Analisi del danno ossidativo a livello di membrana

Al microscopio, la maggior parte delle cellule è di grandi dimensioni e di forma rotondeggiante, risultato delle 48h di stimolazione. Utilizzando l’obiettivo 100X (obiettivo ad immersione) del microscopio a fluorescenza l’immagine della cellula appare bidimensionale. La sonda, intercalata in realtà nel doppio strato fosfolipidico della membrana plasmatica, sembra distribuirsi anche nel citoplasma, facedolo apparire verde in caso di stress ossidativo. Nel seguente pannello fotografico (Figura 11,12,13) sono visualizzate cellule al filtro per la fluoresceina che mostrano un citoplasma rosso (o arancio) a indicare una sonda lipidica non ossidata. Si deduce che le cellule in analisi non abbiano subito danni ossidativi alla membrana

Figura 11,12,13 Cellule osservate al microscopio a fluorescenza al filtro FITC: il citoplasma rosso indica che la sonda lipidica non è ossidata.

Nel successivo set di cellule (Figura 14,15,16), l’ossidazione della sonda lipidica cambia la colorazione del citoplasma da rosso a verde, dando una chiara indicazione di danno ossidativo dei lipidi di membrana.

Figura 14,15,16 Cellule osservate al microscopio a fluorescenza al filtro FITC: il citoplasma verde indica che la sonda lipidica è ossidata.

Inizialmente è stata condotta un’analisi multivariata che tiene conto dell’influenza di tutte variabili categoriche sulla variabile dipendente. Dai risultati, riportati nella Tabella 2 e in Figura 17, si rileva una differenza significativa relativamente alla percentuale di danno ossidativo (P<0.05) tra le medie dei gruppi i cui prelievi sono avvenuti alla nascita (13,64± 1,37) e un mese dopo la nascita (17,71±1,01). Risultano significative anche le differenze tra gruppi di neonati classificati come AGA, SGA ed il soggetto LGA. In particolare la significatività è determinata da confronti singoli tra l’unico soggetto LGA e gli individui SGA e AGA e assume un valore di p <0,001. Il confronto tra AGA e SGA non ha dato invece differenze significative tra le medie dei due gruppi. È da notare come nonostante non si raggiunga la significatività statistica per le differenze tra il gruppo dei nati a termine e quello dei nati pretermine si evidenzia una maggiore suscettibilità al danno ossidativo per i neonati pretermine ( 17,32±1,25) rispetto ai nati a termine (14,17±1,21)

Tabella 2 Nella tabella sono riportate le medie dei gruppi analizzati mediante analisi della varianza multifattoriale, che tiene conto dell’effetto delle variabili utilizzate nel nostro studio (Età Gestazionale, Campionamento, Sesso, Tempo di Gestazione) sulla variabile dipendente (% cellule ossidate)

n.s*= non significativo

*Gli asterischi denotano un valore di p<0,05

Figura 17 In questo grafico si possono osservare le differenze relative ai diversi gruppi analizzati per la percentuale di cellule ossidate

%Cellule ossidate

Età Gestazionale AGA 14,95± 0,89 0,0000 SGA 16,06± 1,72 LGA 36,1 Campionamento Prelievi effettuati alla nascita 13,64± 1,37 0,0145 Prelievi effettuati a un mese dalla nascita 17,71±1,01 Sesso Maschi 15,45±1,08 n.s.* Femmine 16,15±1,64 Tempo di Gestazione Pretermine 17,32±1,25 n.s.* Termine 14,17±1,21

Alla luce di questi risultati si è cercato di verificare l’eventuale variazione di danno ossidativo entro i gruppi analizzati (in particolare AGA, SGA, nati a termine) tra primo e secondo campionamento. È stata eseguita quindi un’analisi multivariata sul gruppo AGA corretta per tempo di gestazione e sesso (l’analisi tiene conto della possibile influenza nella variazione dei livelli del marcatore da parte di queste variabili). È stata rilevata una differenza significativa (p<0,05) per il danno ossidativo recepito dai nati AGA il cui prelievo è avvenuto un mese dopo la nascita (17,71±1,41) rispetto ai neonati AGA il cui prelievo è avvenuto alla nascita (12,50± 1,07). Non si sono osservate differenze significative per gli altri gruppi (Tabella 3 e Figura 18).

