Acque minerali naturali

3.2.1 Campionamento

Per quanto riguarda il campionamento delle acque minerali naturali è possibile procedere come detto al paragrafo 3.1.1 ma seguendo alcune differenze da applicare per quanto riguarda le acque di sorgente. In questo caso vengono utilizzare bottiglie sterili monouso da 1000 ml senza tiosolfato di sodio, verranno raccolti 6 L di acqua, che verranno successivamente rimescolati in laboratorio all’interno di un recipiente sterile, non bisogna procedere alla misurazione della concentrazione di cloro dal momento che le acque minerali naturali per definizione non possono essere clorate.

Per quanto riguarda le acque minerali naturali imbottigliate non sono previste particolari osservazioni legate al prelievo dei campioni, ma occorre accertarsi dell’integrità delle bottiglie, del corretto confezionamento e delle condizioni di stoccaggio oltre che dei dati relativi al numero di lotto, data di scadenza, tipologia di bottiglia, ed altre informazioni riportate in etichetta, compilando il “Verbale di campionamento” (Mod. 5.10g/01).

Il campionamento dell’acqua ha lo scopo di determinare i seguenti parametri: Legionella spp., carica microbica a 22°C e a 37°C, ricerca di coliformi totali ed E. coli, enterococchi intestinali e streptococchi fecali, P. aeruginosa, Staphylococcus aureus e anaerobi sporigeni solfito-riduttori. Si utilizzano 1 ml per la carica microbica (CMT) a 22°C, 1 ml per la carica microbica a 36°C, 1 L per la ricerca di Legionella spp., 500 ml per la ricerca di coliformi

totali ed E. coli, 500 ml per la ricerca di enterococchi intestinali e streptococchi fecali, 250 ml per la ricerca di Pseudomonas aeruginosa, 50 ml per la ricerca di anaerobi sporigeni solfito riduttori e 3 L per la ricerca di Helicobacter pylori.

3.2.2. Analisi eseguite

3.2.2.1 Carica microbica a 22/36 °C

La determinazione delle cariche microbiche totali a 22 e 36 °C vengono eseguite secondo le procedure sancite dalla normativa ISO 6222:1999 e D.M. 10/02/2015, per quanto riguarda le acque minerali naturali.

La procedura per i campioni di acqua minerale naturale è la medesima per quelle destinate al consumo umano ma va eseguita in duplicato secondo quanto previsto dal D.M. 10/02/2015.

3.2.2.2 Ricerca di coliformi totali e E. coli

La determinazione di batteri coliformi viene eseguita secondo le procedure sancite dalla norma ISO 9308-1:2014/Amd 1:2016 la procedura è analoga come visto prima per le acque destinate al consumo umano ma viene svolta su 250 ml del campione e accertata in due repliche ciascuna da 250 ml a 37 e 44,5 secondo quanto stabilito dal D.M 10/02/2015. 3.2.2.3 Ricerca di enterococchi intestinali e streptococchi fecali

La ricerca di enterococchi intestinali viene eseguita secondo le procedure sancite dalle normative UNI EN ISO 7899-2:2003. L’analisi viene seguita su 250 ml come stabilito dal D.M. 1/02/2015.

3.2.2.4 Ricerca di P. aeruginosa

La ricerca di P. aeruginosa viene eseguita secondo le procedure sancite dalle normative UNI EN ISO 16266:2008 e l’analisi viene svolta su 250 ml come stabilito dal D.M 10/02/2015.

3.2.2.5 Ricerca di Staphylococcus aureus

La ricerca di Staphylococcus aureus viene eseguita viene eseguita secondo le procedure sancite dal D.M. 10/02/2015, per le acque minerali naturali.

Si filtrano 250 ml del campione sotto cappa biologica di classe 2A mediante l’attivazione del sistema filtrante e l’installazione di imbuti con filtri da 0,45 µm. Dopo la filtrazione la membrana viene adagiata sulla superficie del terreno Sale Mannite Agar. Le piastre vengono

incubate a 36 ±1 °C per 33/37 ore. Le colonie sospette (gialle) vengono trasferite su agar nutritivo e in brodo cuore-cervello per poi essere incubate a 36 ±1 °C per 22/26 ore. Le colonie cresciute vengono confermate osservando la produzione di catalasi stemperando, dall’agar nutritivo, una colonia su un vetrino con perossido di idrogeno al 3% per poi osservare la presenza di bollicine di gas. Ulteriori prove biochimiche che vengono eseguite riguardano il test della coagulasi legata, stemperando una colonia in plasma di coniglio con EDTA su un vetrino ed osservando la presenza di ammassi macroscopici entro 5-15 secondi. Per la determinazione della coagulasi libera 0,5 ml della brodocoltura cuore-cervello vengono messi a contatto con 0,5 ml di plasma EDTA e dopo un periodo di incubazione a 36 ±1 °C per 24 ore si osserva la presenza di un coagulo.

