Per sviluppare il lavoro di tesi la tipologia di acqua che abbiamo scelto di analizzare si è incentrata su acqua potabile e acqua minerale naturale. Per le potabili abbiamo scelto di analizzare sia acqua calda che fredda per poter effettuare le nostre ricerche sulla stessa tipologia ma erogata a diverse temperature. Infatti, la temperatura media rilevata per le acque calde è stata di 44° C invece per le fredde di 24°C; le minerali naturali sono invece state prelevate sia alla sorgente che da acque in bottiglia.
Abbiamo eseguito prima di tutto le analisi richieste dal D. Lgs n.31/2001 per le acque potabili e dal D.M. 10/01/15 per le acque minerali naturali, quindi ci siamo accertati che tutte le acque fossero conformi ai parametri che prevedono l’assenza di batteri coliformi,
Escherichia coli, enterococchi, streptococchi fecali, P. aeruginosa, Staphylococcus aureus,
spore di anaerobi solfito riduttori (clostridia) e il conteggio delle colonie a 22°C e 37°C. Tutte le analisi sono risultate essere conformi ai parametri richiesti dalle normative sopra riportate.
Le nostre analisi si sono poi incentrate su Legionella spp. che, nonostante la presenza di un documento stilato per il controllo e la prevenzione della legionellosi, ad oggi rimane forse il più ubiquitario tra i patogeni veicolati tramite l’acqua. Come già detto la temperatura in cui è possibile rilevare la sua presenza è compresa tra i 25 e 42°C. La sopravvivenza ad alte temperature e condizioni sfavorevoli (es. carenza di nutrienti, stress) è permessa dalla presenza di alghe ed amebe che forniscono nutrimento e protezione e dalle superfici che permettono la formazione di biofilm dove è nota la sua presenza.
Considerando che le acque analizzate avevano una temperatura compresa tra 9-51 °C, è stato possibile effettuare la ricerca di Legionella spp. a diverse temperature; inoltre, avendo a disposizione sia acque potabili che acque minerali naturali, è stata possibile la sua ricerca in diversi tipi di ambienti in cui potrebbe essere presente (come sorgenti, impianti idrici,
tubature domestiche, ecc.), proliferare e diffondere. Come riportato dall’Istituto Superiore di Sanità, il range di temperature per la crescita di Legionella spp è compreso tra 20 e 50 °C , infatti nei campioni di acqua potabile in cui la temperatura media rilevata è stata di 33°C abbiamo rilevato attraverso metodo colturale campioni con valori compresi tra 101- 1000 CFU/L e ³ 10000 CFU/L, carica microbica limite dove è indicata una disinfezione e una revisione della valutazione del rischio dell’impianto (“Linee guida per prevenzione ed il controllo della legionellosi”)47.
Questi risultati evidenziano che a temperature più alte è possibile rilevare una maggiore presenza del microrganismo in forma coltivabile: infatti dalla correlazione tra CFU/L e temperatura è possibile osservare r=0,25. La presenza di Legionella spp. negli stessi campioni di acqua potabile è stata anche confermata dalla ricerca molecolare quantitativa real-time PCR che ha rilevato la presenza di unità genomiche in tutti i campioni analizzati, con correlazione pari a r=0,20 tra GU/L e temperature.
Nelle acque minerali di sorgente i dati ottenuti mostrano un range di temperatura tra 10,7°C-36°C risultando nella maggior parte dei casi con valori £100 CFU/L: i risultati possono essere in parte spiegati dalla non ottimale temperatura per la crescita del microrganismo.
Dalla letteratura è noto che la Legionella spp. può essere internalizzata dalle amebe, è in grado di entrare in forma VBNC, ed è associabile al biofilm, condizioni che favoriscono la sopravvivenza e proliferazione del microrganismo114. Dallo studio condotto da Totaro et al.115 è stata riscontrata la presenza di qPCR di Legionella e Amoebozoa con valori r da 0,998 a 1 che dimostra la forte relazione tra questi microrganismi nell'ambiente, e proprio sulla base di queste informazioni abbiamo deciso di effettuare le analisi molecolari quantitative real-time PCR per poter rilevare la presenza di materiale genomico.
