1.2 VACCINAZIONE DONATORI CON CANILEISH®
I 27 cani sono stati suddivisi in base al numero di somministrazioni in 3 gruppi:
1 e γ contengono le proteine di fase acuta α-
aptoglobina, transferrina e proteina C reattiva)39 ed anche allo sviluppo di immunità vaccinale (poiché le frazioni β-2 e γ globuline contengono rispettivamente IgA, IgM
Al fine di verificare l’aumento delle immunoglobuline post-vaccinazione sono stati effettuati per un sottogruppo di soggetti (10 su 12 del Gruppo 2 e 7 su 9 del Gruppo 3) i dosaggi delle frazioni IgA, IgM e IgG relative ai tempi T0 e T3 per il Gruppo 2 e relative ai
T3 per il Gruppo 3.
Pearson ha evidenziato una distribuzione normale dei dati, test per dati appaiati.
L’analisi della frazione IgG del Gruppo 2 ha mostrato una differenza statisticamente significativa (p=0.029) fra i tempi T0 e T4. Di seguito il grafico box and whisker.
81
2 globuline (%): correlazioni statistiche tra i vari tempi.
enza statisticamente
La significatività di questi risultati si suppone sia riconducibile ad una risposta infiammatoria di fase acuta conseguente all’inoculazione del vaccino (poiché le frazioni -2 macroglobulina, ed anche allo sviluppo di immunità 2 e γ globuline contengono rispettivamente IgA, IgM
vaccinazione sono stati tti (10 su 12 del Gruppo 2 e 7 su 9 del Gruppo 3) i dosaggi delle frazioni IgA, IgM e IgG relative ai tempi T0 e T3 per il Gruppo 2 e relative ai
Pearson ha evidenziato una distribuzione normale dei dati, pertanto è
L’analisi della frazione IgG del Gruppo 2 ha mostrato una differenza statisticamente significativa (p=0.029) fra i tempi T0 e T4. Di seguito il grafico box and whisker.
I risultati dei T-test delle altre frazioni immunoglobuliniche (IgA, IgM) del Gruppo 2 non sono statisticamente significativi.
Per i dati del Gruppo 3 è stato applicato un Kruskal T0-T2-T3, ma nessun parametro
Il T-test applicato sui dati dei tempi T0 e T3 del Gruppo 3 ha evidenziato significatività per le frazioni IgM (p=0.006) e IgG (p=0.010). Di seguito sono riportati i grafici box and whisker.
Grafico 9 – T-test IgG (mg/dL) Gruppo 2
test delle altre frazioni immunoglobuliniche (IgA, IgM) del Gruppo 2 non sono statisticamente significativi.
Per i dati del Gruppo 3 è stato applicato un Kruskal-Wallis test relativamente ai tempi T3, ma nessun parametro è risultato statisticamente significativo.
test applicato sui dati dei tempi T0 e T3 del Gruppo 3 ha evidenziato significatività per le frazioni IgM (p=0.006) e IgG (p=0.010). Di seguito sono riportati i grafici box and
Grafico 10 – T-test IgM (mg/dL) Gruppo 3
82
test delle altre frazioni immunoglobuliniche (IgA, IgM) del Gruppo 2 non
Wallis test relativamente ai tempi è risultato statisticamente significativo.
test applicato sui dati dei tempi T0 e T3 del Gruppo 3 ha evidenziato significatività per le frazioni IgM (p=0.006) e IgG (p=0.010). Di seguito sono riportati i grafici box and
In base ai risultati ottenuti si conferma che la significatività delle frazioni
imputabile ad un aumento di IgM e IgG, in conseguenza dello sviluppo nel tempo di immunità post-vaccinazione.
La risposta infiammatoria di fase acuta non è stata indagata in questo studio, pertanto nuove indagini potrebbero essere utili ad approfondire questo aspetto.
