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Il metodo Sanger

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Academic year: 2021

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(1)

Il metodo Sanger

(o metodo a terminazione di catena)

Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad 1) Uno stampo a singola elica

2) un innesco specifico (primer)

3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35S ha bisogno di:

4) una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza

(2)

La sintesi del filamento compementare, tuttavia non prosegue indefinitivamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro

distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossinucleotidi

trifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento perché posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’

Terminazione della catena

(3)

DNA stampo a singola elica

3’-GGCTAAC

3’-GGCTAAC

5’ 3’

Ibridazione con Il primer

+

[35S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi

ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP

-CCG ddA -ddC

-C ddC -CC ddG

-CCGATT ddG -CCGA ddT -CCGAT ddT

Sequenza: 5’-CCGATTG A C G T

-CCGATT ddG -CCGAT ddT -CCGA ddT -CCG ddA -CC ddG -C ddC -ddC

G T

T A GC C

Schema di sequenziamento a terminazione di catena

Direzione di lettura

(4)

Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti

Coniugando a ciascun ddNTP un diverso marcatore fluorescente, è possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggio

e caricare il tutto in solo pozzetto di gel ddA

ddC ddT ddG

(5)

Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.

(6)

Fluorescent DNA Sequencing

A G T A C T G G G A T C

Gel

Electrophoresis

(7)

Detection of Fluorescently Tagged DNA

DNA Fragments Separated by Electrophoresis

Output to Computer

Scanning Laser Excites

Fluorescent Dyes Optical

Detection System

(8)

Fluorescent DNA Sequencing

Data

(9)

Fluorescent DNA Sequence Trace

(10)

Overview of Facts Asserted

• 2.91 billion base pairs (bp)

• 1.1% exons, 24% introns, 75% intergenic DNA

• 2.1 million single nucleotide polymorphisms (SNP’s)

• less than 1% of all SNP’s reflected changes in proteins

(11)

Structure of the genome

Riferimenti

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