RAZZA NUMERO MASCHI FEMMINE

Meticcio 31 16 15 Boxer 20 7 13 Golden Retriever 6 4 2 Pastore Tedesco 5 1 4 Border Collie 4 1 3 Labrador 3 2 1 Pitt Bull 3 1 2 Setter inglese 2 2 0 Rottweiler 2 0 2 Dobermann 2 0 2 Dogo Argentino 2 0 2

67 Weimaraner 2 1 1 Dogue de Bordeaux 1 0 1 Terranova 1 0 1 Pastore Maremmano 1 0 1 Schnautzer 1 0 1 Bracco italiano 1 1 0

Bovaro del Bernese 1 1 0

Corso 1 0 1

I candidati donatori per il suddetto periodo sono stati in totale 115.

Ventiquattro soggetti (20,9%) sono stati esclusi perché non rispondenti a tutti i criteri di selezione, che è avvenuta nel rispetto dei requisiti elencati nella Linea Guida italiana, esposti precedentemente nella sezione “MATERIALI E METODI”.

I proprietari dei cani hanno inizialmente aderito su base volontaria perché mossi da motivazioni altruistiche o perché loro stessi donatori. Nel tempo si è instaurata una sorta di fidelizzazione, in modo simile a quanto avviene nella medicina umana. In cambio, alcune prestazioni del Centro Trasfusionale sono gratuite, come ad esempio le visite cliniche, gli screening per le malattie trasmissibili con la trasfusione e le analisi emato-biochimiche.

Il gruppo di cani potenziali donatori del Centro de Transfusión Veterinario di Madrid si compone di circa 400 esemplari di razza Galgo español ospitati in un canile. Non è nota la prevalenza del sesso né la durata della permanenza dei donatori nel gruppo, la cui composizione è variabile in relazione alle adozioni e allo stato di salute. Spesso i soggetti donano una sola volta nella vita.

I cani di razza Galgo español sono molto popolari in Spagna perché utilizzati per la corsa e per la caccia. La loro importanza è aumentata negli ultimi anni in seguito ai frequenti abbandoni dovuti alla non idoneità all’attività agonistica o venatoria. In ragione delle caratteristiche fisiche (taglia grande, vene giugulari facilmente accessibili, carattere

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docile, elevato ematocrito) l’impiego come cani donatori nella pratica clinica è molto diffuso.32

Alla prima visita e ad ogni donazione presso il CTV di Pisa, per confermare lo status di donatore, vengono eseguite una visita clinica e delle analisi ematologiche, biochimiche e sierologiche, con pannelli diversi a seconda che il sangue sia commercializzato o meno, conformemente alla Linea Guida.

La tipizzazione del gruppo sanguigno viene effettuata solo durante la prima visita, in accordo con quanto pubblicato da alcuni autori,16 e non ripetendola ad ogni donazione, come indicato nella Linea Guida.

La prevalenza del gruppo DEA 1.1 negativo nel CTV di Pisa è del 93,4 %, i soggetti DEA 1.1 positivi (6,6%) fanno anch’essi parte del gruppo donatori se particolarmente docili, ma i concentrati di eritrociti ottenuti da questi soggetti devono essere destinati a riceventi dello stesso gruppo sanguigno per evitare l’insorgenza di reazioni emolitiche post-trasfusionali. Il plasma, invece, può essere somministrato a qualsiasi soggetto.

Presso il CTV di Madrid non vengono effettuati esami di laboratorio al fine di valutare lo stato di salute dei donatori, ma solo un rapido esame fisico generale per selezionare i soggetti clinicamente sani e pertanto idonei. Il gruppo sanguigno, a differenza di Pisa, viene determinato successivamente alla donazione con una tecnica mista precedentemente indicata, non validata e non riportata nella letteratura scientifica. Nonostante ciò la metodica risulta avere una certa efficacia poiché la prevalenza di donatori Galgo español di gruppo DEA 1.1 negativo rilevata nel CTV di Madrid è del 59,39%,31 pressoché simile a quella riportata in uno studio recentemente effettuato in Spagna su cani della stessa razza (51,7%).32 Anche in questa banca del sangue i soggetti DEA 1.1 positivi sono inclusi fra i donatori.

