Negli ultimi tempi si è fatta sempre più viva l’ipotesi secondo cui gli effetti degli isotiocianati sul sistema cardiovascolare e sulla proliferazione cellulare possano dipendere dalla loro capacità di rilasciare lentamente H2S in presenza di tioli organici, tra cui L-Cisteina; un recente studio sperimentale ha infatti permesso per la prima volta di misurare, attraverso metodi amperometrici e spettrofotometrici, l’effettiva quantità di gas liberata nel tempo da diversi aril- isotiocianati di origine naturale [Citi et al., 2014] in modo da giustificarne un eventuale impiego nutraceutico e fitoterapeutico nella prevenzione di importanti patologie quali cancro, processi neurodegenerativi e malattie cardiovascolari [Dinknova-Kostova e Kostov, 2012]. Nel caso specifico, tra tutti i composti distribuiti nelle piante appartenenti alla famiglia delle Brassicaceae, sono stati selezionati isotiocianato di allile (AITC, ottenuto dai semi della senape nera, Brassica nigra), 4-idrossibenzilisotiocianato (HBITC, ampiamente presente nella senape bianca, Sinapis alba), benzil isotiocianato (BITC, contenuto nel crescione inglese, Lepidium sativum L.) ed erucina (ERU, largamente presente nei broccoli, Brassica oleracea L., e nella rucola, Eruca vesicaria L.); come composti di riferimento sono stati invece scelti diallil disolfuro (DADS, contenuto in Allium sativum) e sinigrina (SIN, glucosinolato precursore di AITC) (Figura 27).
Figura 27. Struttura chimica degli isotiocianati naturali testati e dei composti di riferimento
scelti.
La capacità di rilasciare solfuro di idrogeno, già nota per alcune molecole di origine naturale ma finora mai attribuita agli isotiocianati, è una caratteristica farmacologicamente rilevante per una grande varietà di composti. In particolare, tra tutti quelli testati, ERU e BITC si sono dimostrati deboli donatori di solfuro di idrogeno sia in assenza che in presenza dell’amminoacido solforato L-Cisteina mentre AITC, nelle stesse condizioni sperimentali, ha liberato quantità apprezzabili di H2S in modo cisteina-dipendente. A differenza della molecola di riferimento DADS, HBITC si è
58 rivelato invece il miglior H2S donor anche in assenza di L-Cisteina; al contrario, il glucosinolato sinigrina non ha mostrato significative proprietà di donatore di solfuro di idrogeno in alcun caso, a dimostrazione del fatto che il gruppo isotiocianato risulta essere essenziale per la liberazione del gas (Figura 28 e Tabella 5).
Figura 28. Rilascio di H2S da parte di allil isotiocianato (AITC), erucina (ERU), benzil isotiocianato
(BITC) e sinigrina (SIN) in assenza (A) o in presenza di L-Cisteina (B). Le due curve descrivono l’aumento della concentrazione di H2S in funzione del tempo, a seguito dell’incubazione dei
composti selezionati. La misurazione è stata effettuata in entrambi i casi con metodo amperometrico [Citi et al., 2014].
AB AB + L-Cisteina Composto
C
max(µM) Cmax(µM)DADS < 0.5 18,9 ± 4.8 AITC 0.5 ± 0.2 6.2 ± 1.3 BITC < 0.5 1.9 ± 0.4 ERU 0.5 ± 0.2 1.9 ± 0.1 HBITC 11.0 ± 0.8 17.9 ± 1.5 SIN < 0.5 < 0.5
Tabella 5. Parametro Cmax relativo al rilascio di H2S da parte dei composti testati, dopo
incubazione in assenza di L-Cisteina (AB) o in presenza di L-Cisteina 4 mM (AB + L-Cisteina) a pH e temperatura fisiologici [Martelli et al., 2013b; Citi et al., 2014].
59 Ulteriori esperimenti sono stati poi effettuati sugli isotiocianati sintetici PhNCS, p-COOHPhNCS, PhNCS-CH3, PhNCS-CF3 e PhNCS-iPr (Figura 29) confrontandoli con gli H2S-donors di riferimento NaHS, DADS e GYY4137.
Figura 29. Da sinistra verso destra sono illustrate le strutture chimiche dei composti di
riferimento GYY4137 e DADS e degli isotiocianati testati PhNCS, p-COOHPhNCS, PhNCS-CH3 (R=CH3), PhNCS-CF3 (R=CF3) e PhNCS-iPr (R=iPr).
L’analisi amperometrica ha confermato, in particolare, che NaHS 1 mM in soluzione acquosa è in grado di liberare grandi quantità di H2S (circa 200 µM) nei primi due minuti dall’inizio della misurazione, indipendentemente dalla presenza di L-Cisteina; come precedentemente discusso, però, il rilascio massiccio di solfuro di idrogeno da parte del sale non consente di riprodurre gli effetti biologici del gas endogeno poiché la quantità di H2S prodotta non è costante e tende ad esaurirsi in breve tempo [Martelli et al., 2014]. Gli isotiocianati studiati, invece, rilasciano solfuro di idrogeno con un meccanismo cisteina-dipendente che ricalca quello dei composti di riferimento DADS e GYY4137 e che mima la produzione endogena del gas, permettendo così di ridurre il rischio di effetti collaterali tipici dei donatori rapidi di H2S [Baskar et al., 2007; Li et al., 2008; Martelli et al., 2014]; in assenza di L-Cisteina, infatti, le quantità di gas liberate sono decisamente trascurabili mentre, in presenza della massima concentrazione dello stesso ammoacido solforato, la liberazione del gas risulta lenta e costante nel tempo con un valore di
60 Cmax pari a circa 20 µM (Figura 30). La presenza del gruppo carbossilico sull’anello aromatico in posizione para, inoltre, sembra migliorare il rilascio del gas in modo Cisteina-dipendente (Cmax 35 µM) senza modificare la velocità del processo e, al contrario, l’inserimento di un qualsiasi sotituente in posizione orto comporta la perdita delle proprietà di H2S donor dell’aril- isotiocianato, motivo per cui PhNCS-CH3, PhNCS-CF3 e PhNCS-iPr si sono dimostrati incapaci di liberare H2S anche in presenza di L-Cisteina. p-COOHPhNCS è stato dunque selezionato per un’ulteriore e inequivocabile prova della liberazione di H2S attraverso analisi gascromatografica dello spazio di testa/spettrometria di massa e i dati ottenuti dall’esperimento hanno permesso non solo di confermare quanto già ipotizzato ma anche di considerare ragionevolmente il composto come un promettente agente terapeutico [Martelli et al., 2014].
