Analisi dei dati

In tutti gli esperimenti sulla vitalità cellulare, l’assorbanza è stata misurata ad una lunghezza d’onda di 450 nm con un lettore multipiastra (EnSpire®_{; PerkinElmer, Wellesley, MA, USA); in} particolare, la vitalità è stata calcolata come percentuale di assorbanza esibita dalle cellule sottoposte a trattamento rispetto alle cellule trattate con il corrispondente veicolo e a ciascun dato è stato sottratto il corrispettivo bianco, ossia il valore di assorbanza relativo alla soluzione presente nei pozzetti privi di cellule. Tutti gli esperimenti (sia quelli condotti in assorbanza sia quelli in fluorescenza con WSP-1) sono stati condotti in triplicato e ripetuti almeno tre volte per un n ≥ 9 e i valori ottenuti sono stati espressi come media ± errore standard.

Anche gli esperimenti in citofluorimetria per l’analisi del ciclo cellulare sono stati effettuati in triplicato e i valori ottenuti sono stati espressi come media ± errore standard.

Per la comparazione dei risultati, infine, è stato utilizzato il test statistico ANOVA a due vie seguìto da post-test di Dunnett o da test t di Student; un livello di P<0.05 è stato considerato come limite di significatività statistica (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001).

75

Capitolo 4

Risultati e discussione

Nei precedenti studi condotti in questo laboratorio di ricerca, l’isotiocianato aromatico sintetico p-COOHPhNCS si è rivelato un donatore di H2S quantitativamente migliore rispetto agli isotiocianati di origine naturale [Martelli et al., 2013b] e dunque, considerate le proprietà farmacologiche descritte per il solfuro di idrogeno, l’inserimento del gruppo N=C=S in un sistema in grado di favorire una maggiore donazione del gas rappresenta oggi una nuova direzione nello sviluppo di composti sempre più efficaci e potenzialmente impiegabili anche nel trattamento del tumore del pancreas.

La valutazione dell’effetto di p-COOHPhNCS sulla proliferazione delle cellule cancerose pancreatiche AsPC-1, dunque, si è dimostrata fondamentale per conoscere in modo più approfondito le caratteristiche di questo promettente isotiocianato.

Nel range di concentrazioni testate (1 mM, 500 µM, 300 µM, 200 µM, 100 µM, 50 µM e 10 µM), il composto in esame ha determinato una significativa inibizione concentrazione-dipendente della proliferazione cellulare dopo 72 h di incubazione. In particolare, p-COOHPhNCS ha mostrato un’efficacia pressochè totale alla massima concentrazione testata (1 mM) che si è dimostrata capace di inibire la vitalità cellulare fino ad un valore di 92,4 ± 1,9 % rispetto al controllo (Grafico 1 A); p-COOHPhNCS, inoltre, ha mostrato una potenza (espressa come IC50) di circa 300 µM (pIC50 = 3,47 ± 0,035) (Grafico 1 B).

Sulla base dei risultati ottenuti è possibile affermare che p-COOHPhNCS sia un composto dotato di spiccata efficacia antiproliferativa su cellule tumorali pancreatiche AsPC-1, con un indice di potenza che si aggira intorno ad un ordine di grandezza superiore rispetto a quelli descritti per l’isotiocianato sulforafano; il dato cui si fa riferimento per il composto naturale, tuttavia, proviene da studi sporadici condotti in condizioni sperimentali non paragonabili a quelle di questo studio.

76

Grafico 1. A) Istogrammi relativi alla vitalità cellulare della linea tumorale AsPC-1 dopo 72 ore di

incubazione con veicolo, DMSO all’1% (control), o con varie concentrazioni del composto p- COOHPhNCS (1 mM, 500 µM, 300 µM, 200 µM, 100 µM, 50 µM e 10 µM). Le barre verticali indicano l’errore standard mentre gli asterischi (*) si riferiscono ad un valore di vitalità significativamente differente da quello del controllo (veicolo) (*P<0,05; ***P<0,001). B) Curva sigmoide concentrazione-risposta che descrive l’effetto di p-COOHPhNCS sulla proliferazione cellulare.

A

77 Come discusso nella parte introduttiva del presente lavoro di tesi, il meccanismo con cui gli isotiocianati siano in grado di esplicare le molteplici azioni farmacologiche non è ancora del tutto noto ma sembra essere in gran parte attribuibile alla presunta interazione con numerosi target intracellulari, compresi i fattori Nrf2 e NF-kB e la via di trasduzione del segnale PI3K/AKT/mTOR. Alla luce delle capacità di rilascio di H2S precedentemente riconosciute in questo laboratorio ad una lunga serie di isiotiocianati naturali e sintetici e in virtù degli esperimenti effettuati in vitro sullo stesso p-COOHPhNCS attraverso un metodo amperometrico e in presenza di tioli aggiunti, è possibile descrivere p-COOHPhNCS come un efficace donatore lento di H2S; per questo motivo, risulta particolarmente ragionevole ipotizzare che il suo effetto antiproliferativo possa essere ampiamente correlato al rilascio di solfuro d’idrogeno in substrati biologici.