Per quanto riguarda la tracciabilità e la registrazione dei dati nei due centri trasfusionali, presso il CTV di Pisa i dati del donatore e del proprietario sono memorizzati in uno schedario elettronico. Ad ogni soggetto è assegnato un numero identificativo interno al centro, nonché un numero di cartella clinica, nella quale sono annotate tutte le informazioni riguardanti lo stato di salute e gli esiti degli esami di laboratorio. Ad ogni donazione le sacche sono identificate con un codice univoco,

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inoltre viene conservata in congelatore un’aliquota di sangue in anticoagulante EDTA da poter utilizzare in caso si verificassero delle reazioni trasfusionali. La gestione è quindi conforme a quanto indicato nella Linea Guida e soddisfa a pieno i requisiti di tracciabilità.

Anche presso il CTV di Madrid i donatori sono registrati su un archivio elettronico, ma i dati riportati si limitano al numero identificativo assegnato loro dal canile, al sesso, al gruppo sanguigno e alla data della donazione. Pertanto non è presente la storia clinica dell’animale.

Screening delle malattie trasmissibili con la trasfusione

Nel periodo febbraio 2010 – luglio 2014 sono state effettuate presso il Centro Trasfusionale Veterinario di Pisa 595 analisi sierologiche con la metodica IFAT per effettuare lo screening di alcune CVBDs (Canine Vector Borne Diseases) sui cani donatori.

I risultati della sieroprevalenza del CTV di Pisa sono riassunti in tabella:

CVBDs NUMERO (%) Leishmania infantum (n=255) Negativo 206 (80,8) 1/40 24 (9,4) 1/80 13 (5) 1/160 9 (3,5) 1/320 3 (1,2) Ehrlichia canis (n=185) Negativo 142 (76,8) 1/20 1 (0,5) 1/40 17 (9,2) 1/80 25 (13,5)

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La scelta di testare le suddette CVBDs è in relazione alle indicazioni della Linea Guida ed alla situazione epidemiologica. Il protocollo adottato prevede una frequenza semestrale degli screening con ripetizione delle analisi sierologiche ogni qualvolta l’anamnesi indichi un viaggio in una zona endemica o si evidenzi una sintomatologia potenzialmente associabile a una di queste patologie.

Lo screening per la rickettsiosi non è stato più eseguito dal 2011 poiché, essendo una patologia che si manifesta sempre in forma acuta, non è stato più ritenuto necessario. È stato sostituito, in accordo con la letteratura, con l’esame sierologico IFAT per l’anaplasmosi, patologia molto frequente, non considerata nella Linea Guida.

Per quanto riguarda la babesiosi, è effettuata la ricerca microscopica nello striscio ematico, ma nel CTV di Pisa non sono mai state rilevate positività in merito.

Lo screening per la dirofilariosi non è svolto, conformemente a quanto indicato nella Linea Guida, perché tutti i cani donatori seguono una profilassi regolare.

Il protocollo di screening adottato dal CTV di Madrid prevede l’esecuzione di test rapidi ambulatoriali per ehrlichiosi, anaplasmosi, dirofilariosi, borreliosi e leishmaniosi, da effettuare all’ingresso dei soggetti nel canile. Il test per la leishmaniosi è ripetuto con frequenza semestrale. Rickettsia rickettsi (n=13) Negativo 7 (53,8) 1/32 1 (7,7) 1/64 2 (15,4) 1/128 3 (23,1) Anaplasma phagocytophilum (n=142) Negativo 124 (87,3) 1/40 6 (4,2) 1/80 12 (8,5)

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La sieroprevalenza del CTV di Madrid è riportata in tabella:33

CVBDs PREVALENZA

Leishmania infantum 7,48% Ehrlichia canis 4,81% Anaplasma phagocytophilum 4,81% Dirophilaria immitis 1,60%

L’esclusione dei soggetti donatori sieropositivi è oggetto di molte discussioni. La Linea Guida raccomanda di escludere permanentemente i soggetti che hanno contratto la babesiosi e temporaneamente quelli sieropositivi per leishmaniosi e/o ehrlichiosi. Altri autori16 consigliano di escludere permanentemente i soggetti sieropositivi per leishmaniosi e/o ehrlichiosi e di testare addizionalmente con PCR i soggetti risultati sieronegativi.