Figura 30. Rilascio di H2S da parte di NaHS (A) e p-COOHPhNCS (B). Le curve descrivono la
variazione della concentrazione di H2S in soluzione acquosa nel tempo, rispettivamente dopo
aggiunta di NaHS 1 mM o di PhNCS-COOH in assenza di L- Cisteina (quadrati bianchi) o in presenza di L-Cisteina 4 mM (quadrati neri); la necessaria presenza di L-Cisteina consente un rilascio “intelligente” ed esclusivo del gastrasmettitore a livello tissutale. Le misurazioni sono state effettuate in entrambi i casi con metodo amperometrico [Martelli et al., 2014].
Ad oggi, il meccanismo con cui gli isotiocianati rilasciano H2S non è ancora del tutto chiaro ma il processo prevede probabilmente un attacco nucleofilo da parte di L-Cisteina ed altri tioli organici sull’atomo di carbonio del gruppo funzionale N=C=S; l’intermedio che si forma dalla reazione
61 viene rapidamente convertito in un derivato più stabile con liberazione di una molecola di H2S (Figura 31) [Edman, 1950].
Figura 31. Possibile meccanismo di rilascio di H2S da parte di PhNCS-COOH.
PhNCS e p-COOHPhNCS sono stati poi utilizzati in diverse procedure sperimentali per valutare gli effetti degli isotiocianati sul sistema cardiovascolare, confrontandoli con quelli indotti da H2S endogeno. Dagli studi condotti su anelli di aorta di ratto, in particolare, è emerso che i due composti inducono sia un maggior vasorilasciamento rispetto al composto di riferimento NaHS in modo concentrazione-dipendente sia una discreta inibizione della vasocostrizione mediata dalla noradrenalina; inoltre, come NaHS, anche gli isotiocianati sembrano causare aumento del flusso coronarico ed iperpolarizzazione delle cellule muscolari lisce vascolari di aorta umana (HASMC). Considerando poi che questi effetti risultano antagonizzabili da XE991, bloccante dei canali Kv7 su cui si è scoperto agire H2S, è possibile ipotizzare che il meccanismo di azione degli isotiocianati sia attribuibile al significativo rilascio del gas in presenza di L-Cisteina ed è per questo che il gruppo funzionale N=C=S può oggi essere considerato come un potenziale H2S donor [Martelli et al., 2014].
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Capitolo 2
Scopo della ricerca
L’enorme disponibilità di dati riguardanti il ruolo biologico di H2S e i suoi possibili effetti inibitori sulla crescita tumorale ha rappresentato una solida base per lo sviluppo di numerosi H2S donors ed altrettanti ibridi farmacologici; inoltre, considerato che le proprietà di molti isotiocianati naturali sono simili e talvolta sovrapponibili a quelle esplicate dal solfuro di idrogeno, è stato ipotizzato che la loro azione su specifici sistemi biologici sia in gran parte da attribuire al probabile rilascio del gas stesso a livello tissutale. Per questi motivi, la valutazione di potenziali azioni antitumorali additive e non di derivati sintetici degli isotiocianati naturali ha rappresentato l’obiettivo principale del presente lavoro di tesi; in particolare, sono stati studiati gli effetti in vitro del composto di derivazione commerciale p-carbossifenilisotiocianato (p- COOHPhNCS) su cellule di adenocarcinoma pancreatico umano (AsPC-1).
In una prima fase, diverse concentrazioni di p-COOHPhNCS sono state testate su cellule AsPC-1 per studiarne l’effetto sulla vitalità identificando allo stesso tempo una concentrazione d’elezione che provocasse una significativa ma parziale riduzione della vitalità cellulare, così da poterla utilizzare nei successivi esperimenti di approfondimento farmacologico.
63 Le doti di p-COOHPhNCS quale H2S donor, precedentemente registrate in vitro [Martelli et al., 2013b], sono state poi investigate su cellula per verificare il rilascio di solfuro d’idrogeno anche sul substrato biologico d’interesse (AsPC-1).
Successivamente, concentrazioni crescenti di Gemcitabina (farmaco di riferimento nella terapia del tumore pancreatico) sono state testate su cellule AsPC-1 per identificare, anche in questo caso, una concentrazione tale da abbattere in modo consistente la proliferazione senza causare un’eccessiva citotossicità.
In seguito, è stata valutata l’azione antiproliferativa della co-somministrazione di concentrazioni scelte di Gemcitabina e p-COOHPhNCS dopo incubazione di 72 h, al fine di evidenziare un potenziale effetto additivo/sinergico tra le due molecole.
Un’ultima fase è stata dedicata invece all’analisi di p-COOHPhNCS e Gemcitabina sul ciclo cellulare, sia separatamente che in associazione, in modo tale da identificare eventuali azioni antiproliferative ciclo-specifiche.
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