L’obiettivo primario del presente lavoro di tesi è stato la messa a punto di un metodo efficace per lo studio della formazione di reti neurali in vitro a partire dai singoli neuroni e della loro evoluzione nel tempo.
Le reti neurali in vitro rappresentano degli ottimi modelli, seppure semplificati, delle reti nervose in vivo e mostrano una topologia non casuale che può essere studiata acquisendo ed analizzando una serie di immagini delle stesse e quindi usando tecniche non invasive.
Le reti sono state ottenute seminando, in apposite piastre da coltura contenenti un terreno appropriato, dei neuroni embrionali di topo al tredicesimo giorno di gestazione, provenienti dall’area del mesencefalo. Le piastre sono state mantenute all’interno di un apparecchio denominato incubatore in cui l’atmosfera è mantenuta a concentrazioni fisse di CO
2, a un’umidità del 90% e ad una temperatura di 37°C.
E’ stata realizzata una procedura che consentisse di scattare delle foto al microscopio della medesima area della piastra da coltura a intervalli di tempo differenti, all’incirca ogni 24 ore, così da poter
“ritrovare” nelle immagini successive di una stessa rete sempre gli stessi neuroni.
Tra il primo e il sesto giorno di coltura si è assistito ad un intenso cambiamento, caratterizzato da alcune delle stesse fasi presenti nello sviluppo di una rete neurale in vivo:
migrazione dei neuroni;
crescita di assoni e dendriti e formazione di una rete di interconnessioni provvisoria;
rifinitura delle connessioni sinaptiche con l’eliminazione di alcune sinapsi in surplus e il rafforzamento di altre, in modo da creare uno schema di connessioni ordinato più precisamente.
Già dal primo giorno, i corpi delle cellule neurali si sono aggregati in cluster e il processo di clusterizzazione o fusione, proseguito anche nei giorni successivi, è stato accompagnato dall’assorbimento o dal riarrangiamento dei neuriti.
Il processo di crescita osservato nelle colture bidimensionali ha consentito di dimostrare l’esistenza di un processo di auto- organizzazione che conduce alla caratteristica struttura del sistema nervoso in vivo: concentrazioni o clusterizzazioni dei soma delle cellule nervose (nuclei nel SNC e gangli nel SNP), interconnessi da gruppi o cordoni di fibre nervose (tratti nel SNC e nervi nel SNP).
Al settimo giorno tutte le reti hanno completato il loro processo di maturazione e hanno raggiunto una configurazione stabile, che nei giorni successivi non ha subito alcuna modifica, fatta eccezione per la morte di alcuni neuroni.
Due forze opposte hanno imposto la morfologia della rete matura.
Se da un lato la crescita di un elevato numero di assoni e di alberi dendritici altamente ramificati permette la formazione di reti con il massimo dell’interconnettività, caratterizzate da un efficiente flusso di informazioni e da elevate capacità computazionali, dall’altro ha un elevato costo energetico. Così la struttura finale della rete
neuronale è stata una conseguenza dell’interazione tra questi fattori.
La presenza della forte relazione tra la struttura di una rete e la sua funzione ha consentito di determinarne la dinamica e l’attività analizzando la sua morfologia e la topologia della connettività, ovvero i differenti percorsi su cui può viaggiare l’informazione attraverso i neuroni. Per far ciò le reti sono state modellate matematicamente come dei grafi in cui i nodi sono il centro di un aggregato di neuroni e gli archi sono le sinapsi.
Tre differenti reti sono state sottoposte, giorno per giorno, a tutte le analisi ampiamente descritte nel capitolo 5.
Molte di queste analisi sono state eseguite, sempre a partire dalle immagini delle reti, in maniera “automatica” grazie agli algoritmi sviluppati in ambiente Matlab nella parte informatica di tale lavoro di tesi.
Dai risultati ottenuti, riportati in maniera particolareggiata nel capitolo 6 per tre delle reti testate, è stato possibile trarre alcune importanti considerazioni.
1) Analisi della raggiungibilità
Le reti evolvono fino ad arrivare, entro il settimo giorno di coltura, ad una configurazione stabile in cui ogni nodo è raggiungibile da tutti gli altri nodi.
La totale raggiungibilità tra nodi permette che all’interno della rete vi sia un’ottima diffusione dell’informazione.
2) Studio delle distanze tra i nodi
Affinché due nodi possano fondersi in un unico nodo di dimensione maggiore, la distanza tra di essi deve scendere al di sotto di una certa soglia, che rappresenta una sorta di “distanza caratteristica”, variabile da rete a rete.
Il raggiungimento di una distanza inferiore alla distanza caratteristica è una condizione necessaria ma non sufficiente per la fusione, che per avvenire richiede anche che un nodo invii all’altro una quantità sufficiente di chemioattrattore o un qualche altro segnale chimico. Entra quindi in gioco la comunicazione biologica tra cellule.
3) Costruzione del grafo e analisi della connettività di ogni singolo nodo e dell’intera rete
Con il passare del tempo si stabiliscono delle nuove interconessioni e ciò, adoperando il linguaggio della “teoria dei grafi” di cui ci siamo serviti, è dimostrato dal fatto che dal primo al settimo giorno di coltura:
aumenta il numero degli archi;
nella matrice delle adiacenze aumentano gli 1, aumenta cioè il numero dei neuroni direttamente connessi;
il grado di ogni nodo tende ad aumentare o al più resta costante per qualche giorno;
la connettività media della rete aumenta.
