CAPITOLO 7 DISCUSSIONE
Lo screening genetico dei geni Gata4 e Nkx2.5 ha rilevato la presenza di molteplici varianti polimorfiche, ma nessuna mutazione nella porzione codificante dei geni considerati in entrambi i gruppi di pazienti, sia sporadici che familiari.
L'assenza di mutazioni patologiche da noi riscontrata sia nella linea germinale che in quella somatica sottolinea l'estrema complessità che si cela dietro l'eziologia delle CC.
Storicamente, le prime evidenze del forte impatto della genetica nell'eziologia delle CC sono costituite da osservazioni epidemiologiche, le quali hanno mostrato che circa 1/3 dei bambini con cardiopatia congenita presenta anche malformazioni extracardiache nell'ambito di sindromi genetiche (Ferencz et al.,1993).
L'identificazione di associazioni specifiche tra la cardiopatia congenita e la sindrome in cui si manifesta ha consentito di porre le prime basi per l'identificazione dei difetti genetici implicati nelle malformazioni cardiovascolari (Digilio MC et al., 2004).
In questo contesto rientrano gli studi che hanno investigato il ruolo cruciale svolto dai fattori di trascrizione essenziali per la corretta morfogenesi cardiaca (Clark KL et al., 2006; Garg V., 2006). Sono state, infatti, riscontrate mutazioni, a livello dei geni che codificano per questi fattori, sia nella regione codificante (mutazioni sinonime e/o non-sinonime) che nella regione non-codificante a livello dei geni che codificano per questi fattori e
che sembrano partecipare allo sviluppo anomalo del cuore. Tali risultati sono stati, però, complicati dalla bassa percentuale dei difetti genetici in casi sia familiari che sporadici di CC e dall'elevato grado di eterogeneità che caratterizza le CC stesse (Shieh JTC et al., 2009). Risulta, pertanto, difficile applicare il modello monogenico alle cardiopatie non-sindromiche, sia per l'elevato numero di geni implicati e per le complesse interazioni tra i vari fattori di trascrizione sia per il fatto che malformazioni cardiache simili possono originare da anomalie congenite differenti e viceversa (Digilio MC et al., 2004).
Recentemente, la bassa percentuale di mutazioni nella linea germinale a carico dei diversi fattori di trascrizione ha introdotto nuovi meccanismi eziopatogenetici, tra cui il concetto di mutazioni somatiche (Reamon-Buettner SM et al., 2005; Wessels and Willems., 2010).
E' ormai noto come mutazioni somatiche caratterizzino le cellule cancerogene, ma ultimamente sono state riconosciute come causa alternativa e/o aggiuntiva anche di altri meccanismi patologici (Erickson RP.,2003; Erickson RP., 2010).
A questo proposito, negli ultimi anni, alcuni studi portati avanti da Borlak e dal suo gruppo di lavoro hanno ipotizzato che mutazioni nella linea somatica, oltre che nella linea germinale, dei geni Nkx2.5, Gata4 e Tbx5 possano rappresentare una valida causa di cardiopatia congenita (Reamon-Buettner SM et al.,2004; Reamon-Buettner SM et al.,2006). Tali ricerche hanno rilevato la presenza di una popolazione di cellule cardiache portatrice di diverse mutazioni somatiche solo nel tessuto malato del paziente e non nel tessuto sano dello stesso (Reamon-Buettner SM et
al.,2005). Queste varianti geniche interessano i siti di legame dei principali fattori di trascrizione cardiaci e, per tanto, sembrano responsabili di alterate interazioni DNA-proteine o proteine-proteine che possono concorrere allo sviluppo delle CC (Reamon-Buettner SM et al.,2007). Negli anni successivi, i risultati ottenuti da Borlak furono, però, ampiamente contestati a causa dell'utilizzo di tessuto conservato in formalina per più di 22 anni. E' noto, infatti, come la formalina possa creare degli artefatti nel DNA e rendere meno attendibile la reazione di PCR (Quach N et al., 2004). Pertanto lo studio di Borlak venne, nel 2009, replicato, utilizzando DNA isolato da tessuto cardiaco affetto fresco per la ricerca di mutazioni nella linea somatica nel gene Nkx2.5. Lo screening genetico di 28 pazienti affetti da difetti del setto atrio-ventricolare non ha portato all'identificazione di mutazioni nella linea somatica del gene Nkx2.5 (Draus Jr JM et al., 2009). Tuttavia, tali risultati non escludono il possibile ruolo di mutazioni somatiche nell'insorgenza delle CC, ma sottolineano la necessità di utilizzare strumenti più sensibili per individuarne la presenza dato che si manifestano con una bassa frequenza nella popolazione.
