Analisi chimiche

6.4.1 Metodologia impiegata

La determinazione delle micotossine è stata effettuata mediante test ELISA (HelicaBiosystems Inc., USA) seguendo le istruzioni fornite dal produttore.

Le micotossine ricercate sono state: Aflatossine; Fumonisina; Zearalenone; Deossinivalenolo; Tossina T2; Ocratossina A.

6.4.2 Accertamento della Fumonisina mediante Fumonisin ELISA Assay

L’Helica Biosystems Fumonisin Elisa è un test immunoenzimatico in fase solida. Un anticorpo specifico per la fumonisina, ottimizzato per la reazione incrociata con i tre sottotipi di fumonisina, viene ricoperto con un micropozzetto di polistirene. Le tossine vengono estratte da un campione macinato con il 90% di metanolo. Il campione estratto e la fumonisina coniugata con l’HRP vengono mescolati e aggiunti al micropozzetto rivestito con anticorpi. La fumonisina del campione estratto e la fumonisina coniugata con l’HRP competono per legarsi con l'anticorpo rivestito nel micropozzetto. Il contenuto dei microtitoli viene fatto decantare e i reagenti non specifici vengono rimossi mediante lavaggio. Viene aggiunto un substrato enzimatico (TMB) e si sviluppa colore (blu). L'intensità del colore è direttamente proporzionale alla quantità di coniugato legato e inversamente proporzionale alla concentrazione di fumonisina nel campione o nello standard. Pertanto, poiché la concentrazione di fumonisina nel campione o negli standard aumenta, l'intensità del colore blu diminuirà. Viene aggiunta una soluzione di arresto acida che cambia il colore del cromogeno dal blu al giallo. I micropozzetti vengono misurati otticamente da un lettore di micropiastre con un filtro di assorbanza di 450 nm (OD 450). Le densità ottiche dei campioni sono confrontate con le OD degli standard del kit e viene determinato un risultato interpretativo.

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6.4.3 Accertamento del Zearalenone mediante Zearalenone ELISA Assay

L’Helica Biosystems Zearalenone Elisa è un test immunoenzimatico in fase solida. Un anticorpo specifico per lo zearalenone ottimizzato per reagire con lo stesso viene rivestito con un micropozzetto di polistirene. Le tossine vengono estratte da un campione macinato con il 70% di metanolo. Se è presente lo zearalenone si legherà all'anticorpo rivestito. Successivamente, lo zearalenone legato alla perossidasi di rafano (HRP) viene aggiunto e si lega all'anticorpo non occupato dallo zearalenone presente nel campione o nello standard. Dopo questo periodo di incubazione, il contenuto dei pozzetti viene fatto decantare, lavato e viene aggiunto un substrato HRP che sviluppa un colore blu in presenza di un enzima. L'intensità del colore è direttamente proporzionale alla quantità di coniugato legato e inversamente proporzionale alla quantità di zearalenone nello standard o nel campione. Pertanto, poiché la concentrazione di zearalenone nel campione o negli standard aumenta, l'intensità del colore blu diminuirà. Viene aggiunta una soluzione di arresto acida che cambia il colore del cromogeno dal blu al giallo. I micropozzetti vengono misurati otticamente da un lettore di micropiastre con un filtro di assorbanza di 450 nm (OD450). Le densità ottiche dei campioni sono confrontate con le OD degli standard del kit e viene determinato un risultato dall'interpolazione dalla curva dello standard. Il limite di rivelabilità di questo metodo è di 0,2 ng/mL (ppb) (Helica Biosystems, Inc.).

6.4.4 Accertamento della Deossinivalenolo mediante Deoxynivalenol (DON) ELISA Assay

L’Helica Biosystems Deoxynivalenol Elisa è un test immunoenzimatico in fase solida. Un anticorpo specifico per il deossinivalenolo viene rivestito con un micropozzetto di polistirene. Le tossine vengono estratte da un campione macinato con acqua distillata o deionizzata. Il campione estratto e il DON legato alla perossidasi di rafano (HRP) vengono miscelati e aggiunti al micropozzetto rivestito da un anticorpo. Il DON dal campione estratto e il DON coniugato con l’HRP competono per legarsi con l'anticorpo rivestito nel micropozzetto. Dopo questo periodo di incubazione, il contenuto dei pozzetti viene fatto decantare, lavato e viene aggiunto un substrato HRP che sviluppa un colore blu in presenza dell'enzima. L'intensità del colore è direttamente proporzionale alla quantità di coniugato legato e inversamente proporzionale alla quantità di DON nello standard o nel campione. Pertanto, man mano che la concentrazione di DON nel campione o standard aumenta, l'intensità del colore blu diminuirà. Viene aggiunta una soluzione di arresto acida che cambia il colore del cromogeno dal blu al giallo. I micropozzetti vengono misurati otticamente da un lettore di micropiastre con un filtro di