Oltre a questi risultati statistici si segnalano altre lievi alterazioni riscontrat
- iperprotidemia nel 17,6%
valori di proteine totali risulta non essere statisticamente significativo
- modificazioni individuali del tracciato dell’elettroforesi delle sieroproteine, a carico delle frazioni
Grafico 11 – T- test IgG (mg/dL) Gruppo 3
In base ai risultati ottenuti si conferma che la significatività delle frazioni
imputabile ad un aumento di IgM e IgG, in conseguenza dello sviluppo nel tempo di accinazione.
La risposta infiammatoria di fase acuta non è stata indagata in questo studio, pertanto nuove indagini potrebbero essere utili ad approfondire questo aspetto.
Oltre a questi risultati statistici si segnalano altre lievi alterazioni riscontrat
iperprotidemia nel 17,6% dei casi. Nonostante ciò l’aumento nel tempo dei valori di proteine totali risulta non essere statisticamente significativo
modificazioni individuali del tracciato dell’elettroforesi delle sieroproteine, a carico delle frazioni sopra citate. (Figura 7)
83
In base ai risultati ottenuti si conferma che la significatività delle frazioni β-2 e γ sia imputabile ad un aumento di IgM e IgG, in conseguenza dello sviluppo nel tempo di
La risposta infiammatoria di fase acuta non è stata indagata in questo studio, pertanto nuove indagini potrebbero essere utili ad approfondire questo aspetto.
Oltre a questi risultati statistici si segnalano altre lievi alterazioni riscontrate:
Nonostante ciò l’aumento nel tempo dei valori di proteine totali risulta non essere statisticamente significativo;
Figura 7 – Esempio di modificazioni nel tempo del tracciato SPE in un soggetto vaccinato
Nonostante ciò le lievi alterazioni del tracciato osservabili non sono comparabili con quelle tipiche dei soggetti infetti o malati di
ponte β-γ).27
IFAT Leishmania
I risultati delle sieropositività dei soggetti del Gruppo 1 sono illustrati nell’istogramma che segue:
Esempio di modificazioni nel tempo del tracciato SPE in un soggetto vaccinato
Nonostante ciò le lievi alterazioni del tracciato osservabili non sono comparabili con quelle tipiche dei soggetti infetti o malati di Leishmaniosi (gammopatia policlonale e/o
I risultati delle sieropositività dei soggetti del Gruppo 1 sono illustrati nell’istogramma
84
Esempio di modificazioni nel tempo del tracciato SPE in un soggetto vaccinato
Nonostante ciò le lievi alterazioni del tracciato osservabili non sono comparabili con Leishmaniosi (gammopatia policlonale e/o
85
Grafico 12 – Risultati IFAT Leishmania infantum Gruppo 1
Dall’analisi dei dati delle sieropositività del Gruppo 1 emerge che:
- T0: 6/6 soggetti (100%) sono risultati negativi;
- T4: 4/6 soggetti (66,7%) sono risultati negativi; 1/6 soggetti (16,65%) è risultato sieropositivo con titolo 1:40; 1/6 soggetti (16,65%) non è stato esaminato;
- T5: 3/6 soggetti (50%) sono risultati negativi; 2/6 soggetti (33,3%) sono risultati sieropositivi con titolo 1:40; 1/6 soggetti (16,7%) non è stato esaminato;
- T6: 4/6 soggetti (66,7%) sono risultati negativi; 2/6 soggetti (33,3%) sono risultati sieropositivi con titolo 1:40.
L’andamento delle sieropositività rilevato in questo gruppo di soggetti è in aumento tra T4 e T5 e successivamente costante in T5 e T6. La prevalenza di positività è del 22,7% (5/22 campioni esaminati) ma, in ragione dei titoli rilevati (1:80 e 1:40), possono considerarsi non significative da un punto di vista clinico, poiché lievi.
