Esperimenti

3.2.3.1 Vitalità cellulare: effetto antiproliferativo

Per la sperimentazione con varie concentrazioni di p-COOHPhNCS e gemcitabina è stata piastrata una multiwell da 96 pozzetti (10.000 cellule per ciascun pozzetto) in modo da poter osservare lo stato di vitalità e proliferazione cellulare della linea tumorale AsPC-1 dopo 72 ore dal trattamento, secondo la seguente scansione temporale: al termine delle 24 ore successive alla piastratura, il mezzo di coltura è stato sostituito con egual volume di mezzo fresco per asportare eventuali cellule morte in sospensione e per fornire a quelle vive tutti i nutrienti di cui hanno bisogno e, subito dopo, si è proceduto con il trattamento delle cellule secondo un planner prestabilito che prevedeva l’incubazione con diversi trattamenti da eseguire in triplicato; nel caso specifico, le cellule AsPC-1 sono state lasciate a contatto esclusivamente con il mezzo di coltura (controllo) o con il veicolo (soluzione di DMSO in mezzo di coltura all’ 1%) oppure sono state trattate con concentrazioni crescenti del composto, ovvero 10 µM, 50 µM, 100 µM, 200 µM, 300 µM, 500 µM e 1 mM per p-COOHPhNCS o di 10 µM, 1 µM, 100 nM, 10 nM e 1 nM per gemcitabina. Tali trattamenti sono stati ripetuti in pozzetti non piastrati con cellule (“bianchi”) e la piastra è stata riposta in incubatore alle condizioni di 37 °C e 5 % di CO2; trascorse 72 ore,

70 sono stati aggiunti 10 µL del reagente WST-1 (1:10) in ciascun pozzetto, la piastra è stata nuovamente inserita in incubatore per 60 minuti prima di sottoporla a lettura spettrofotometrica a 450 nM con EnSpire® (PerkinElmer) per la lettura dell’assorbanza (Abs).

3.2.3.2 Effetto di Gemcitabina e p-COOHPhNCS sulla proliferazione cellulare

Per lo studio sulla co-somministrazione di p-COOHPhNCS e gemcitabina è stata piastrata una multiwell con 10.000 cellule AsPC-1 in ogni pozzetto per osservare lo stato di vitalità e proliferazione cellulare dopo 72 ore dal trattamento. Al termine della 24 ore successive alla piastratura, il mezzo di coltura è stato sostituito con lo stesso volume di mezzo fresco prima di procedere con il trattamento delle cellule secondo un planner prestabilito che prevedeva l’incubazione con diversi trattamenti da eseguire in triplicato; in questo caso, le cellule AsPC-1 sono state lasciate a contatto esclusivamente con il mezzo di coltura (controllo) oppure trattate con il composto p-COOHPhNCS alla concentrazione di 200 µM, con il suo veicolo (soluzione di DMSO in mezzo di coltura all’ 1%), con il chemioterapico gemcitabina disciolto in mezzo di coltura in modo da ottenere una concentrazione pari a 1 µM e infine con p-COOHPhNCS 200 µM e gemcitabina 1 µM co-somministrati nello stesso pozzetto. Come sopra, il planner è stato ripetuto in maniera analoga nei pozzetti non piastrati con cellule definiti “bianchi” e la piastra è stata riposta in incubatore alle condizioni di 37 °C e 5 % di CO2; trascorse 72 ore, sono stati aggiunti 10 µL del reagente WST-1 in ciascun pozzetto prima di inserire nuovamente la piastra in incubatore per 60 minuti e di sottoporla, al termine dell’incubazione, a lettura spettrofotometrica a 450 nM con EnSpire® _{(PerkinElmer).}

3.2.3.3 Rilevazione del rilascio di H

S in substrati biologici mediante sonda fluorescente

(WSP-1)

Per gli esperimenti sul rilascio di H2S da parte di p-COOHPhNCS a livello cellulare, le cellule sono state piastrate in una multiwell nera da 96 pozzetti (72.000 cellule per ogni pozzetto); dopo 24 ore dalla piastratura, il mezzo di coltura è stato sostituito con il medesimo volume della sonda fluorescente WSP-1 precedentemente disciolta in Buffer Standard fino ad ottenere una concentrazione di 100 µM e capace di legare H2S distribuendosi ai due lati della membrana cellulare. La piastra è stata quindi lasciata incubare per 30 minuti prima di rimuovere la sonda non catturata dalle cellule rimpiazzandola con egual volume di Buffer Standard; subito dopo la