Presso il CTV di Pisa, nel caso di sieropositività a basso titolo, i soggetti non sono esclusi immediatamente dal gruppo donatori. Infatti, la sieropositività indica un avvenuto contatto con il patogeno a cui può conseguire una risposta immunitaria specifica o l’inizio di uno stato di malattia. Inoltre potrebbero verificarsi false positività per mancanza di specificità del test. Di conseguenza il test IFAT è ripetuto a distanza di tempo e il risultato è valutato congiuntamente alla presenza di segni clinici, di alterazioni dell’elettroforesi delle sieroproteine e dell’esito di un eventuale esame PCR sul sangue. In assenza di segni clinici e di alterazioni di laboratorio e con risultato negativo della PCR il soggetto è ritenuto ancora idoneo alla donazione.

Presso il CTV di Madrid i soggetti sieropositivi per almeno un patogeno sono esclusi permanentemente dalla donazione e tale scelta è giustificata dall’elevato numero di candidati donatori a disposizione.

Modalità di prelievo

Nel Centro Trasfusionale di Pisa il prelievo di sangue viene eseguito negli ambulatori dell’Ospedale Didattico Veterinario. La donazione, in accordo con quanto indicato nella

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Linea Guida, viene effettuata dalla vena giugulare con il soggetto posto in decubito laterale e contenuto manualmente per evitare che si muova o si alzi durante la procedura. Il sangue è raccolto in quantità di 350 mL +/- 10% in una sacca singola contenente la soluzione anticoagulante-conservante CPDA.

Per il Centro de Transfusión di Madrid il prelievo viene effettuato nei locali del canile situato a Toledo, più precisamente nei box di gruppo occupati dai cani ospitati e mediante attrezzatura portata dal veterinario. Durante la donazione i soggetti sono in posizione seduta o in stazione quadrupedale e non hanno necessità di contenimento. Il sangue è raccolto in quantità di circa 380 mL in sacche triple contenenti la soluzione CPD e il nutriente per gli eritrociti SAG-mannitolo.

Confrontando per i due CTV gli ambienti in cui si svolgono le donazioni, si osserva che i locali dell’Ospedale Didattico Veterinario di Pisa presentano un contesto di elevato livello igienico, a differenza dei box del canile di Toledo. Nonostante la situazione spagnola determini un potenziale maggior rischio di contaminazione batterica del sangue, non risulta che fino ad ora si siano verificate alterazioni microbiologiche dei prodotti trasfusionali riconducibili alle operazioni di prelievo.

In una situazione ideale sarebbe utile avere a disposizione dei locali riservati alla donazione del sangue, in cui possa essere effettuato il prelievo e in cui sia presente l’attrezzatura necessaria alla donazione nonché alla processazione del sangue. Da un punto di vista normativo l’accordo sancito dalla Conferenza Stato-Regioni il 26 novembre 2003 tra il Ministero della Salute, le Regioni e le Province Autonome di Trento e Bolzano per la definizione dei requisiti strutturali, tecnologici ed organizzativi minimi richiesti per l’erogazione delle prestazioni veterinarie da parte di strutture pubbliche e private (Repertorio Atti n. 1868 del 26 novembre 2003) non definisce una struttura trasfusionale veterinaria ma, poiché la pratica trasfusionale nella medicina veterinaria è in aumento, sarebbe auspicabile una sua modifica in tal senso.15

Per quanto riguarda il contenimento degli animali durante la donazione si rileva che in entrambi i centri trasfusionali non si rende necessaria la sedazione dei soggetti, come suggerito da alcuni autori.16 I donatori dei due CTV sono selezionati in primis per la docilità e, in particolare, quelli del Centro de Transfusión di Madrid confermano tali

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caratteristiche, peculiari della razza Galgo español, risultando sotto questo aspetto particolarmente idonei alla donazione di sangue. Inoltre, essendo la sedazione una procedura invasiva, nel caso del Centro Trasfusionale di Pisa potrebbe influenzare negativamente l’adesione volontaria al programma.