Tabella 3 Nella tabella sono riportate le medie dei gruppi analizzati mediante analisi della varianza multifattoriale, eseguita per il gruppo dei neonati AGA. L’analisi tiene conto dell’effetto delle variabili utilizzate nel nostro studio (Età Gestazionale, Campionamento, Sesso, Tempo di Gestazione) sulla variabile dipendente (% cellule ossidate).

*n.s.= non significativo

*Gli asterischi denotano un valore di p<0,05

Figura 18 In questo grafico si possono osservare le differenze per le variabili analizzate per il gruppo dei neonati Appropriate for Gestational Age (AGA) relativamente alla percentuale di cellule ossidate.

Neonati adatti per l’età gestazionale Normopeso (AGA) % Cellule Ossidate Medie± E.S P-value Campionamento Prelievi effettuati alla nascita 12,50± 1,07 0,0176 Prelievi effettuati a

un mese dalla nascita

17,71±1,41 Sesso Maschi 14,88±1,02 n.s.* Femmine 15,08±1,74 Tempo di Gestazione Pretermine 16,78±1,52 n.s.* Termine 13,32±0,86

Lo stesso tipo di analisi sono state ripetute per i neonati SGA (Tabella 4 e Figura 19) e per i neonati pretermine (Tabella 5 e Figura 20) anche se non si sono riscontrate differenze significative tra primo e secondo campionamento. I neonati SGA sembrano mostrare comunque un incremento nei livelli di ossidazione nel passaggio da un ambiente intrauterino (12,50± 1,07) a un ambiente extrauterino (17,71±1,41).

Tabella 4 Nella tabella sono riportate le medie dei gruppi analizzati mediante analisi della varianza multifattoriale, eseguita per il gruppo dei neonati Appropriate for Gestational Age (AGA). L’analisi tiene conto dell’effetto delle variabili utilizzate nel nostro studio (Campionamento, Sesso, Tempo di Gestazione) sulla variabile dipendente (% cellule ossidate).

*n.s.= non significativo

Figura 19 In questo grafico si possono osservare le differenze per le variabili analizzate il gruppo dei neonati Small for Gestational Age (SGA) relativamente alla percentuale di cellule ossidate

Neonati piccoli per l’età gestazionale Sottopeso (SGA)

% cellule ossidate Medie± E.S

P-value

Campionamento

Prelievi effettuati alla nascita

13,15± 2,50

n.s.* Prelievi effettuati a

un mese dalla nascita

17,72±2,16 Sesso Maschi 14,42±1,68 n.s.* Femmine 20,43±3,83 Tempo di Gestazione Pretermine 18,75±2,28 n.s.* Termine 12,84±1,91

Tabella 5 Nella tabella sono riportate le medie dei gruppi analizzati mediante analisi della varianza multifattoriale, eseguita per il gruppo dei neonati Pretermine (<37 settimane). L’analisi tiene conto dell’effetto delle variabili utilizzate nel nostro studio (Età Gestazionale, Campionamento, Sesso, Tempo di Gestazione) sulla variabile dipendente (% cellule ossidate).