Anche i dati ottenuti dai nostri pazienti sembrano non confermare l'ipotesi del coinvolgimento di mutazioni nella linea somatica nello sviluppo di CC, in quanto le varianti geniche da noi riscontrate nel DNA estratto da tessuto sono presenti anche nel DNA isolato da sangue periferico, sottolineando la loro origine germinale.
Negli ultimi anni, molta attenzione è stata rivolta verso la regione 3' non tradotta (3'UTR), importante sito di legame per l'RNA messaggero (mRNA) e fondamentale per la corretta espressione genica sia durante la gametogenesi che durante lo sviluppo embrionale (Stebbins-Boaz B and Richter JD., 1997). Grazie alla presenza di elementi regolatori, la regione 3'UTR gioca un ruolo fondamentale nella sintesi, nel trasporto nucleare, nella stabilità e nella degradazione del RNA messaggero (Conne B et al., 2000) (Fig.16).
Fig.16. Funzioni svolte dalla regione 3' non tradotta (modificata da Conne B et al / Nature Medicine 2000)
Sono state identificate più di 80 diverse patologie probabilmente associate a variazioni nella regione 3'UTR, le quali sembrano alterare la funzione regolatoria di questa regione, modificando la struttura secondaria del mRNA (Chen JM et al., 2006).
La regione 3'UTR del gene Gata4 sembra rappresentare anche un “molecular hotspot” per lo sviluppo di CC (Reamon-Buettner SM et al., 2007). Sono state, infatti, riscontrate diverse varianti geniche, nel tessuto cardiaco affetto, probabilmente associate alle CC, in quanto responsabili di un'alterata struttura secondaria del mRNA capace di modificare la localizzazione e la traslazione della proteina (Reamon-Buettner SM et al., 2007) (Fig.17).
Fig.17. Effetti delle mutazioni nella regione 3'UTR del gene Gata4 sulla struttura del mRNA (Reamon-Buettner SM et al / BMC Medical Genetics 2007).
Tale studio ha, quindi, suggerito un nuovo possibile meccanismo molecolare alla base delle CC che non include la porzione codificante del gene, ma considera le alterazioni dei meccanismi post-trascrizionali e quindi anche epigenetici.
processo di tumorigenesi, agendo sia come oncosoppressori che oncogeni. E' stato, quindi, ipotizzato che la presenza di polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) all’interno della regione 3’UTR possa alterare il legame tra i miRNA ed i loro target, influenzando la regolazione dei geni e il rischio individuale di sviluppare la malattia (Chen K and Rayewsky N., 2007; Chen K et al., 2008; Landi S et al., 2008).
A questo proposito è stata avanzata l'ipotesi che la presenza di varianti geniche nella regione 3'UTR di specifici fattori di trascrizione cardiaci, possa modulare l'insorgenza di CC
Anche i nostri dati hanno rilevato la presenza di diversi polimorfismi, precedentemente descritti (Reamon-Buettner SM et al., 2007), nella regione 3'UTR. Tuttavia la maggior parte di queste varianti sono caratterizzate da una frequenza elevata nella popolazione di controllo; anche l'unica variante da noi riscontrata in due soli casi familiari (+852 g>a) e non presente in letteratura, risulta avere una frequenza allelica elevata anche nei nostri 50 soggetti di controllo.
Pertanto ulteriori studi di tipo caso-controllo saranno necessari per verificare l'ipotesi del coinvolgimento della regione 3'UTR nell'insorgenza delle CC.
Fig.18. Polimorfismi riscontrati nella regione 3'UTR nei nostri pazienti