Ai fini sperimentali, dunque, si è rivelato necessario valutare l’effettiva donazione di H2S nella coltura cellulare oggetto di questo studio (AsPC-1) per meglio comprendere se i composti tiolici intracellulari possano da soli favorire la liberazione di H2S, generando così la stessa risposta ottenuta in vitro con concentrazioni di p-COOHPhNCS decisamente superiori rispetto a quella selezionata (200 µM). A questo proposito, è stata impiegata una metodica originale e innovativa, ossia una misurazione fluorimetrica con sonda WSP-1; l’incubazione delle cellule AsPC-1 con una concentrazione di p-COOHPhNCS attiva ma leggermente inferiore a IC50 (tale da ridurre il rischio di causare un’eccessiva sofferenza cellulare e, allo stesso tempo, di incorrere in una misurazione falsata) ha prodotto un notevole aumento della fluorescenza in modo direttamente proporzionale alla quantità di H2S presente all’interno delle cellule. In particolare, la cinetica di rilascio di H2S da parte di p-COOHPhNCS si è dimostrata relativamente lenta ed ha portato al raggiungimento di un plateau dopo circa un’ora di incubazione (Grafico 2).

Questo nuovo metodo, pur presentando un limite quantitativo notevole, ha consentito di misurare una variazione dell’indice di fluorescenza (ΔFI) a seguito del trattamento di cellule AsPC-1 con p-COOHPhNCS e di comprovare una reale generazione di H2S da parte del composto in esame; sebbene il dato ottenuto non dimostri che l’attività antitumorale di p-COOHPhNCS sia effettivamente dovuta a questo rilascio, è sensato ritenere che la generazione di solfuro d’idrogeno contribuisca ampiamente all’effetto antiproliferativo dell’isotiocianato, considerati gli effetti di H2S precedentemente descritti e la verificata capacità di p-COOHPhNCS di liberare il gas stesso nell’ambiente intracellulare

78

Grafico 2. Variazione nel tempo della fluorescenza emessa dalla sonda WSP-1 in funzione della

concentrazione di H2S intracellulare dopo trattamento delle cellule AsPC-1 con il solo veicolo,

DMSO allo 0,05% (•) o con il composto p-COOHPhNCS 200 µM (

▪

La valutazione citofluorimetrica su cellule AsPC-1 relativa alla percentuale di distribuzione delle cellule nelle varie fasi del ciclo cellulare, ha poi permesso di rilevare, nelle cellule trattate con solo veicolo, una percentuale di 51.4 ± 0.1 di cellule in fase G0/G1, una di 10.2 ± 1.8 di cellule in fase S ed un valore percentuale di 31.5 ± 1.6 di cellule in fase G2/M (Grafici 3 A e 3 C).

Il trattamento con p-COOHPhNCS per 72 ore consecutive ha determinato un rilevante incremento della percentuale di cellule in fase G0/G1 (fase inerte ai fini della proliferazione delle cellule tumorali) accompagnato da una modesta ma significativa riduzione delle cellule in fase G2/M che testimonia una profonda alterazione delle caratteristiche neoplastiche delle cellule (Grafici 3 B e 3 C).

Lo spostamento significativo e quantitativamente rilevante del numero di cellule in fase G0/G1 dopo trattamento con p-COOHPhNCS è simile a quanto riportato in letteratura per il sale NaHS [Lv et al., 2014] e per altri isotiocianati sperimentati su linee cellulari tumorali diverse [Chen et al., 2012]. Questa considerazione rafforza, quindi, l’ipotesi secondo cui il rilascio di H2S contribuisca in modo significativo all’attività antitumorale degli isotiocianati di origine naturale e sintetica.

79 Veicolo p-COOHPhNCS 200 µM

Grafico 3. Effetto di p-COOHPhNCS sulla progressione del ciclo cellulare di cellule AsPC-1.

Analisi citofluorimetrica del ciclo cellulare a seguito dell’incubazione per 72 h con DMSO all’1% (veicolo) (A) o dopo trattamento con p-COOHPhNCS 200 µM (B). (C) Istogrammi rappresentativi della distribuzione nelle varie fasi del ciclo cellulare delle cellule trattate con veicolo o p- COOHPhNCS 200 µM. Le barre verticali indicano l’errore standard mentre gli asterischi (*) si riferiscono ad un valore significativamente differente da quello del corrispondente veicolo (*P<0,05; **P<0,01). La relativa tabella riporta, invece, le percentuali di cellule nelle tre fasi del ciclo cellulare in seguito a trattamento ± errore standard.