I risultati delle sieropositività dei soggetti del Gruppo 2 sono illustrati nell’istogramma che segue: 6 4 3 4 2 2 1 1 1 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% T0 T4 T5 T6 Non esaminati 1/80 1/40 Negativi
86
Grafico 13 – Risultati IFAT Leishmania infantum Gruppo 2
Dall’analisi dei dati delle sieropositività del Gruppo 2 emerge che:
- T0: 12/12 soggetti (100%) sono risultati sieronegativi;
- T1: 7/12 soggetti (58,4%) sono risultati negativi, 1/12 soggetti (8,3%) è risultato sieropositivo con titolo 1:80; 1/12 soggetti (8,3%) è risultato sieropositivo con titolo 1:320, 3/12 soggetti (25%) non sono stati esaminati;
- T2: 9/12 soggetti (75%) sono risultati negativi, 1/12 soggetti (8,34%) è risultato sieropositivo con titolo 1:40, 1/12 soggetti (8,33%) è risultato sieropositivo con titolo 1:80, 1/12 soggetti (8,33%) è risultato sieropositivo con titolo 1:320;
- T4: 10/12 soggetti (83,4%) sono risultati sieronegativi, 1/12 soggetti (8,3%) è risultato sieropositivo con titolo 1:40, 1/12 soggetti (8,3%) è risultato sieropositivo con titolo 1/80;
- T5: 9/12 soggetti (75%) sono risultati sieronegativi, 2/12 soggetti (16,7%) sono risultati sieropositivi con titolo 1:40, 1/12 soggetti (8,3%) non è stato esaminato.
L’andamento delle sieropositività rilevato in questo gruppo di soggetti è in aumento tra T1 e T2, in diminuzione tra T2 e T4 e successivamente costante tra T4 e T5.
12 7 9 10 9 1 1 2 1 1 1 1 1 3 1 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% T0 T1 T2 T4 T5 Non esaminati 1/320 1/80 1/40 Negativi
87
La prevalenza di sieropositività è del 16,1% (9/56 campioni esaminati). Ad eccezione di due casi di sieropositività con titolo 1:320 nei tempi T1 e T2, i titoli presentati sono lievi (1:40 e 1:80) e le positività possono considerarsi non significative.
I risultati delle sieropositività dei soggetti del Gruppo 3 sono illustrati nell’istogramma che segue:
Grafico 14 – Risultati IFAT Leishmania infantum Gruppo 3
Dall’analisi dei dati delle sieropositività del Gruppo 3 emerge che:
- T0: 9/9 soggetti (100%) sono risultati sieronegativi;
- T1: 2/9 soggetti (22,2%) sono risultati sieronegativi, 2/9 soggetti (22,2%) sono risultati sieropositivi con titolo 1:80, 5/9 soggetti (55,6%) sono risultati
sieropositivi con titolo di 1:160;
- T2: 1/9 soggetti è risultato sieronegativo (11,1%), 1/9 soggetti (11,1%) è risultato sieropositivo con titolo 1:40, 3/9 soggetti (33,35%) sono risultati sieropositivi con titolo 1:80, 3/9 soggetti (33,35%) sono risultati sieropositivi con titolo 1:160, 1/9 soggetti (11,1%) è risultato sieropositivo con titolo 1:320;
9 2 1 3 1 3 2 3 1 5 3 1 2 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% T0 T1 T2 T3 Non esaminati 1/320 1/160 1/80 1/40 Negativi
88
- T3: 3/9 soggetti (33,3%) sono risultati sieronegativi, 3/9 soggetti (33,3%) sono risultati sieropositivi con titolo 1:40, 1/9 soggetti (11,1%) è risultato
sieropositivo con titolo 1:80, 2/9 soggetti (22,3%) non sono stati esaminati.
L’andamento delle sieropositività del Gruppo 3 è in aumento dal T1 al T2, per poi
diminuire al T3. La prevalenza di sieropositività è del 55,9% (19/34 campioni esaminati).
In questo gruppo di soggetti si osserva un’elevata prevalenza di sieropositività ad alto titolo (26,5%; 9/34 campioni esaminati). I titoli 1:160 e 1:320, sebbene elevati, possono essere riconducibili alla immunità post-vaccinazione.
