12,5 – 6.25 – 3.125- 1.562 – 0.781 – 0.391 µg/ml) erano messe in provette con tappo a vite e mantenute alla temperatura di 4° C. La curva di taratura era ottenuta iniettando 20 µl di ciascuna concentrazione scalare che corrispondevano a : 250,125;62,5;31,25;15,62;7,81;3,9 ng/20 µl.
Strumentazione e condizioni di sistema per la determinazione della Carnosina, dell'Anserina e della l-Istidina
La strumentazione HPLC era costituita da 2 pompe Jasco PU 1580, con rivelatore a fluorescenza settato alle lunghezze d’onda di eccitazione di λex = 340 e di emissione di λem = 445.
Per la separazione dei campioni veniva utilizzata una colonna Xpertek: SP-SCK 5 µ a scambio cationico (Cobert Associates, Inc). La fase mobile costituita da 15% di acetronitrile e 85 % di una soluzione 6mM HCl + 0,48 moli/litro di Na Cl veniva immessa nel circuito al flusso di 1,0 ml/min..
La derivatizzazione post colonna era effettuata con ortoftalaldeide che veniva immessa nel circuito al flusso 0,5 ml/min ed avveniva alla temperatura costante di 30 °C.
In tali condizioni operative il tempo di ritenzione della l-istidinaera di 4,45 minuti quello della carnosina di 5,083 minuti e quello dell'Anserina di 6,075 minuti.
Preparazione della soluzione utilizzata per la derivatizzazione post colonna
15,5 grammi di Acido Borico e 13 grammo di idrossido di Potassio venivano disciolti in 500 ml di acqua. A tale soluzione venivano aggiunti 1,5 ml di Brij 35 e 1,5 ml di Mercaptoetanolo e 2,5 ml di Metanolo contenenti 100 mg di Dialdeide ftalico (OPA).
Reagenti utilizzati per la determinazione della Carnosina, dell'Anserina e della l-Istidina
Carnosina, Anserina, l-Istidina, Acido 5-solfo-salicilico (Sigma); Cloruro di Sodio (Fluka); Acido Borico (Sigma); Idrossido di Potassio (C. Erba reagenti), Brij 35, 2-Mercaptoetanolo (Sigma), Dialdeide ftalico (Fluka), Metanolo per HPLC (Merck).