71 multiwell è stata sottoposta ad una prima lettura spettrofotometrica per ottenere una misurazione della fluorescenza basale. Si è proceduto dunque con il trattamento delle cellule secondo un planner prestabilito che prevedeva l’incubazione delle cellule con diversi trattamenti ripetuti in triplicato; in questo caso, le cellule AsPC-1 sono state trattate con il mezzo di coltura (controllo) o con il veicolo (soluzione di DMSO in mezzo di coltura allo 0,5%) oppure sono state trattate con il composto in esame (p-COOHPhNCS) alla concentrazione di 200 µM. Come da protocollo, il planner è stato ripetuto in maniera analoga nei pozzetti non piastrati con cellule cosiddetti “bianchi” e la piastra è stata immediatamente sottoposta a lettura spettrofotometrica alla temperatura di 37°C e alla lunghezza d’onda di 465 nM in eccitazione e di 515 nM in emissione con EnSpire® _{(PerkinElmer); nel caso specifico, lo strumento è stato} impostato in modo tale da effettuare letture ripetute ogni 5 minuti per un tempo di 60 minuti in modo da ottenere una lettura in cinetica del rilascio di H2S da parte di p-COOHPhNCS.

3.2.3.4 Analisi del ciclo in seguito a trattamento

Per gli studi sul ciclo cellulare, sono state utilizzate multiwell in plastica trasparente da 6 pozzetti in cui sono state piastrate 500.000 cellule per ogni pozzetto; il giorno successivo alla piastratura si è rimpiazzato il mezzo di coltura vecchio con mezzo fresco prima di eseguire il trattamento delle cellule secondo un planner prestabilito che prevedeva l’incubazione delle cellule con diversi trattamenti. In particolare, le cellule sono state trattate con il mezzo di coltura (controllo) oppure trattate con il composto p-COOHPhNCS alla concentrazione di 200 µM, con il suo veicolo (soluzione di DMSO in mezzo di coltura all’ 1%), con il chemioterapico gemcitabina disciolto in mezzo di coltura in modo da ottenere una concentrazione pari a 1 µM e infine con p- COOHPhNCS 200 µM e gemcitabina 1 µM co-somministrati nello stesso pozzetto. La piastra è stata posta in incubatore alle condizioni di 37 °C e 5 % di CO2 per un tempo di 72 ore, al cui termine il mezzo di coltura contenente il trattamento è stato sostituito con egual volume di DPBS e le cellule sono state staccate dalla superficie con uno scraper; il contenuto di ciascun pozzetto è stato quindi trasferito in una diversa “falcon” da sottoporre a centrifugazione a 1100 rpm x 5 min. Successivamente, il sovranatante è stato rimosso da ciascuna falcon e si è proceduto ad un secondo lavaggio con DPBS seguito dalla centrifugazione dei cinque diversi campioni; si è dunque eliminato gran parte del sovranatante, si è risospeso il pellet nei pochi µL di DPBS residuo trasferendo poi la sospensione in eppendorf contenenti ciascuna 1 mL di EtOH al 70% precedentemente preparato e stoccato a – 20°C e i campioni ottenuti sono stati conservati a –

72 20°C overnight. Il giorno seguente sono stati risospesi i campioni e 200 µL di ciascuna eppendorf sono stati trasferiti in cinque “falcon” corrispondenti ai cinque diversi trattamenti da sottoporre nuovamente a centrifugazione a 1100 rpm x 5 minuti e ad un ulteriore lavaggio con DPBS; infine, è stato aspirato il sovranatante e ciascun pellet è stato risospeso in 200 µL di Muse Cell Cycle Reagent prima di incubare a T ambiente e al buio per 30 minuti, al termine dei quali è stata effettuata l’analisi dei campioni con il microcitofluorimetro Muse® _{Cell Analyzer secondo il} programma previsto per il ciclo cellulare e seguendo le metodiche riportate nell’apposito manuale.