In tutti i soggetti dei tre Gruppi è stato ripetuto il test Speed Leish K™ ai tempi T3, T4, T5 e T6 ed è risultato sempre negativo. (Figura 8)
89
I risultati ottenuti evidenziano che in seguito alla vaccinazione il titolo IFAT si positivizza nel 42,9 % (9/21) dei casi al tempo T1, nel 52,4% (11/21) dei casi al tempo T2, nel 44,4% (4/9) dei casi al tempo T3, nel 16,7% (3/18) dei casi al tempo T4, nel 22,2% (4/18) dei casi al T5 e nel 33,3% (2/6) dei casi al T6. Pertanto, data l’elevata prevalenza di sieropositività a vario titolo, permane la difficoltà di differenziare i soggetti vaccinati e quelli infetti sulla base di questo test.
Si suggerisce in caso di positività IFAT in cani vaccinati l’utilizzo di Speed Leish K™, test rapido immunocromatografico qualitativo diretto a valutare anticorpi diretti contro proteine di Leishmania infantum diverse dalle “proteine escrete-secrete” o ESP contenute nel vaccino.40
Tuttavia uno studio recente41 ha dimostrato che tale test ha una sensibilità inferiore rispetto alle altre metodiche sierologiche quantitative (IFAT e ELISA) e che l’utilizzo come test di screening prima della somministrazione del vaccino CaniLeish® non è appropriato perché potrebbe portare alla vaccinazione di soggetti sieropositivi (infetti o malati) risultati falsi negativi.
In ogni caso la leishmaniosi è una patologia complessa, la cui conferma diagnostica e la successiva stadiazione necessitano di valutazioni clinico-patologiche e parassitologico- molecolari, oltre che sierologiche.27
90
3 - CONCLUSIONI
Questo lavoro ha permesso di descrivere lo stato dell’arte della medicina trasfusionale del cane in Italia. La trasfusione è una misura terapeutica salvavita e l’utilizzo dei prodotti trasfusionali è sempre più diffuso nella pratica veterinaria. Tuttavia ad essa sono correlati dei rischi tra cui l’insorgenza di reazioni trasfusionali e la trasmissione di malattie infettive. Di conseguenza, al fine di tutelare la salute dei donatori e dei riceventi, sono state istituite le banche del sangue animale.
Tramite il confronto tra il CTV di Pisa e il CTV di Madrid sono stati analizzati gli aspetti gestionali delle due strutture, dalla selezione e controllo dei cani donatori alle modalità di prelievo e processazione del sangue. Inoltre, sono stati illustrati gli aspetti regolatori nei due paesi. A tal proposito è emerso che l’Italia è l’unico Paese europeo ad avere una normativa specifica che uniforma le procedure della pratica trasfusionale veterinaria. Pur necessitando di aggiornamenti per potersi adattare alle nuove situazioni medico- veterinarie ed epidemiologiche, la Linea Guida si propone come modello per l’emanazione di una normativa a livello europeo.
Particolare attenzione è stata posta sulla prevenzione e il controllo delle malattie trasmesse da vettori nei soggetti donatori. In particolare è stato valutato l’utilizzo del vaccino per la leishmaniosi (CaniLeish®) come ulteriore mezzo di profilassi in 27 cani donatori del CTV di Pisa. L’esito di tale procedura biologica è stato positivo perché non si sono verificate reazioni avverse locali o generali né alterazioni emato-biochimiche significative da un punto di vista clinico. Le lievi alterazioni, significative dal punto di vista statistico, riscontrate a carico di alcune frazioni proteiche, così come l’aumento dei titoli anticorpali osservato in 15/27 soggetti (55,6%) e in 33/112 campioni complessivamente esaminati (29,5%), sono molto probabilmente imputabili alla lieve risposta infiammatoria e allo sviluppo di immunità post-vaccinali.
91
BIBLIOGRAFIA
1. Cotter, S. (1991). History of transfusion medicine. Advances in Veterinary
Science and Comparative Medicine, 36, 1–8.
2. Hosgood, G. (1990). Blood transfusion: a historical review. Journal of the
American Veterinary Medical Association, 197(8), 998–1000.
3. Wardrop, K. J. (2007). New red blood cell antigens in dogs and cats--a welcome
discovery. Journal of Veterinary Internal Medicine, 21(2), 205–6.