Preparazione dei prodotti trasfusionali

Per il Centro Trasfusionale di Pisa il sangue è processato nel laboratorio dell’Ospedale Didattico Veterinario entro un’ora dal prelievo. Successivamente alla centrifugazione il plasma è separato dal PRBC (Packed Red Blood Cells). Poiché il sangue è raccolto in una sacca singola è necessaria una sacca di trasferimento per separare i due prodotti e questo determina l’adozione di un sistema aperto che potrebbe causarne la contaminazione batterica. Nonostante ciò le procedure adottate non hanno finora causato alterazioni ad esse riconducibili. In ragione del tipo di sacca e della soluzione anticoagulante-conservante contenuta (CPDA), la durata di conservazione del PRBC è pari a 35 giorni a 4-6°C, in accordo con quanto riportato in letteratura.7

Per il Centro de Transfusión il sangue viene raccolto a Toledo e processato entro 6 ore dal prelievo nel laboratorio situato a Madrid, dove è trasportato a temperatura di refrigerazione. Il trasporto non sembra determinare emolisi. Poiché sono utilizzate sacche triple, il sistema è chiuso e perciò privo di contaminazioni. Il SAG mannitolo, addizionato al PRBC, consente di aumentarne la durata di conservazione da 35 a 42 giorni.

In entrambi i centri trasfusionali non si utilizza di routine il sangue intero, ma lo si processa al fine di ottenere gli emocomponenti PRBC e FFP (Fresh Frozen Plasma). La somministrazione di questi prodotti trasfusionali in Spagna è permessa perché non regolamentata da specifica normativa. In Italia potenzialmente non è consentita perché non inclusa nel campo di applicazione della Linea Guida. Tuttavia nel Centro Trasfusionale di Pisa, che è stato istituito precedentemente all’emanazione della Linea Guida, sin dall’inizio, in accordo con quanto riportato nella letteratura scientifica, sono stati utilizzati gli emocomponenti e non il sangue intero. Inoltre, in attesa di una revisione della normativa in tal senso, è stata presentata richiesta al Comitato Etico per

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svolgere uno studio clinico sui prodotti trasfusionali e pertanto la loro somministrazione in caso di necessità è autorizzata.

Aspetti normativi

Per quanto riguarda gli aspetti regolatori, l’Italia è l’unico Paese europeo in cui è stata emanata una specifica normativa in materia di medicina trasfusionale veterinaria, la “Linea Guida relativa all’esercizio delle attività sanitarie riguardanti la medicina trasfusionale in campo veterinario” (GU, 7 febbraio 2008).11

In Spagna al momento non è stato emanato alcun provvedimento legislativo che regoli la materia. Pertanto resta a discrezione del medico veterinario, in base alla letteratura scientifica, individuare le modalità di selezione dei donatori, di screening delle malattie trasmissibili con la donazione, del prelievo del sangue e della preparazione dei prodotti trasfusionali.

È stato evidenziato da alcuni autori,16 nonché dalla FNOVI (Federazione Nazionale Ordini Veterinari Italiani),17 che la Linea Guida andrebbe sottoposta periodicamente a revisione per potersi adattare alle nuove situazioni medico-veterinarie ed epidemiologiche. In particolare, la restrizione del campo di applicazione al sangue intero rappresenta un grosso limite alla pratica trasfusionale veterinaria. L’utilizzo di emocomponenti, ottenuti per centrifugazione e successiva separazione, è preferito a quello del sangue intero in quanto non espone il paziente a componenti non necessari a trattare la patologia. A differenza degli emoderivati, risultato di processi di lavorazione industriale, gli emocomponenti sono prodotti più facilmente ottenibili. Nonostante ciò attualmente entrambe le tipologie di prodotti trasfusionali sono regolate dalla legislazione sul farmaco veterinario (D.Lgs. n. 193/2006) e il loro utilizzo è vincolato al possesso dell’autorizzazione all’immissione in commercio.18

Sicuramente l’emanazione di una normativa specifica in materia da parte del Ministero della Salute è un punto di merito, che indica l’interesse dello Stato per l’argomento. La Linea Guida è, infatti, volta a tutelare la salute dei donatori e dei riceventi, uniformando la pratica trasfusionale in Italia. È innegabile, però, che la presenza di tale normativa limita fortemente la diffusione delle banche del sangue nel nostro Paese, poiché la loro

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gestione richiede un impegno economico notevole che comprende, oltre alle previste spese per attrezzature e materiali, i controlli analitici periodici dei soggetti donatori.

2.2 VACCINAZIONE DONATORI CON CANILEISH®

Aspetti clinici

Nel periodo marzo 2013 – luglio 2014 sono state somministrate a 27 cani donatori del Centro Trasfusionale Veterinario dell’Università di Pisa un totale di 87 dosi di vaccino CaniLeish®.