Tali risultati hanno tutti confermato la presenza di un processo continuo di sinaptogenesi (sviluppo di connessioni tra neuroni), a volte abbastanza rapido da provocare variazioni nella connettività
evidenti dopo poco tempo, a volte più lento e quindi richiedente più di 24 ore per completarsi.
4) Test small-world
Ogni giorno ciascuna rete è stata sottoposta al test small-world.
Affinché un rete possa essere classificata come small-world, è necessario che si verifichino due condizioni:
la lunghezza media del cammino nella rete deve essere maggiore di quella di un un grafo random con lo stesso numero di nodi e la stessa connettività media e, contemporaneamente, minore di quella di un grafo regolare con lo stesso numero di nodi e la stessa connettività media;
il coefficiente di clustering della rete deve essere maggiore di quello di un grafo random con lo stesso numero di nodi e la stessa connettività media.
Tutte le reti in vitro mature rientrano, come ipotizzato ma non ancora dimostrato sperimentalmente da molti scienziati, nella categoria degli small-world e sono quindi caratterizzate da:
• L piccolo: percorsi caratteristici corti e quindi pochi passi per andare da un nodo a qualunque altro, il che implica un’elevata efficienza globale;
• C grande: elevata tendenza all’aggregazione e quindi alla formazione di gruppi locali molto ben connessi, il che implica un’elevata efficienza locale.
Le reti small-world combinano la veloce trasmissione dell’informazione con la massima economia nella lunghezza e nel numero delle connessioni (minor costo energetico).
Si è visto inoltre che le reti possono diventare small-world ancora prima di completare la loro maturazione, gia dopo qualche giorno di coltura.
Come evidenziato nella tabella 1, il tempo di raggiungimento della configurazione small-world è tanto minore quanto maggiore è la connettività iniziale della rete, ovvero la connettività media al primo giorno. Inoltre, le reti che divengono prima small-world sono anche quelle che giungono prima alla completa raggiungibilità.
Tabella 1 Relazione tra la connettività iniziale delle reti e i giorni di raggiungimento della configurazione small-world e di ottenimento della
completa raggiungibilità
Rete
Connettività media al giorno 1
Raggiungimento configurazione
small-world
Ottenimento completa raggiungibilità
1 1.0667 giorno 3 Giorno 5
2 0.8 giorno 7 Giorno 7
3 1.75 giorno 2 Giorno 2
Questa tesi si colloca in un progetto più ampio e generale.
La comprensione del meccanismo di evoluzione e organizzazione di una rete neurale funzionante e l’estrazione delle sue caratteristiche topologiche e metriche rappresentano il primo e fondamentale passo per l’individuazione dei fenomeni alla base dell’alterazione dello sviluppo neurologico e quindi della formazione di reti non perfettamente funzionanti.
In particolare, l’attenzione è rivolta ad uno dei disordini dello sviluppo del sistema nervoso centrale: l’autismo. E’ stato dimostrato che il cervello di soggetti affetti da autismo è caratterizzato da un’anormale connettività, ma né le cause, né l’istante preciso in cui questa si presenta sono stati completamente chiariti.
Tutte le analisi messe a punto in tale tesi e dimostratesi efficaci verranno ripetute per reti in vitro ottenute seminando neuroni del cervelletto, dato che l'anomalia cerebellare svolge un ruolo centrale nell’autismo.
Verranno studiati, sotto forma di cellule isolate, colture e sezioni, campioni di cervelletto di topi normali e di topi per i quali la mancanza di un gene ne provoca i sintomi dell’autismo e, sulla base di un confronto tra i risultati ottenuti, sarà possibile rilevare quali possano essere le alterazioni morfologiche e di connettività alla base dell’autismo e comprendere come queste influenzino l’iniziale sviluppo anormale del cervello.
Saranno inoltre analizzati in modo quantitativo particolari aspetti della struttura delle connessioni, come ad esempio con quali angoli, ramificazioni o a quali distanze sono connesse le cellule.
Se questi studi avranno successo, i ricercatori del Centro “E.
Piaggio” potranno aggiungere molecole in grado di modificare l’architettura neuronale. Ciò consentirà di vedere se è possibile correggere precocemente la connettività, proprio durante le prime fasi dello sviluppo, così da contribuire a nuove e permanenti cure per l’autismo.
Un altro importante sviluppo futuro riguarda l’evoluzione ed il perfezionamento degli algoritmi realizzati.
Considerando il fatto che la trasmissione sinaptica ha una direzionalità, potrebbe rivelarsi estremamente utile realizzare un algoritmo che tiene conto di ciò e che consenta quindi una distinzione tra il neurone che invia il segnale (presinaptico) e il neurone che lo riceve (postsinaptico). Ciò, in termini di teoria dei grafi, significherebbe la costruzione e l’utilizzo di grafi orientati.
Potrebbe inoltre essere significativa una normalizzazione dei vari parametri rispetto al numero dei nodi individuati in ogni rete, così da realizzare un’analisi indipendente da tale fattore.