3.2.2.6 Ricerca spore di anaerobi solfito riduttori (clostridia)

La ricerca di spore di anaerobi solfito riduttori (clostridia) viene eseguita secondo le procedure stabilite dal D.M. del 10/02/2015.

Un’aliquota pari a 100 ml del campione sarà trasferita in una bottiglia sterile monouso termoresistente in modo da riscaldarlo in bath water a 75 ±5 °C per 15 minuti dal momento in cui l’acqua raggiunge la specifica temperatura (periodo di tempo sufficiente per distruggere le forme vegetative). Una volta raffreddato il campione viene processato sotto cappa biologica di classe 2A filtrando 50 ml del campione termo-inattivato mediante l’attivazione del sistema filtrante e l’installazione di imbuti con filtri da 0,2/0,45 µm; così facendo le spore vengono trattenute dal filtro. Dopo la filtrazione, operando sempre sotto cappa biologica, la membrana viene adagiata rivolta verso il basso sulla superficie di una piastra Petri sterile mediante l’ausilio di pinze sterili. Assicurarsi che non vi siano bolle di aria intrappolate sotto il filtro. Successivamente versare con attenzione 20 ml di terreno

sulphite polymyxin sulphadiazine (SPS) agar liquefatto, precedentemente riscaldati e poi

portati a circa 50 °C, sopra la membrana mentre la si tiene ancora con una pinza sterile (completa inclusione della membrana).

Dopo che lo strato di terreno si è solidificato incubare le piastre (in condizioni che garantiscono anaerobiosi) a 37 ±1 °C per 20 ±4 h e/o 44 ±4 h per poi osservare la presenza di colonie nere, ovvero contare il numero delle colonie medesime.

3.2.2.7 Ricerca Legionella spp.

Per la conta di Legionella spp. vengono utilizzati i procedimenti analitici conformità alla norma ISO 11731:2017 “Water quality - Enumeration of Legionella spp” come descritto nel paragrafo 3.1.2.5.

3.2.2.8 Analisi quantitativa molecolare in real-time PCR Legionella spp

L’analisi quantitativa molecolare in real-time PCR è stata eseguita come visto nel paragrafo 3.1.2.6 L’analisi è stata eseguita solo sui campioni con esito negativo alla ricerca di

Legionella spp.

3.2.2.9 Ricerca Helicobacter pylori

La ricerca di Helicobacter pylori è stata eseguita come visto nel paragrafo 3.1.2.7

3.2.2.10 Analisi qualitativa molecolare in real-time PCR Helicobacter pylori

L’analisi qualitativa molecolare in real-time PCR è stata eseguita come visto nel paragrafo 3.1.2. 8.

3.2.2.11 Rilevazione Temperatura, pH e conducibilità

I parametri Temperatura, pH e conducibilità sono stati rilevati come visto 3.1.2.9. la temperatura però non è stata misurata per i campioni di acqua minerale naturale imbottigliata.

3.2.3. Analisi dei dati

Per individuare i dati anomali, se presenti, è stato applicato in tutte le categorie in analisi il test di Huber e si è proceduto nel modo seguente113_:

1. a) Si calcola la mediana (Cm) dei conteggi Ci ordinati in senso crescente;

2. b) Si calcolano le differenze (Di) tra i singoli conteggi e la mediana (Cm), Di=Ci- Cm;

3. c) Si ordinano le differenze (Di), in valore assoluto, in senso crescente; 4. d) Si calcola la mediana (Dm) delle differenze.

5. e) Si confrontano le differenze Di rispetto a Dm applicando la relazione Di≤ 4,5 x Dm;

• Valore accettabile Di/Dm _{≤ 4,5;}

• Valore non accettabile Di/Dm≥ 4,5

I risultati ottenuti dalla la ricerca di Legionella spp. attraverso metodica colturale sono espressi in CFU/L e sono esposti secondo le “Linee guida per la prevenzione ed il controllo della legionellosi” facendo riferimento ai range:

• £100 CFU/L; • 101-1000 CFU/L; • 1001-10000 CFU/L • >10000 CFU/L;

I campioni i cui valori sono risultati essere £100 CFU/L sono stati sottoposti a ricerca quantitativa molecolare real-time PCR, e i valori espressi in GU/L.

I risultati ottenuti dalla ricerca quantitativa molecolare real-time PCR sono espressi come positivi e negativi, negativi per risultati pari a 0 GU/L e positivi per risultati >0 GU/L. I valori CFU/L e GU/L sono stati correlati prima con i valori di temperatura e poi con i valori della conducibilità, attraverso l’indice di correlazione di Pearson dove:

• correlazione positiva,

• se r non correlazione,

• se r correlazione inversa o correlazione negativa.

Inoltre, per la correlazione positiva (e analogamente per quella inversa): • 0 < r < 0,3 correlazione debole

• 0,3 < r < 0,7 correlazione moderata • r > 0,7 correlazione forte