Poiché i parametri chimico-fisici (la temperatura, il pH e la conducibilità) sono fattori ambientali importanti, abbiamo deciso di approfondire la relazione del microrganismo con l’acqua ponendo l’attenzione su un altro parametro, la conducibilità, misura relativa che evidenzia la presenza di ioni più o meno abbondanti disciolti in essa. Nello specifico, gli ioni favoriscono il passaggio di corrente e maggiore è la loro presenza, maggiore è di conseguenza la conducibilità elettrica. Inoltre, come riportato da Li-Ming He116, alti livelli di conduttività nel flusso d'acqua e quindi un'elevata concentrazione di ioni inibiscono la crescita batterica o addirittura danneggiano i microrganismi: quindi a partire dai dati ottenuti
dalla rilevazione dei parametri, abbiamo quindi correlato per ogni tipologia di acqua esaminata, la presenza di Legionella spp. in relazione alla conducibilità sia con i dati ottenuti dal metodo colturale che dal metodo molecolare quantitativo real-time PCR.
Le acque minerali naturali a nostra disposizione hanno riportato una conducibilità media di 1141,65 µS/cm e correlando la conducibilità ai valori CFU/L è stato possibile riscontrare una correlazione pari a r= -0,35, dimostrando che all’aumentare della conducibilità ci sia una minor presenza di cellule coltivabili di Legionella spp. comparando i GU/L ottenuti con la conducibilità r=0,40 risultato conforme a ciò che riporta lo studio effettuato da Totaro et al. il quale sostiene forti associazioni tra i parametri fisico-chimici conducibilità; temperatura e le unità qPCR Legionella spp. (valori r da 0,588 a 0,844).
Questo è stato anche visto per le acque minerali naturali in bottiglia dove, nei campioni i cui i valori erano ≤100 CFU/L, effettuando la ricerca molecolare quantitativa real-time PCR abbiamo rilevato la presenza di materiale genomico nel 70% dei campioni e con una correlazione tra conducibilità e GU/L di 0,30.
Un’ulteriore conferma sull’interferenza degli ioni presenti e la proliferazione è stata osservata nelle acque potabili: nei campioni esaminati circa l’80% ha riportato valori ≤100 CFU/L e la correlazione tra CFU/L e conducibilità ha riportato un r= -0,44. Anche in questo caso la correlazione tra GU/L e conducibilità è in linea con ciò che abbiamo osservato nelle acque minerali naturali, infatti è risultata essere di 0,45.
Poiché Legionella spp. è stata rilevata in tutte le tipologie di acqua a nostra disposizione, sia attraverso il metodo colturale che molecolare con real-time PCR, possiamo dire che
Legionella spp. è un microrganismo ubiquitario nelle acque, la cui proliferazione sembra
essere maggiore in temperature che variano dai 25-50 °C. Sulla relazione tra proliferazione e la presenza di ioni in acqua, le nostre analisi sembrano in linea con la letteratura, poiché abbiamo riscontrato una minor presenza di Legionella spp in forma coltivabile e maggiore invece in forma non coltivabile o non più vitale all’aumentare della conducibilità
dell’acqua.
Per quanto riguarda invece la ricerca di Helicobacter pylori, tutte le nostre analisi hanno dato esito negativo. Questo potrebbe essere giustificato dal fatto che non sia in grado di resistere alle tecniche di potabilizzazione e sia sensibile ai comuni trattamenti di
disinfezione chimica66. Inoltre, H. pylori trova diffusione nelle acque reflue96 non analizzate nel nostro studio. Ulteriori campioni saranno valutati per superare il numero esiguo di misurazioni effettuate.