A

B

80 Da molto tempo l’approccio terapeutico per il trattamento delle patologie più aggressive, tra cui il cancro, si basa sull’impiego di diverse molecole in grado di agire su specifici bersagli cellulari con meccanismi d’azione tra loro diversi; per questo motivo, è stata presa ampiamente in considerazione la possibilità di co-somministrare gemcitabina (farmaco di prima linea nel trattamento farmacologico del tumore del pancreas) con altri composti nell’ottica di rendere le cellule più vulnerabili all’azione del chemioterapico di riferimento consentendo, allo stesso tempo, un regime posologico meno aggressivo e più efficace rispetto a quello attuale.

La valutazione dell’effetto antiproliferativo di nuove associazioni costituisce, quindi, una possibile strategia per contrastare la crescita di cellule tumorali altamente resistenti come quelle pancreatiche e perciò, dal punto di vista sperimentale, si è rivelato importante studiare gli effetti della co-somministrazione di gemcitabina e p-COOHPhNCS su cellule AsPC-1. Tale studio ha imposto, però, una prima valutazione dell’azione antiproliferativa della sola gemcitabina per poterne dimostrare l’efficacia nelle stesse condizioni sperimentali e, soprattutto, per poter selezionare una concentrazione ottimale da utilizzare nei successivi esperimenti di approfondimento farmacologico. Nel range di concentrazioni testate (10 µM, 1 µM, 100 nM, 10 nM, 1 nM), gemcitabina ha mostrato una significativa attività antiproliferativa concentrazione- dipendente e ha raggiunto, alla massima concentrazione testata (10 µM), un’efficacia di inibizione della proliferazione pari al 49,4 ± 3,4 % (Grafico 4).

Dai dati ottenuti dall’impiego isolato dei due composti è stato possibile selezionare le due concentrazioni più idonee per gli studi sull’associazione (10 µM per gemcitabina e 200 µM per p-COOHPhNCS); in una strategia di co-somministrazione finalizzata ad individuare un’eventuale attività additiva/sinergica delle due molecole in esame, infatti, risultava necessario utilizzare concentrazioni che dessero effetti marcati in entrambi i casi, senza che nessuna fosse però in grado di espletare un eccessivo effetto inibitorio sulla proliferazione cellulare tale da rendere meno visibile l’azione dell’associazione.

81

Grafico 4. Istogramma relativo alla vitalità cellulare della linea AsPC-1 dopo 72 ore di

incubazione con solo mezzo di coltura (controllo) o con varie concentrazioni di gemcitabina (10 µM, 1 µM, 100 nM, 10 nM, 1 nM). Le barre verticali indicano l’errore standard mentre gli asterischi (*) si riferiscono ad un valore di vitalità significativamente differente da quello del corrispondente veicolo (**P<0,01; ***P<0,001).

Anche nel caso di gemcitabina, come per p-COOHPhNCS, sono stati effettuati studi sulla distribuzione delle cellule AsPC-1 nelle varie fasi del ciclo cellulare; in particolare, la valutazione citofluorimetrica ha permesso di rilevare uno spostamento significativo delle cellule verso la fase S del ciclo dopo incubazione con il chemioterapico gemcitabina per 72 h (Grafici 5 B e 5 C) come già ampiamente riportato in letteratura sia per le stesse cellule di adenocarcinoma pancreatico umano AsPC-1 sia per altre linee cellulari tumorali del pancreas (BxPC-3 e MiaPaca-2, ad esempio) [Hamed et al., 2013].

82 Veicolo Gemcitabina 1 µM

Grafico 5. Effetto di Gemcitabina sulla progressione del ciclo cellulare di cellule AsPC-1. Analisi

citofluorimetrica del ciclo cellulare a seguito dell’incubazione per 72 h con il veicolo (A) oppure dopo trattamento con Gemcitabina 1 µM (B). (C) Istogrammi rappresentativi della distribuzione nelle varie fasi del ciclo delle cellule trattate con veicolo o con Gemcitabina 1 µM. Le barre verticali indicano l’errore standard mentre gli asterischi (*) si riferiscono ad un valore di vitalità significativamente differente da quello del corrispondente veicolo (**P<0,01). La relativa tabella riporta, invece, le percentuali di cellule nelle tre fasi del ciclo cellulare in seguito a trattamento ± errore standard.

A

B

83 Una volta selezionate le concentrazioni di gemcitabina e p-COOHPhNCS ottimali, sono stati quindi valutati gli effetti della co-somministrazione sulla proliferazione cellulare. Come già evidenziato, le due concentrazioni scelte (10 µM per gemcitabina e 200 µM per p-COOHPhNCS) si sono dimostrate in grado di inibire la vitalità delle cellule AsPC-1 di circa il 50 %; il trattamento in associazione, invece, ha permesso di ottenere un effetto inibitorio molto più marcato e capace di raggiungere un livello di inibizione della paroliferazione cellulare pari al 75,8 ± 5,3 % rispetto al controllo (veicolo).