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assorbanza di 450 nm (OD450). Le densità ottiche dei campioni sono confrontate con le OD degli standard del kit e un risultato è determinato dall'interpolazione dalla curva dello standard.

Il limite di rivelabilità di questo metodo è di 10,0 ng/mL (ppb) (Helica Biosystems, Inc.).

6.4.5 Accertamento dell’Ocratossina A mediante Ochratoxin A ELISA Assay for Grains

L’Helica Biosystems Ochratoxin A Elisa è un test immunoenzimatico in fase solida. Un anticorpo specifico per l’ocratossina ottimizzato per reagire con l’ocratossina A (vedere informazioni sulla reattività crociata) è rivestito con un micropozzetto di polistirene. Le tossine vengono estratte da un campione macinato con il 70% di metanolo. Il campione estratto e l'ocratossina coniugata con l’HRP sono mescolati e aggiunti al micropozzetto rivestito con anticorpi. L'ocratossina A del campione estratto e l'ocratossina coniugata con l’HRP competono per legarsi con l'anticorpo rivestito nel micropozzetto. Dopo questo periodo di incubazione, i contenuti dei pozzetti vengono fatti decantare, lavati e viene aggiunto un substrato HRP che sviluppa un colore blu in presenza dell’ enzima. L'intensità del colore è direttamente proporzionale alla quantità di coniugato legato e inversamente proporzionale alla concentrazione di ocratossina A nello standard o campione. Pertanto, poiché la concentrazione di ocratossina A nel campione o negli standard aumenta, l'intensità del colore blu diminuirà. Viene aggiunta una soluzione di arresto acida che cambia il colore del cromogeno dal blu al giallo. I micropozzetti vengono misurati otticamente da un lettore di micropiastre con un filtro di assorbanza di 450 nm (OD450). Le densità ottiche dei campioni sono confrontate con le OD degli standard del kit e un risultato è determinato dall'interpolazione dalla cuva dello standard.

Il limite di rilevabilità di questo metodo è di 0,4 ng/mL (ppb) (Helica Biosystems, Inc.).

6.4.6 Accertamento delle Aflatossine mediante Aflatoxins ELISA Assay

L’Helica Biosystems Aflatoxins ELISA è un test immunoenzimatico in fase solida. Un anticorpo specifico per l’aflatossina, ottimizzato per la reazione crociata con tutti e quattro i sottotipi dell’aflatossina viene ricoperto con un micropozzetto di polistirene. Le tossine vengono estratte da un campione miscelato con il 70% di metanolo. Il campione estratto e l'aflatossina B1 coniugata con l’HRP sono mescolati e aggiunti al micropozzetto rivestito con l’anticorpo. L'aflatossina dal campione estratto e l'aflatossina B1 coniugata con l’HRP competono per legarsi con l'anticorpo rivestito nel micropozzetto. Il contenuto di microtitoli viene fatto decantare e i reagenti non specifici vengono rimossi mediante lavaggio. Viene aggiunto un substrato enzimatico (TMB) e si sviluppa il colore (blu). L'intensità del colore è direttamente proporzionale alla quantità di coniugato legato e

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inversamente proporzionale alla concentrazione di aflatossina nel campione o nello standard. Pertanto, poiché la concentrazione di aflatossina nel campione o nello standard aumenta, l'intensità del colore blu diminuirà. Viene aggiunta una soluzione di arresto acida che cambia il colore del cromogeno dal blu al giallo. I micropozzetti vengono misurati otticamente da un lettore di micropiastre con un filtro di assorbanza di 450 nm (OD450). Le densità ottiche dei campioni sono confrontate con le OD degli standard del kit e viene determinato un risultato interpretativo.

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