4. Tocci, L. J. (2010). Transfusion medicine in small animal practice. The
Veterinary Clinics of North America. Small Animal Practice, 40(3), 485–94.
5. Wardrop K.J. (2007). Transfusion Medicine. In Saunders (Ed.) Handbook of small
animal practice (pp. 707-713)
6. Carli E., Gerou-Ferriani, M. (2013). Trasfusione sanguigna nella pratica
veterinaria. In EV (Ed.), Manuale di ematologia veterinaria e medicina
trasfusionale (pp. 29–39).
7. Abrams-Ogg A. (2004). Pratica emotrasfusionale. In UTET (Ed.), Ematologia e
medicina trasfusionale del cane e del gatto (pp. 271-316).
8. Kisielewicz, C., & Self, I. a. (2014). Canine and feline blood transfusions:
controversies and recent advances in administration practices. Veterinary
Anaesthesia and Analgesia, 1–10.
9. Blois, S. L., Richardson, D. M., & Abrams-Ogg, A. C. G. (2013). Comparison of a
gel column blood typing method and a point-of-care cartridge for dog
erythrocyte antigen 1.1. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care (San
Antonio, Tex. : 2001), 23(3), 340–343.
10.Lubas G. (2011). Gruppi sanguigni e medicina trasfusionale. In Il Campano
(Ed.) Appunti di ematologia clinica veterinaria (pp.247-341)
11.Ministero della Salute. (2007). Linea guida relativa all’esercizio delle attività
sanitarie riguardanti la medicina trasfusionale in campo veterinario. Gazzetta
ufficiale del 7 febbraio 2008
12.Chiaramonte, D. (2004). Blood-component therapy: selection, administration
92
13.Silvestrini, P., Piviani, M., Vrabelova, D., et al. (2009). Canine packed red blood
cell transfusions in Spain. Comparative Clinical Pathology, 20(3), 195–199.
14.Giger, U. (2009). Transfusion Medicine. In Elsevier (Ed.) Small animal Critical
Care Medicine (pp. 281-286)
15.Biagi G., Nannipieri S., Marzotto G., et al. (2009). Medicina Trasfusionale in
Ambito Veterinario. La Settimana Veterinaria - Fascicolo 636, 5,6,8.
16.Masucci M., Lombardo G., Passantino A., et al. (2011) Revisione della Linea
Guida del Ministero della Salute riguardante la medicina trasfusionale in campo veterinario sancita dall’accordo Stato-Regioni (20/12/2007). Bollettino
AIVPA – Anno 2011/2012
17.Penocchio G. (26/11/2013). Quesito FNOVI: Emoderivati ed emocomponenti –
richiesta di chiarimenti in merito all’applicazione del D.Lgs. 193/2006 Prot. N.
5071/2013/F/er
18.Ferri G. (16/12/2013) Nota Ministero della Salute: Emoderivati ed
emocomponenti – richiesta di chiarimenti in merito all’applicazione del D.Lgs.
193/2006 Prot. N. 0024005-16/12/2013-DGSAF-COD_UO-P
19.Wardrop, K. J., Reine, N., Birkenheuer, A., et al. (2005). ACVIM Consensus
Statement - Canine and Feline Blood Donor Screening for Infectious Disease.
Journal of Veterinary Internal Medicine, 19, 135–142.
20. Reine, N. J. (2004). Infection and blood transfusion: a guide to donor
screening. Clinical Techniques in Small Animal Practice, 19(2), 68–74.
21.Otranto, D., & Dantas-Torres, F. (2010). Canine and feline vector-borne diseases
in Italy: current situation and perspectives. Parasites & Vectors, 3, 2.
22.Otranto, D., Testini, G., Dantas-Torres, F., et al. (2010). Diagnosis of canine
vector-borne diseases in young dogs: a longitudinal study. Journal of Clinical
Microbiology, 48(9), 3316–24.
23.De Freitas, E., Melo, M. N., da Costa-Val, A. P., et al. (2006). Transmission of
Leishmania infantum via blood transfusion in dogs: potential for infection and importance of clinical factors. Veterinary Parasitology, 137(1-2), 159–67.