I dati ottenuti dimostrano, dunque, che la co-somministrazione garantisce un netto miglioramento dell’effetto antiproliferativo; l’analisi dei risultati ottenuti consente, infatti, di osservare un incremento significativamente superiore dell’attività inibitoria indotta da gemcitabina e p-COOHPhNCS separatamente (Grafico 6).

Grafico 6. Istogrammi relativi alla vitalità cellulare della linea AsPC-1 dopo 72 ore di incubazione

con il veicolo DMSO all’1% (controllo), con gemcitabina 1 µM, con p-COOHPhNCS 200 µM e con gemcitabina 1 µM + p-COOHPhNCS 200 µM in associazione. Gli asterischi (*) si riferiscono ad un valore di vitalità significativamente differente da quello del corrispondente controllo (***P<0,001) mentre i cerchietti (°) indicano un valore di vitalità significativamente differente da quello di p-COOHPhNCS 200 µM (°° p<0,01); il simbolo §, invece, si riferisce ad un valore di vitalità significativamente differente da quello di gemcitabina 1 µM (§§§ p<0,001). Le barre verticali indicano l’errore standard.

84 Infine, per quanto riguarda gli studi sulla distribuzione delle cellule AsPC-1 nelle varie fasi del ciclo cellulare, è possibile notare come la co-somministrazione dei due composti sia in grado di indurre un effetto quali-quantitativamente analogo a quello mostrato dalla sola gemcitabina; a seguito del trattamento con le due molecole in associazione per 72 h, infatti, è chiaramente evidente un marcato (anche se non significativo) spostamento della distribuzione cellulare verso la fase S del ciclo (Grafici 7 B e 7 C) rispetto al controllo (Grafico 7 A).

Sfortunatamente questo studio non consente di elaborare ipotesi meccanicistiche sulle specifiche modalità di interazione tra p-COOHPhNCS e gemcitabina e, al momento, non è possibile neanche affermare che l’effetto osservato sia di natura sinergica o semplicemente additiva; considerato però che il profilo risultante dalla co-somministrazione sul ciclo cellulare è decisamente sovrapponibile a quello osservato con la sola gemcitabina nelle stesse condizioni sperimentali, appare logico avanzare l’ipotesi secondo cui p-COOHPhNCS possa sensibilizzare le cellule tumorali al trattamento con gemcitabina facilitando così l’azione antiproliferativa del chemioterapico di riferimento.

In conclusione, dal momento che le ipotesi formulate in principio hanno trovato in questi studi numerose conferme, è ragionevole prendere in considerazione la possibilità di trasferire i risultati di queste ricerche sperimentali condotte su gemcitabina e p-COOHPhNCS nella pratica clinica (ricerca traslazionale).

L’isotiocianato di origine naturale sulforafano, infatti, è già oggetto di uno studio clinico randomizzato, in doppio cieco, di fase I (studio POUDER) condotto su quaranta pazienti affetti da adenocarcinoma duttale pancreatico in stadio avanzato; di questi, un gruppo è tenuto ad assumere 90 mg al giorno del composto in esame (estratti di germogli di broccoli titolati in sulforafano) mentre un altro gruppo (controllo) è scelto come riferimento ed è destinato a ricevere una sostanza inattiva (placebo) per un anno [Lozanovski et al., 2014].

Lo studio clinico sopra citato e l’utilizzo consolidato di gemcitabina nel trattamento del tumore del pancreas forniscono quindi una base razionale per l’eventuale impiego clinico dei due composti in associazione.

85 Veicolo p-COOHPhNCS 200 µM +

Gemcitabina 1 µm

Grafico 7. Effetto di Gemcitabina e p-COOHPhNCS in co-somministrazione sulla progressione del ciclo cellulare di cellule AsPC-1. Analisi citofluorimetrica del ciclo cellulare a seguito dell’incubazione di cellule AsPC-1 per 72 h in DMSO all’1% (veicolo) (A) oppure dopo trattamento con Gemcitabina 1 µM e p-COOHPhNCS 200 µM in associazione (B). (C) Istogrammi rappresentativi della distribuzione nelle varie fasi del ciclo delle cellule trattate con DMSO all’1% (veicolo) o con Gemcitabina 1 µM e p-COOHPhNCS 200 µM. Le barre verticali indicano l’errore standard mentre gli asterischi (*) si riferiscono ad un valore significativamente differente da quello del corrispondente veicolo (*P<0,05). La relativa tabella riporta, invece, le percentuali di cellule nelle tre fasi del ciclo cellulare in seguito a trattamento ± errore standard.

A

B

86

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