*n.s.= non significativo

Figura 20 In questo grafico si possono osservare le differenze per le variabili analizzate per il gruppo dei neonati Pretermine (<37 settimane) relativamente alla percentuale di cellule ossidate

Neonati pretermine (<37 settimane) % Cellule Ossidate

Medie± E.S

P-value

Campionamento

Prelievi effettuati alla nascita

13,72± 3,28

n.s.* Prelievi effettuati a

un mese dalla nascita

18,37±1,26 Sesso Maschi 17,7±1,22 n.s.* Femmine 16,65±2,84 Età Gestazionale SGA 18,75±2,28 n.s.* AGA 16,78±1,25

È stata quindi eseguita un’analisi multivariata sul gruppo dei neonati a termine al fine di osservare differenze significative tra primo e secondo campionamento (Tabella 6 e Figura 21). Tale analisi è stata corretta attraverso le variabili età gestazionale e sesso. Risultano innanzitutto significative le differenze tra gruppi di neonati AGA, SGA e il soggetto LGA. In particolare la significatività è determinata dai confronti tra il neonato LGA e i neonati SGA e AGA con p <0,001. Il confronto tra AGA e SGA non ha dato invece differenze significative tra le medie dei due gruppi. Inoltre neonati a termine campionati un mese dopo la nascita mostrano differenze significative nella percentuale di cellule ossidate rispetto a neonati a termine campionati alla nascita.

Tabella 6 Nella tabella sono riportate le medie dei gruppi analizzati mediante analisi della varianza multifattoriale, eseguita per il gruppo dei neonati a Termine (>37 settimane). L’analisi tiene conto dell’effetto delle variabili utilizzate nel nostro studio (Campionamento, Sesso, Tempo di Gestazione) sulla variabile dipendente (% cellule ossidate).

*n.s= non significativo

Neonati a termine (>37 settimane) % Cellule Ossidate

Medie± E.S

P-value

Campionamento

Prelievi effettuati alla nascita

13,61± 1,54

0,0062

Prelievi effettuati a un mese dalla nascita

15,84±1,25

Sesso

Maschi 13,6±1,58

n.s.*

Femmine 15,57±1,54

Età Gestazionale AGA 13,32±0,86

0,0000

SGA 12,84±1,91

*Gli asterischi denotano un valore di p<0,05

Figura 21 In questo grafico si possono osservare le differenze per le variabili analizzate per il gruppo dei neonati a Termine (>37 settimane) relativamente alla percentuale di cellule ossidate

Dal momento che i marcatori da noi utilizzati sembrano mettere in evidenza aspetti diversi rispetto ai parametri normalmente utilizzati in ambito clinico per neonati della stessa età gestazionale, si è ricorso a un’analisi della regressione multipla tra i biomarcatori e i parametri utilizzati dai neonatologi per tale classificazione. Pertanto, questo tipo di analisi è stata usata per stimare un'eventuale relazione funzionale tra il danno ossidativo (variabili dipendenti) e i parametri registrati alla nascita come la lunghezza, il peso, la circonferenza cranica, i giorni di gestazione, lo z-score e il BMI virtuale precedentemente descritti (variabili indipendenti). Nella determinazione di una correlazione tra le diverse variabili si tiene comunque conto che i diversi soggetti dello studio sono classificati secondo età gestazionale, sesso, momenti diversi in cui è avvenuto il campionamento. È stato quindi possibile rilevare una relazione positiva tra peso e percentuale di cellule ossidate. Sebbene non si è riscontrato un p-value significativo i livelli del marcatore di danno ossidativo tendono ad aumentare all’aumentare del peso (p=0,0763) e diminuire all’aumentare dei giorni di gestazione (p=0,0938) e della lunghezza (p=0,1998) (Figure 22-24).

Figura 22 Correlazione tra la percentuale di cellule ossidate e il peso del neonato alla nascita

Figura 24 Correlazione tra la percentuale di cellule ossidate e il tempo di gestazione

Non è stata osservata alcuna correlazione con la circonferenza cranica e lo z-score, mentre è stata evidenziata una significativa correlazione fra il BMI virtuale e la percentuale di cellule ossidate (p=0,0387): all’aumentare del BMI aumenta anche il danno ossidativo alla membrana (Figura 25)

4.2 Analisi in fluorescenza del danno genomico mediante conta dei