24. Tabar, M. D., Roura, X., Francino, O., et al. (2008). Detection of Leishmania
infantum by real-time PCR in a canine blood bank. The Journal of Small
93
25. Baneth, G., Bourdeau, P., Bourdoiseau, G., et al. CVBD World Forum. (2012).
Vector-borne diseases--constant challenge for practicing veterinarians:
recommendations from the CVBD World Forum. Parasites & Vectors, 5(1), 55.
26.Otranto, D., & Dantas-Torres, F. (2013). The prevention of canine leishmaniasis
and its impact on public health. Trends in Parasitology, 29(7), 339–45.
27.Solano-Gallego, L., Miró, G., Koutinas, A., et al. (2011). LeishVet guidelines for
the practical management of canine leishmaniosis. Parasites & Vectors, 4(1),
86.
28.Maroli, M., Gradoni, L., Oliva, G., et al. (2010). Guidelines for prevention of
leishmaniasis in dogs. Journal of the American Veterinary Medical Association,
236(11), 1200–6.
29.Paltrinieri, S., Solano-Gallego, L., Fondati, A., et al. (2010). Guidelines for
diagnosis and clinical classification of leishmaniasis in dogs. Journal of the
American Veterinary Medical Association, 236(11), 1184–91.
30.Virbac. (2011). CaniLeish®: un nuovo strumento decisivo per la prevenzione
della leishmaniosi canina. CaniLeish® – Monografia di prodotto (pp. 19-26).
31.Perlado Chamizo M.R., Cano Rábano M.J., Viñals Flórez L.M., et al. (2014).
Determinación de los grupo sanguíneo dog erythrocyte antigen (D.E.A.) 1.1 y 1.2 en Galgo Español. I Congreso Murciano sobre nuevas tecnologías en clínica
de animales de compañía.
32.Mesa-Sanchez I., Ruiz de Gopegui-Fernández R., Granados-Machuca M.M. et al.
(2014). Prevalence of dog erythrocyte antigen 1.1 in galgos (Spanish
greyhounds). Veterinary Record, 174(14).
33.Viñals-Flórez L.M., Perlado Chamizo M.R., Ruano Barmeda R. (2010).
Seroprevalencia de hemoparasitos en una población de Galgo Español para su uso como donantes de sangre. Southern European Veterinary Conference,
Barcelona, 2010.
34.Virbac (2010). Field safety study in dogs from 4 months of age. CaniLeish®
European Registration Dossier (study F-130.010000-58065).
35.Virbac (2010). Field study in dogs from 6 months of age. CaniLeish® European
Registration Dossier (study F-136.010000-60004).
36.www.ema.europa.eu Parola chiave: CaniLeish. Accesso il 21/08/2014.
37.Virbac (2010). Safety of an extra dose of CaniLeish® vaccine. CaniLeish®
94
38.Virbac (2010). Safety of an overdose of CaniLeish® vaccine. CaniLeish®
European Registration Dossier (study F-136.010000-58061).
39.Stockham S.L., Scott M.A. (2008). Proteins. In Blackwell Publishing (Ed.),
Fundamentals of Veterinary Clinical Pathology. Second edition (pp. 370-413).
40.Virbac. (2011). CaniLeish® nell’impiego quotidiano. CaniLeish® – Monografia
di prodotto (pp. 67-72).
41. Solano-Gallego, L., Villanueva-Saz, S., Carbonell, M., et al. (2014). Serological
diagnosis of canine leishmaniosis: comparison of three commercial ELISA tests (Leiscan, ID Screen and Leishmania 96), a rapid test (Speed Leish K) and an in-house IFAT. Parasites & Vectors, 7(1), 111.
95
RINGRAZIAMENTI
Ringrazio per la stesura di questo lavoro il Professor Lubas, la Dottoressa Gavazza e coloro (cani donatori compresi) che hanno contribuito alla sua realizzazione.
Ringrazio per gli anni di Università tutte le persone che mi hanno insegnato qualcosa, i miei compagni di corso e di tesi.
Muchísimas gracias/moltes gràcies a todos los españoles/catalanes encontrados.